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1、噻嗪类利尿剂对自发性高血压大鼠内皮型 一氧化氮合酶和内皮素-1 表达影响的研究 何 燕， 严江涛， 涂荣会， 汪培华， 汪道文 （华中科技大学同济医学院附属同济医院心内科， 湖北 武汉 430030） 收稿日期： 2006 -01 -03， 修回日期： 2006 -02 -15 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 39870307） 作者单位： 何 燕 （1969 - ） ， 女， 硕士生， 主治医师， 研究方向： 心血 管病学， Tel： 0771-5356307； 汪道文 （1957 - ） ， 男， 博士， 教授， 主任医师， 博士生导师， 研究方向： 分子心脏病学， 通讯作者
2、， Tel： 027-83662827， E- mail： dwwang tjh. tjmu. edu. cn 中国图书分类号： R-332； R 341. 6； R 345. 44； R 349. 21； R 394. 2； R 544. 102. 2； R 977. 3； R 977. 6 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 05 -0552 -04 摘要： 目的 研究噻嗪类利尿剂治疗自发性高血压大鼠时对 其内皮型一氧化氮合酶和内皮素-1 表达的影响， 从而探讨其 降压的可能分子机制。方法 15 只自发性高血压大鼠随机 分为3 组， 分别经胃管给予氢氯噻嗪 （
3、HCTZ， 10 mgkg -1 d -1） 、 吲哒帕胺 （IND， 0. 625 mgkg-1d-1） 和等量去离子 水。每周测血压 1 次， 4 wk 后处死动物， 分别用 RT-PCR 和 Western Blot 法检测组织中内皮素-1 和内皮型一氧化氮合酶 mRNA 和蛋白质的表达。结果 氢氯噻嗪和吲哒帕胺用药 1 wk 后 SHR 的血压降低， 2wk 时降压幅度达到显著水平 （P 0. 05） 。同时两种利尿剂均可在蛋白质水平上调内皮型一 氧化氮合酶的表达， 在 mRNA 水平下调内皮素-1 的表达。 结论 噻嗪类利尿剂可能通过上调内皮型一氧化氮合酶及 下调内皮素-1 而起到调
4、节血压与改善血管内皮功能作用。 关键 词： 氢 氯 噻 嗪； 吲 哒 帕 胺； 内 皮 型 一 氧 化 氮 合 酶； 内皮素-1 噻嗪类利尿剂已经成为应用于治疗高血压病的 最广泛的降压药物之一 1， 然而其降低血压的具体 机制还不明确。利尿剂可以通过其在肾脏的利钠排 水机制起到降低血压的作用， 然而在长期使用时， 利 尿剂的血管舒张作用似乎起着更重要的地位 2 4。 内皮来源的血管活性物质在血压调节中起着重要的 作用， 其中一氧化氮 （NO） 和内皮素-1 （ET-1） 在血压 调节中的作用已经得到人们的共识。国外有研究显 示 5， 利尿剂的降压作用与内皮一氧化氮合酶 （eNOS） 基因多态性
5、密切相关。我们以前也报道 6 噻嗪类利尿剂可以明显上调具有扩张血管和利尿作 用的花生四烯酸细胞色素 P450 表氧化酶基因并下 调血管紧张素 II1 型受体 （AT1） 基因表达。由此可 见， 噻嗪类利尿剂可能是通过影响调节血管活性基 因的表达来调节血压。因此本文在我们原来研究的 基础上， 进一步研究了给予自发性高血压大鼠 （SHR） 氢氯噻嗪 （HCTZ） 与吲哒帕胺 （IND） 降压治 疗后其组织中 eNOS 与 ET-1 表达的变化， 以探讨利 尿剂通过调节内皮细胞基因表达降低血压的机制及 其内皮保护功能。 1 材料与方法 1. 1 实验材料 SHR 购自上海高血压研究所， 氢 氯噻嗪
6、（山东省营南制药厂， 国药准字 H37020788） 与吲哒帕胺 （法国施维雅厂， 进口药品注册证编号： X19990432） 均系市售药品。RT-PCR 试剂盒购于 TaKaRa 公司 （含有 AMV 转录酶， 10 Buffer， RNase 抑制剂， MgCl2， dNTPs） ， RNA 提取试剂 TRIzol 为 Gibco BRL 公司产品， 牛血清白蛋白 （BSA） 购于 Sig- ma 公 司， 抗 eNOS 抗 体 购 自 Gentest Corporation （USA） ， 辣根过氧化物酶羊抗兔 IgG 抗体购自 Jack- son 公司 （Jack Immuno Res
7、earch Lab） ， Western 杂交 显影用增强化学发光试剂 ECL， 购自美国 PIERCE 公司， 预染蛋白质分子量标准购自 Bio-Rad 公司， 蛋 白杂交膜 （PVDF） 膜购自德国 Schleicher and Schuell 公司。其余试剂为国产分析纯试剂。 2 方法 2. 1 动物实验 将 15 只 SHR 大鼠随机分为 3 组， 分别经灌胃针每日给予氢氯噻嗪 （10 mgkg -1） 、 吲哒帕胺 （0. 625 mgkg -1） 和等体积去离子水。每 周用大鼠电脑血压心率仪连续测定大鼠尾动脉血压 5 次， 以每次血压相差不超过 5 mmHg （1 mmHg = 0
