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1、*基金项目：美国纽约中华医学基金会资助 （C M B） 作者单位：1 .中山大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室， 广 州5 1 0 0 8 0；2 .广东省农业科学院生物技术研究所， 广 州5 1 0 6 1 0；3 .广东省人民医院中心实验室 作者简介：张瑞芬 （1 9 7 6-） ， 女， 山东滨州人， 硕士， 主要从事功能 食品及临床营养品的研制开发工作。 文章编号：1 0 0 1 - 0 5 8 0（2 0 0 5） 1 2 - 1 4 6 6 - 0 2 中图分类号：R5 4 3 . 5 0 2文献标识码：A【实验研究】 慢性轻度高同型半胱氨酸血症对大鼠N O影响* 张瑞芬1 ，
2、 2， 凌文华1， 马静1， 陈铁峰3 摘要：目的观察蛋氨酸强化或叶酸缺乏膳食诱导的慢性高同型半胱氨酸血症 （H H c y） 大鼠体内一氧化氮 （N O） 的生成和代谢转化情况， 从而探讨同型半胱氨酸 （H c y） 致动脉粥样硬化 （A S） 中N O的可能作用。方法 3 6只 S D大鼠， 按体重随机分为3组； 对照组、 高蛋氨酸组和叶酸缺乏组， 分别饲以美国营养学会1 9 9 3年公布的生长期啮齿 类动物纯化配方饲料 （A I N- 9 3G饲料） 及强化1 %L-蛋氨酸或不含叶酸的A I N-9 3G饲料。1 4周后测定血浆总 H c y， 血清N O、 丙二醛 （M D A） 等含
3、量， 主动脉一氧化氮合酶 （N O S ） 活性及主动脉硝基化酪氨酸 （N T） 含量。结果高 蛋氨酸和叶酸缺乏膳食均可升高血浆H c y水平， 各组的N O含量及N O S活性差异无统计学意义， 但2个H H c y实验组 的M D A含量和主动脉N T表达量均高于对照组。结论膳食诱导的慢性H H c y大鼠体内N O总量及主动脉N O S活 性并没有变化； 氧化应激生成过氧化亚硝基阴离子 （O N O O-） 等反应使N O的生物可用性降低。 关键词： 同型半胱氨酸； 动脉粥样硬化； 一氧化氮； 氧化应激 E f f e c t s o f c h r o n i cL i l dh y
4、p e r h o L o c y s t e i n e L i ao nn i t r i c o x i d e i nr a t sZ H A N GR u i f e n，L I N GW e n h u a，M AJ i n g，e t a l. D e p a r t m e n t o fC l i n i c a lN u t r i t i o n，S u nY a t-S e nU n i v e r s i t y （G u a n g z h o u5 1 0 0 8 0， C h i n a） A b s t r a c t：O b j e c t i v e T
5、h e i n f l u e n c e o f e x p e r i m e n t a l c h r o n i cm i l dh y p e r h o m o c y s t e i n e m i a（H H c y）i n d u c e db yd i e t s s u p - p l e m e n t e dw i t hm e t h i o n e o r d e f i c i e n t i n f o l i c a c i d o n t h e f o r m a t i o n a n dm e t a b o l i s mo f n i t r
6、i c o x i d e （N O） i nw a s i n v e s t i g a t e d i n r a t s . M e t h o d s S Dr a t sw e r e r a n d o m l yd i v i d e d i n t o 3g r o u p s o f 1 2，w h i c hw e r e c o n t r o l g r o u p，h i g hm e t h i o n e g r o u pa n d f o l i c a c i dd e f i c i e n t g r o u p . A f t e r 1 4w e
7、e k s，t h e l e v e l s o f p l a s m a t o t a l h o m o c y s t e i n e （H c y） ， t h e c o n t e n t s o fN Oa n dm a l o n y l d i a l d e h y d e （M D A） i n s e r u m，t h e a c t i v i t yo f a o r t i cn i t r i c o x i d e s y n t h a s e （N O S） a n d t h e e x p r e s s i o no f n i t r o
