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1、第25 息第12期 2 0 0 7年1 2月 中华中 AR C HI V E SOF 医浪 岁学刊 C HI NE S E V 。 】 . 25 N 0 ， 12 f 吮 吧 _2007 固表解毒合剂对甲型流感病毒抑制作用的实验研究 高 碧珍， ， 姚 栩 2 ， 李 灿东 ， 王 瑞国 (l. 福建中医学院， 福建福州3 5 0 1 o 8 ; 2福州市疾病预防 控制中心， 福建福州35 目 M 摘 要: 目 的: 研究固 表解毒合剂体外杭病毒作用。方法: 采用细胞培养法和鸡胚法， 观察固 表解毒合别 对甲 型流感病毒的抑制作用， 并与其他处方为对照。结果: 固表解毒合剂对M D C K细胞
2、和鸡胚的毒性小; 当药 物浓度 为。 一 以5 tnL 时可保护50%细胞不产生病变， 药物浓度为。 . 056 9 勺 I L 时可保护5 0 %鸡胚不受感染。结论: 固 表 解 毒合荆对甲 型流感病毒具有抑制作用， 其抑制作用比其他处方强。 关键词: 固 表解毒合别; 甲型流感病毒; 抑制作用 中图分类号: R 一 33文献标识码沐文章编号: 1 673 一 竹1 7 ( 2 加7 ) 12一 253 6 一 02 固 表解毒合剂是2 003 年初. 非典” 流行的过程中， 本 院杜建教授根据温病理论， 结合南方地理气候特点， 自 拟的 预防方剂。 该方由生黄蔑、 金银花、 鱼腥草、 生甘
3、草4 味药 物组成， 具有益气固表、 清热解毒、 疏散风热之效。临床实 际应用结果表明 本方作为南方地区预防传染性疾病的方 药是合理的。 本实验采用细胞培养法和鸡胚法从抗病毒角度研究固 表解毒合剂对甲型流感病毒感染的M ocK细胞和鸡胚的 保护作用， 并且以国家中医药管理局推荐的处方2和处方 5 为对照， 能够为本方的进一步开发应用以及中药防治病 毒感染性疾病的机理提供实验依据。 1 实验材料 1 . 1 药物 所有药物均购自 福建中医学院国医堂。药物按重量比 加8 倍量水浸泡0 . s h ， 文火煎煮2 次， 第1 次4Dzzlln第2 次 扣而n合并2 次水煎液， 3 5 00“ 离心
4、巧m in ， 倒出上清 液， 70恒温水浴浓缩至每山 L 药液含生药1 9 ， 高压灭菌后 4 冰箱储存备用。 方药组 成为: 固 表解毒合剂: 生黄茂3 O 9 . 金银花1 5 9. 鱼腥草1 5 乙生甘草3 处方2 : 鱼腥草1 59， 野菊花6 9茵陈 l5 g 佩兰1 0 9 ， 草果3 引处方5生黄蔑1 O 9 ， 白 术6 9 ， 防风 1 0 9 ， 苍术6 9 ， 渡香1 0 9 ， 沙 参1 0 9 ， 金银花1 0 9 绵马 贯众6 9 。 1 . 2 毒株 流感 病毒株刀F . 动 皿 “ 8 4 左!x 巧 ( H ， 凡) ， 由福州市疾 病预防控制中心保存。 1
5、 . 3 细胞 M D C K 细胞( 狗肾细胞) 引自 国家流感中心， 本室传代 保存。 1 . 4 鸡胚 9 一 11日 龄胚蛋， 由福州农工商公司马安鸡场提供。 1 . 5 红细胞 采集人“ 0 型血液， 以生理盐水洗涤 3次， 配制成 0 卜 75%红细胞悬液备用。 1 . 6 试剂 M E ”细胞生长液( H y c fo n 公司) ， 新生小牛血清( H y- d 朋公司) ， 1 叹翻犯 U / m L 青一 链霉素。M E 陇细胞维持液不 收用日期二 2 仪口一 q7 一 12 甚金项目: 福建省自然科学基金资助课题( f 刃 1 003 8) 作者简介 高碧珍( 1 肠5