8、. 133 kPa） 为准， 血压取 5 次测定的平均值。4wk 后处死大鼠， 并取心、 肝、 肾、 血管等组织 -80冰箱 保存备用。使用 Trizol 试剂提取各组织的总 mRNA 和总蛋白质， 分别用紫外分光光度计和 Brad-ford 方 法测定其浓度。 2. 2 逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 检测大鼠组 织 ET-1 mRNA 表达 根据从 Genebank 调出 ET- 1mRNA 序列， 设计特异性引物： 上游引物 5-tcc cgt gat cttctc tct gc -3， 下游引物5-ggc tct gta gtc aat gtg ctg-3， 以扩增 ET-1 的
9、 600 bp 条带。取总 mRNA 2g 逆转录成 cDNA， 然后进行 PCR 扩增， 扩增产物 255中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） ： 552 5 经 1. 2% 琼脂糖凝胶电泳， 通过 IBAS 图像处理系 统， 以 ET-1 与内参照 -actin 扩增条带的吸光面积 积分比值来评定 ET-1 的 mRNA 表达水平。 2. 3 Western blot 法检测 eNOS 蛋白表达 大鼠 组织蛋白质经 SDS-PAGE 凝胶电泳分离后， 采用电 印迹转移法将蛋白质转至 PVDF 膜上， 用含 5%
10、脱 脂奶粉的 TBS-T 溶液室温封闭 2 h 后， 分别加入兔 抗 eNOS 多克隆抗体和 -actin 抗体， 4孵育过夜， 室温下 TBS-T 溶液洗膜后加入辣根过氧化物酶偶联 羊抗兔抗体孵育 3 h， 用 TBS-T 溶液洗膜后与 ECL 试剂反应， 胶片暴光， 以 IBAS 图像处理系统对胶片 进行扫描， 以 eNOS 与 -actin 条带的吸光面积积分 比值来评定的 eNOS 蛋白质的表达水平。 2. 4 统计方法 结果以-x s 表示， 组间比较采用 ANOVA 检验。 3 结果 3.1 利尿剂对 SHR 血压的影响 在给予 HCTZ 或 IND 治疗后第 1 周大鼠血压开始下
11、降， 2 wk 后下降 差异有显著性 （P 0. 05） ， 用药 4 wk 后血压下降达 13 mmHg （1 mmHg =0. 133 kPa，Fig 1） 。 Fig 1 The effects of thiazide diuretics on decreasing blood pressure of SHRs 3. 2 利尿剂对大鼠 ET-1 的 mRNA 表达的影响 本研究采用 RT-PCR 方法检测了利尿剂对大鼠 ET-1 的 mRNA 表达的影响， 结果显示在给予 HCTZ 或 IND 干预后大鼠血管中 ET-1 的 mRNA 水平较对照 组下调（P 0. 05， Fig 2）
12、。 3. 3 利尿剂对大鼠 eNOS 蛋白表达的影响 West- ern blot 结果显示： 在给予 HCTZ 或 IND 干预后大鼠 的肾脏、 血管等组织 eNOS 蛋白表达增加 （P 0. 05， Fig 3） 。 4 讨论 本研究对自发性高血压大鼠给予氢氯噻嗪或吲 哒帕胺可以降低其血压， 并明显上调内皮一氧化氮 Fig 2 The effects of thiazide diuretics on the expression of ET-1 mRNA Fig A is the result of RT-PCR， which shows both HCTZ and IND de- cre
13、ase the expression of ET-1 mRNA， The result of RT-PCR is analyzed by IBAS as showed in Fig B. *P 0. 05 vs control Fig 3 The effects of thiazide diuretics on the protein expression of eNOS Fig A is the result of western blot， which shows both HCTZ and IND decrease the protein expression of eNOS. The
14、results of Western blot is analyzed by IBAS as showed in Fig B. *P 0. 05 vs control 合酶的表达， 同时下调 ET-1 的表达， 而这两者在血 压调节和内皮功能调节中起着重要的作用。因而提 355中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） 示， 噻嗪类利尿剂可以通过影响内皮来源血管活性 物质调节血压， 同时改善血管内皮功能。 噻嗪类利尿剂作为治疗高血压的一线药物， 其 作用机制尚未完全明确。本研究室过去的研究显 示， 自发性高血压大鼠在给予噻