8、t y r o s i n e （N T） i na o r t aw e r ed e - t e r m i n e d . R e s u l t s H H c yw a s i n d u c e d s u c c e s s f u l l yb yd i e t s s u p p l e m e n t e dw i t hm e t h i o n e o r d e f i c i e n t i n f o l i c a c i d . T h e r ew e r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i
9、 n t h e l e v e l s o f s e r u mN Oa n d t h e a c t i v i t yo f a r o t i cN O Sa m o n g t h e g r o u p s . T h e c o n t e n t s o f s e r u m M D Aa n da o r t i cN Ti n2h y p e r h o m o c y s t e i n e m i c g r o u p r a t sw e r e s i g n i f i c a n t l yh i g h e r t h a n t h o s e o
10、f t h e c o n t r o l g r o u p . C o n c l u - s i o n O x i d a t i v e i n a c t i v a t i o no fN Ot op r o d u c e p e r o x y n i t r i t e d e c r e a s e d t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t yo fN Oi nc h r o n i cm i l dh y p e r h o - m o c y s t e i n e m i c r a t s i n d u c e db y
11、d i e t s b u t i t s p r o d u c t i o nw a s n o t a f f e c t e d . K e yw o r d s：h o m o c y s t e i n e；a t h e r o s c l e r o s i s；n i t r i c o x i d e （N O） ； o x i d a t i v e s t r e s s 血浆同型半胱氨酸 （H o m o c y s t e i n e， H c y） 水平慢性升高所 致的高同型半胱氨酸血症 （H y p e r h o m o c y s t e i n e m i
12、 a， H H c y） 是动 脉粥样硬化 （A t h e r o s c l e r o s i s，A S） 的一个新的、 独立危险因 素 1 ， 其致病机制目前尚不清楚。研究发现， H c y可以降低一 氧化氮 （N O） 的生物可用性， 引起内皮依赖性血管扩张功能障 碍 2 。在对传统的A S危险因子 （如高脂血症） 的研究中已经 发现， N O生物可用性降低与过多的超氧阴离子 （O2-） 同N O 反应生成过氧化亚硝基阴离子 （O N O O） 有关， 而不仅仅是生 成减少 3 。本实验通过膳食诱导的慢性H c y的动物模型观 察大鼠体内N O的生成及代谢转化情况， 从合成和消耗2
13、个 方面了解H c y对N O的影响， 为H c y引起心血管损伤机制研 究提供资料。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物及分组清洁级雄性S D大鼠3 6只， 4周龄， 体重 （8 0 + 1 2 . 5） g， 由中山大学实验动物中心提供。普通饲料 饲养1周适应环境后， 按体重随机分为正常对照组， 高蛋氨酸 组和叶酸缺乏组3组， 每组1 2只。对照组给予美国营养学会 1 9 9 3年公布的生长期啮齿类动物纯化配方饲料 （A I N-9 3G 配方饲料） 4 ， 高蛋氨酸组是在对照组饲料中按1 0g k g 增加 L -蛋氨酸， 叶酸缺乏组用不含十酸的维生素混合物代替对 照组饲料中的A I
14、N-9 3G维生素混合物。为严格控制叶酸 的摄入量， 3组动物饲料中的酪蛋白均选用不含维生素的酪 蛋白代替普通酪蛋白。其中不含维生素酪蛋白、 A I N-9 3G 维生素混合物， A I N-9 3G维生素混合物及不含叶酸的维生 素混合物由美国H a r l a n公司提供。 实验期间， 动物用悬挂的不锈钢笼单笼饲养， 自由摄食饮 水， 室内温度保持在 （2 4 + 2）。实验1 4周后， 禁食8h后乙 醚麻醉大鼠， 尾静脉采血分离血浆用于H c y水平的测定， 股 动脉采血用于分离血清。然后， 颈椎脱臼法处死全部动物， 小 心分离主动脉， 剪取3 4m m胸主动脉置入1 0 %中性福尔马 林
15、溶液中固定过夜， 制作石蜡切片用于免疫组化分析； 其余部 分- 8 0保存备用。 1 . 2 高效液相色谱法测定血浆总H c y水平血浆总H c y测 定在广东省人民医院完成。测定方法参照U e l a n d等 5略有 改动： 取1 0 0 l血浆加入1 0l 1 0 %（v v） 三-N-丁基膦二甲 基甲酰胺溶液 （S i g m a公司） ， 冰水孵育3 0m i n。再加入1 0 0 l 高氯酸溶液， 混合后冰水孵育1 0m i n。40 0 0g， 4离心1 0 m i n去除蛋白， 吸取3 0l上清至一干净微量离心管中， 加入 1 5l 0 . 5m m o l LN a O H和
16、1 gL的T-F l u o r o - 2 - o x a - 1， 3 -d i a z d e - 4 - s u l p h o n a t e （美国S B D-F） 荧光衍生液3 0 l （S i g - m a公司） ， 充分混匀，6 0水浴6 0m i n， 冰上静置片刻以终止 反应， 取1 0 l进样。利用H P 1 0 5 0L C高效液相色谱仪附带 的分析软件测定峰面积， 以H c y（美国S i g m a公司） 作为外标， 根据标准曲线计算得到样品中总H c y的浓度。色谱条件： 流 速1m lm i n， 柱温： 2 5， 柱压：3 0k g c m 2， 荧光检测
17、激发波长 3 8 5 n m， 吸收波长5 1 5 n m。 6641 中国公共卫生2 0 0 5年1 2月第2 1卷第1 2期 C h i nJP u b l i cH e a l t hD e c 2 0 0 5V o l.2 1N o.1 2 1 . 3 血清叶酸含量测定血清叶酸含量测定在中山大学放 免技术中心完成， 叶酸放免试剂盒购自北京海军放免技术中 心， 参照试剂盒说明书步骤操作。 1 . 4 主动脉一氧化氮合酶 （N O S） 测定取大鼠主动脉按1 : 1 0 （wv） 加入一定量的匀浆介质匀浆后， 4，4 0 0 0g离心1 5 m i n， 取上清-2 0保存备用。B r a
18、 d f o r d法测定蛋白含量。 N O S活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所， 上清液 中酶活性的测定按照试剂盒说明书测定。 1 . 5 血清N O、 丙二醛 （M D A） 含量测定 N O测定试剂盒和 M D A测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所， 测定方法 参照试剂盒说明书。 1 . 6 免疫组织化学检测大鼠主动脉壁N T含量为了解各 实验组大鼠体内O N O O-的生成情况， 我们用免疫组化法测 定了主动脉中N T的表达。小鼠抗N T单克隆抗体由美国 C a y m a n公司提供， 各主动脉切片中N T含量用全自动图像分 析系统 （K o n t r o n I B
19、A 2 . 5， G e r m a n y） 根据显色部分的面积和灰 度进行半定量分析。 1 . 7 统计分析采用S P S S 1 0 . 0软件建立数据库， 用单因素 方差分析 （o n e -w a yA N O V A） 进行统计分析； 各组间的两两 比较采用最小有意义差义检验 （L S D） 法。 2 结果 2 . 1 各实验组大鼠血浆H c y和血清叶酸水平 （表1） 从表1 可见， 叶酸缺乏组因饲料中缺乏叶酸其血清叶酸水平显著性 低于对照组和高蛋氨酸组 （P0 . 0 5） 。进食强化1 %蛋氨酸 的饲料或叶酸缺乏饲料与普通饲料相比较， 大鼠血浆总H c y 水平显著性增高 （
20、P0 . 0 5） ， 膳食中缺乏叶酸或蛋氨酸摄入 过多都会诱导H c y的发生。 表1不同实验组大鼠实验期末血浆 H c y 、 血清叶酸和M D A 水平的比较 （n= 1 2， xs） 组别 血浆 H c y （m o lL） 血清叶酸 （ n g m l） 血清 M D A （m m o lL） N T相对含量 正常对照组 5 . 1 +2 . 5 a 1 1 . 4 3 +1 . 5 3 a 3 . 9 2 +0 . 4 4 a 1 . 9 4 1 6 +0 . 6 1 9 4 a 高蛋氨酸组 9 . 2 +2 . 6 b 1 0 . 9 1 +1 . 7 0 a 4 . 3 2 +
21、0 . 6 5 b 4 . 6 7 6 6 +0 . 9 1 8 3 b 叶酸缺乏组 1 3 . 0 +6 . 6 c 4 . 9 5 +0 . 6 7 b 4 . 7 3 +0 . 4 3 b 4 . 2 8 2 5 +0 . 6 6 7 9 b 注： 数字旁边字母不同时， 表示组间差异有统计学意义， P 0 . 0 5 2 . 2 不同实验组大鼠血清N O含量及主动脉N O S活性结 果表明， N O含量及N O S活性在各组间差异无统计学意义。 说明H c y水平升高并没有改变机体内N O S的活性， 因此， N O 的生成量不受H c y的影响而显著性变化。 2 . 3 免疫组化测定主
22、动脉N T含量 O N O O -能够促进蛋白 质等的酪氨酸残基硝基化生成稳定的代谢产物N T， 后者的 含量在一定程度上可以反应体内O N O O-的生成量 6 。图像 分析结果显示， 对照组显著低于其它2个实验组 （P0 . 0 5） ， 阴性对照组显示没有非特异性染色的证据。在N T生成增多 的高蛋氨酸组和叶酸缺乏组， 其分布主要集中在中膜平滑肌 细胞内， 对照组只有少量表达。 2 . 4 血清M D A含量为确定在H c y时体内O N O O-生成增 多可能的机制， 测定了各实验组大鼠血清中过氧化脂质的降 解产物M D A含量。高蛋氨酸组和叶酸缺乏组M D A含量均 显著高于对照组