15、嗪类利尿剂治疗后， 其体内主要脏器组织的花生四烯酸细胞色素 P450 表氧化酶基因表达明显上调， 同时其血管紧张素1 型受体基因的表达下调 6。花生四烯酸细胞色素 P450 表氧化酶代谢花生四烯酸生成表氧化廿烷酸 （又称为内皮源性超极化因子） ， 后者可以开放钙离 子激活的钾通道， 导致血管平滑肌超极化， 血管舒 张， 血压下降 7。另一方面， 血管紧张素1 型受体 参与了血管紧张素的收缩血管作用。因此提示噻 嗪类利尿剂可能通过调节影响血压的物质基因的表 达来降低血压。 血管内皮功能在心血管系统中起着重要的作 用， 内皮来源血管活性物质参与了血压的调节， 其中 NO 和 ET-1 是两个代表性
16、的物质， 因而本研究探讨 了噻嗪类利尿剂对它们的影响。NO 是体内最主要 的舒血管物质， 在内皮细胞经 eNOS 代谢 L-精氨酸 生成 NO， eNOS 的上调可以增加 NO 产生进而引起 血管舒张， 血压下降 8。研究发现 SHR 中 eNOS 活 性降低 9， 而将 eNOS 基因导入 SHR 使其在体内高 表达可起到明显降压效应 10。Turner 等5等研究 了原发性高血压患者的 eNOS 基因多态性和氢氯噻 嗪降压效果的关系， 发现 eNOS 多态性对氢氯噻嗪 降低舒张压的作用相关， 这也提示 NO 在噻嗪类利 尿剂的降压效应中起着重要作用。另一方面， 内皮 素是由内皮细胞产生的迄
17、今所知体内最强的缩血管 物质， 在高血压的发生发展过程起着重要作用 11。 研究发现 SHR 与卒中倾向的 SHR 中内皮素水平较 正常高 12， 13。临床与动物实验证实给予内皮素拮 抗剂或减少内皮素均可降低血压 14， 15， 而本研究发 现经过噻嗪类利尿剂治疗后， SHR 组织中的 ET-1 表达降低， 从而提示噻嗪类利尿剂可能通过降低缩 血管物质水平而降低血压。 总之， 噻嗪类利尿剂可能通过调节影响血管张 力和对肾脏利钠作用的基因的表达水平， 尤其是调 节与血管内皮来源的基因的表达来降低血压。 参考文献： 1 Chobanian A V，Bakris G L，Black H B，et
18、al. The seventh re- port of the joint national committee on prevention，detection，eval- uation，and treatment of high blood pressure J . JAMA， 2003， 289： 2560 -73. 2 Conway J，Lauwers P. The hemodynamic and hypotensive effects of long-term therapy with chlorothiazide J . Circulation， 1960， 21： 21 -7. 3
19、 Van Brummelen P，Man int Veld A J，Schalekamp M A. Hemo- dynamic changes during long-term thiazide treatment of essential hypertension in responders and nonresponders J . Clin Pharmacol Ther， 1980， 279： 328 -36. 4 Vardan S，Mookherjee S，Warner R，et al. Systolic hypertension in the elderly：hemodynamic
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21、J . Am J Hypertens， 2003， 16 （10） ： 834 -9. 6 涂容会， 严江涛， 赵春霞，等. 利尿剂对高血压大鼠细胞色素 P450 表氧化酶及血管紧张素 1 型受体基因表达的影响. 中 华心血管病杂志， 2004， 4： 308 -12. 7 Campbell W B，Harder D R. Prologue：EDHF-what is it J ？Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2001， 280： 2413 -6. 8 De Gennaro Colonna V，Rossoni G，Rigamonti A， et al. Ena
22、lapril and quinapril improve endothelial vasodilator function and aortic eNOS gene expression in L-NAME-treated rats J . Eur J Pharma- col， 2002， 450： 61 -6. 9 Newaz M A，Yousefipour Z，Nawal N， et al. Nitric oxide synthase activity in blood vessels of spontaneously hypertensive rats：antiox- idant pro
23、tection by gamma-tocotrienol J . J Physiol Pharmacol， 2003， 54： 319 -27. 10Hirooka Y，Sakai K，Kishi T， et al. Enhanced depressor response to endothelial nitric oxide synthase gene transfer into the nucleus tractus solitarii of spontaneously hypertensive rats J . Hypertens Res， 2003， 26： 325 -31. 11 F