23、（P 0 . 0 5） 。 3 讨论 本实验发现， 慢性轻度H c y引起N O生物活性减低是由 O - 2 生成增多， 进而过量消耗N O产生O N O O-造成的。H H c y 大鼠体内N O总体水平和主动脉N O S活性的检测结果显示， N O的生成并未减少， 提示H c y时体内有过多的N O在发挥 其内皮扩张因子等生物活性之前就被消耗掉了。 研究显示， 使用抗氧化剂如V C或自由基清除酶类 （如超 氧化物歧化酶） 可成功地减轻H c y的内皮细胞毒性 7 ， 也说 明H c y会增加自由基的产生。本实验测得2个H c y组的 M D A水平显著性高于对照组， 进一步确证H c y大
24、鼠体内氧 自由基生成增多。这些自由基的来源目前尚不清楚， 可能是 H c y通过其巯基自身氧化生成H 2O2、O - 2 等 8 ， 亦或H c y打破 了内皮细胞中内皮型N O S合成N O和O- 2 之间的平衡， 使得 后者的生成增多所致 9 ； 不排除具有抗氧化作用的维生素叶 酸缺乏直接造成的氧化损伤。N T检测结果表明， 2个H c y组 大鼠体内O N O O-生成增加， 进一步证实H c y的促氧化应激 效应。O N O O-的生成除了消耗N O使之不能发挥其扩血管 等生物活性之外， 它本身也能对细胞和多种生物大分子造成 损伤和破坏。如氧化修饰低密度脂蛋白， 使之更容易被巨噬 细胞
25、吞噬形成泡沫细胞 1 0 ； 引起脂质过氧化； 诱发或促进许 多致炎因子介导的核因子的活化， 增加炎性因子表达 1 1 。这 些都将促进A S的发生、 发展。 综上所述， 慢性H c y时， N O因氧化失活不能发挥其扩血 管、 抗粘附等维持血管内稳态的作用， 再加上O N O O-的致炎、 促氧化等损伤性作用可能是H c y引起A S的一条重要途径。 参考文献 1 B o u s h e yC J，B e r e s f o r dS A，O m e n nG S，e ta l . Aq u a n t i t a t i v ea s s e s s - m e n t o fp l a
26、s m ah o m o c y s t e i n ea sar i s kf a c t o rf o rv a s c u l a rd i s e a s e . P r o b a b l e b e n e f i t s o f i n c r e a s i n gf o l i ca c i di n t a k e s J. J AMA， 1 9 9 5， 2 7 4：1 0 4 9 - 1 0 5 7 . 2C h a m b e r sJ C，O b e i dO A，K o o n e rJ S . P h y s i o l o g i c a l i n c r
27、e m e n t si n p l a s m ah o m o c y s t e i n e i n d u c ev a s c u l a r e n d o t h e l i a l d y s f u n c t i o n i nn o r - m a l h u m a ns u b j e c t s J. A r t e r i o s c l e rT h r o m bV a s cB i o l， 1 9 9 9，1 9： 2 9 2 2 - 2 9 2 7 . 3 O n o d yA，C s o n k aC，G i r i c zZ，e ta l . H y
28、 p e r l i p i d e m i ai n d u c e db ya c h o l e s t e r o l -r i c hd i e t l e a d st oe n h a n c e dp e r o x y n i t r i t ef o r m a t i o ni n r a t h e a r t s J. C a r d i o v a s cR e s， 2 0 0 3，5 8：6 6 3 - 6 7 0 . 4 R e e v e sP G，R o s s o wK L，L i n d l a u f J . D e v e l o p m e n
29、t a n dt e s t i n go f t h e A I N- 9 3p u r i f i e dd i e t s f o r r o d e n t s：r e s u l t s o ng r o w t h，k i d n e y c a l c i f i - c a t i o na n db o n em i n e r a l i z a t i o ni nr a t sa n dm i c e J. JN u t r， 1 9 9 3， 1 2 3：1 9 2 3 - 1 9 3 1 . 5 U e l a n dP M，R e f s u mH，S t a b