24、erro C J，Webb D J. Endothelial dysfunction and hypertension J . Drugs， 1997， 53： 30 -41. 12吴 强， 曾祖荫. 卡托普利对自发性高血压大鼠的微血管稀少 及内皮功能障碍的影响 J . 微循环杂志， 1998， 8： 6 -8. 13Touyz R M，Schiffrin E L. Role of endothelin in human hyperten- sion J . Can J Physiol Pharmacol， 2003， 81： 533 -41. 14Ergul A. Endothelin-1
25、and endothelin receptor antagonists as po- tential cardiovascular therapeutic agents J . Pharmacotherapy， 2002， 22： 54 -65. Effects of thiazide diuretics on the gene expression of endothelial nitric oxide synthase and endothelin-1 in the spontaneous hypertensive rats HE Yan，YAN Jiang-tao，TU Rong-hui
26、，WANG Pei-hua，WANG Dao-wen （hypertendion Institution and Department of Internal Medical，Tongji Hospital，Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China） Abstract： Aim To investigate the effects of thiazidediuretics on the gene expression of endothelial nitric
27、 455中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） oxide synthase（eNOS）and endothelin（ET-1）in the spontaneous hypertensive rats（SHRs） ，and to clarify molecular mechanisms of antihypertrension of thiazide diuretics. Method Fiveteen SHRs were divided ran- domly into 3 groups and administere
28、d orally once a day with HCTZ（10 mgkg -1） ，indapamide（0. 62 5mg kg -1 ） and vehicle，respectively.Systolic blood pressure was observed weekly.After 4 weeks，the SHRs were sacrificed，and the levels of gene expres- sion of eNOS and ET-1 were detected in tissures of SHRs. Results Both hydrochlorothiazide
29、 and indapam- idecan reduced significantly blood pressure of SHRs， and also，up-regulated the expression of eNOS at pro- tein level as well as down-regulate the expression of ET-1 at mRNA level. Conclusion Thiazide diuretics can reduce blood pressure through up-regulating the gene expression of eNOS
30、and down-regulating the ex- pression of ET-1. Key words： Hydrochlorothiazide；indapamide；endo- thelial nitric oxide synthase；endothelin-1 黄芪总苷对血吸虫卵抗原活化的 肝星状细胞增殖与胶原合成的影响 朱 虹2，吴 强2，杨 雁1，袁小松3，汪学龙3， 沈继龙3 （安徽医科大学 1. 药理学教研室、 2. 病理学教研室、 3. 病原微生物教研室， 安徽 合肥 230032） 中国图书分类号： R-332； R 284. 1； R 322. 47； R 329.
31、24； R 383. 24； R 392. 11； R 575. 02； R 575. 053 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2006） 05 -0555 -04 摘要： 目的 观察黄芪总苷对血吸虫卵抗原活化的肝星状细 胞增殖与胶原合成的影响。方法 小鼠腹腔注射日本血吸 虫可溶性虫卵抗原 （Soluble egg antigen，SEA） ， 制备 SEA 活 化的腹腔巨噬细胞条件培养基 （Soluble egg antigen induced macrophage conditioned medium，SEA-MCM） 。采用肝星状细 胞株 HSC-T6 细胞， 以细
32、胞增殖抑制率为指标， 用噻唑蓝 （MTT） 测定黄芪总苷对 SEA-MCM 诱导的 HSC-T6 细胞增殖 的影响； 通过3H-脯氨酸参入法测定黄芪总苷对 SEA-MCM 诱导的 HSC-T6 细胞胶原合成的影响。结果 SEA-MCM 能 明显促进 HSC-T6 细胞的增殖和胶原合成。黄芪总苷 （32. 5、 65 和 130 mgL -1） 对 SEA-MCM 诱导的 HSC-T6 细胞增 殖及胶原合成有明显的抑制作用， 且呈药物浓度依赖性关 系。结论 黄芪总苷对 SEA-MCM 诱导的肝星状细胞增殖 及胶原合成有明显的抑制作用。 关键词： 黄芪总苷； 血吸虫可溶性虫卵抗原 ； 肝星状细胞
33、； 增 殖 ； 胶原合成 血吸虫病是一种在热带或亚热带国家和地区广 泛传播并严重危害人类健康的寄生虫病， 它是一种 慢性虫卵肉芽肿的免疫性疾病， 其病理基础是沉积 收稿日期： 2006 -01 -14 ， 修回日期： 2006 -02 -21 基金项目： 国家新药基金资助课题 （No 969010567） 作者简介： 朱 虹 （1980 - ） ， 女， 硕士生； 吴 强 （1965 - ） ， 男， 教授， 硕士生导师， 通讯作者， E- mail： aydjohn yahoo. com 于组织内的大量虫卵对机体的刺激、 宿主对虫卵的 免疫反应和继发纤维化形成 1。肝纤维化是各型 慢性肝病所
34、共有的病理特征， 是肝硬化的中间环节， 肝星状细胞 （hepatic stellate cells， HSC） 在该过程中 起着重要作用 2。血吸虫病两大病理改变是虫卵 肉芽肿和纤维化， 研究发现在从虫卵肉芽肿延伸至 肝纤维化的过程中， HSC 起了很重要的桥梁作 用 3。本课题组以往研究发现， 黄芪总苷 （astragalo- sides，AST） 对枯否细胞条件培养基及混合血清刺 激后的 HSC 增殖和胶原合成有明显的抑制作用 4。 本文拟研究 AST 对 SEA-MCM 诱导的 HSC-T6 细胞 增殖及胶原合成的影响。 1 材料与方法 1. 1 动物与细胞株 昆明种小鼠， &各半， 体
35、重 24 2 g。由安徽医科大学动物中心提供， 合格证 号： 皖医实动准 02 号。动物自由进食、 饮水， 喂标准 颗粒饲料， 室温 （20 22） 。HSC-T6 细胞为永生 化大鼠肝星状细胞株， 其表型为活化的 HSC， 高表 达型胶原和 TIMP-1， 由第二军医大学张俊平教授 惠赠。 1. 2 药物与试剂 AST 由安徽医科大学药理学教 研室提供，称 AST 500 mg 加 Hanks 液5 ml 混匀， 煮 沸灭菌后， 加 DMEM 培养液至 50 ml， 配成 10 g L -1的储存液， 分装，- 20 保存备用。秋水仙碱 （colchicine， Col， 华美公司进口分装） ，先用 D- Hanks 液配制成 100 倍的母液， 临用前用无血清的 DMEM 稀释， 使其终浓度为 1molL -1。日本血吸 555中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2006 May； 22 （5） ： 555 8