30、 l e r S P，e t a l . T o t a l h o m o c y s t e i n e i np l a s - m a o r s e r u m：m e t h o d s a n d c l i n i c a l a p p l i c a t i o n s J. C l i nC h e n， 1 9 9 3， 3 9：1 7 6 4 - 1 7 7 9 . 6 B e c k m a nJ S，K o p p e n o lWH. N i t r i co x i d e，s u p e r o x i d e，a n dp e r o x y n i -
31、t r i t e：t h eg o o d，t h eb a d，a n du g l y J. A mJP h y s i o l，1 9 9 6，2 7 1： C 1 4 2 4 - 1 4 3 7 . 7 C h a m b e r s J C，M c G r e g o rA，J e a n-M a r i eJ，e ta l . D e m o n s t r a t i o no f r a p i d o n s e t v a s c u l a r e n d o t h e l i a l d y s f u n c t i o n a f t e r h y p e r
32、 h o n o - c y s t e i n e m i a：a ne f f e c t r e v e r s i b l ew i t hv i t a m i nCt h e r a p y J. C i r c u l a - t i o n，1 9 9 9，9 9：1 1 5 6 - 1 1 6 0 . 8 L a n gD，K r e d a nM B，M o a tS J，e t a l . H o n o c y s t e i n e - i n d u c e d i n h i b i - t i o no fe n d o t h e l i u m-d e p
33、e n d e n tr e l a x a t i o ni nr a b b i ta o r t a：r o l ef o r s u p e r o x i d e a n i o n s J. A r t e r i o s c l e rT h r o m bV a s cB i o l， 2 0 0 0，2 0：4 2 2 - 4 2 7 . 9 L iN，Y iF X，R u t eE，e t a l . E f f e c t so fh o m o c y s t e i n eo n i n t r a c e l l u l a r n i t r i c o x i
34、d ea n ds u p e r o x i d e l e v e l s i nt h er e n a l a r t e r i a l e n d o t h e l i u m J. A mJP h y s i o lH e a r tC i r cP h y s i o l， 2 0 0 2，2 8 3：H 1 2 3 7 - 1 2 4 3 . 1 0 Y a m a g u c h iY，M a t s u n oS，K a g o t aS，e t a l . P e r o x y n i t r i t e -m e d i a t e d o x i d a t i
35、 v em o d i f i c a t i o no f l o w-d e n s i t yl i p o p r o t e i nb ya q u e o u se x - t r a c t s o f c i g a r e t t e s m o k e a n d t h ep r e v e n t i v e e f f e c t o f f l u v a s t a t i n J. A t h e r o s c l e r o s i s，2 0 0 4，1 7 2：2 5 9 - 2 6 5 . 1 1 M a t a t aB M，G a l i n a
36、n e s . P e r o x y n i t r i t e i s a n e s s e n t i a l c o m p o n e n t o f c y - t o k i n e s p r o d u c t i o nm e c h a n i s mi nh u m a nm o n o c y t e s t h r o u g hm o d u l a - t i o n o fn u c l e a rf a c t o r-k a p p aBD N Ab i n d i n ga c t i v i t y J. JB i o l C h e m，2 0 0 2，2 7 7：2 3 3 0 - 2 3 3 5 . 收稿日期： 2 0 0 5 - 0 3 - 1 4 （文涛编辑张亚莲校对） 7641 中国公共卫生2 0 0 5年1 2月第2 1卷第1 2期 C h i nJP u b l i cH e a l t hD e c 2 0 0 5V o l.2 1N o.1 2