6、一 ) ， 女， 福建福州人， 副教授， 硕士研究生 导师. 研究方向: 中西医结合基础研究。 中华中医药 2 6 : 犯 者 含新生小牛血清， 其余同细胞生长液。 2 方法 2 ， 1 药物毒性测定 2 . 1 . 1 药物对M D C K细胞毒性刚定 24孔板M D C K 细胞 长成单 层后， 吸 弃上清， 分别加人无血清的M E M液进行2 倍系列稀释成不同浓度的药液。每稀释度重复4 孔， 每孔 1 00林 L ， 以M E M液作正常细胞对照， 在37、 5 %c o Z 培养 箱中培养72h ， 每日观察细胞病变( c ” 。 p at h 呢 e nic e ff 七 c t ，
7、 C P E ) ， 记录结果。 2 . 1 . 2 药 物对 鸡胚毒性剧定 将药物的倍比 稀释 液分别 接种到9 一 11 日 龄鸡胚尿囊腔， 每胚0 . Z mL 。每一稀释度 接种5 个鸡胚， 同时以h 日 1止 . 。 液作为正常对照， 33， 孵育 72h ， 观察鸡胚发育状况， 以不引起鸡胚死亡的稀释度作为 药物对鸡胚的无毒限量。 2 . 2 流感病毒半数 感染量( 1 氏 ) 测定 2 21 流感 病 毒Tc川二 浏定 病毒悬液以10倍 递次 稀释 成不同稀释度， 分别接种经hank 3 液洗涤3 次的M DCK 单 层细胞， 每管接种0 ， 2 o L，每稀释度接种4 孔细胞管
8、。接种 后33吸附lh， 以卜 即r。 液洗涤3 次 加人细胞维持液， 33培养， 每日 观察细胞病变( C 陀) 情况， 出现3 一 4 十 C 咫 时收获， 进行血凝试验。 2 2 2 流 感 病 毒El 吸刚定 病毒悬液以10倍 递次 稀释 成不同 稀释度， 分别接种到9 一H 日 龄鸡胚尿囊腔， 每胚 0 . Z m L 。 每一稀释度接种4 个鸡胚， 封日 。33， 孵育7 2 h， 收获尿囊液， 进行血凝试验。 2 . 3 药物对流感病毒的抑制作用 2 . 3 . 1 药 物对M DCK细胞的 保护作用 将药物用含 l ooU 青一 链霉素的无菌h ank 。 液作系列倍比 稀释后
9、， 与 病毒悬 液( 滴度为1 仪 r l I D50 ) 等量混合， 作用 仆， 接种到M DCK 细胞， 每管接种0 . Z m L ， 每稀释度接种4 孔细胞管， 同时设 正常细胞对照、 病毒对照和阳性药物对照， 33孵育， 每日 观察细胞病变 C 咫) 情况， 出现 3 一 4 十 C PE 时收获 进行 血凝试验， 阳 性者为被感染的细胞。计算50%细胞不受感 染的药物稀释度。 2 . 3 . 2 药 物对鸡胚的保护作用先将药液用含l ooU/o L 青一 链霉素的无菌h ok ， 液作系列倍比 稀释， 再分 别与滴 定度为l ooEI D 、 的 病毒悬液等量混合， 作用仆， 接
10、种 鸡胚， 每个稀释度接种4 个鸡胚。同时设正常细胞对照、 病毒对 照和阳性药物对照， 33， 孵育72h ， 收获尿囊液， 进行血凝 试验， 阳 性者为被感染鸡胚。计算保护50%鸡胚不受感染 万方数据 第25春第1 2 期 2 0 0 7年 1 2月 中华中医药学刊 A R CH I V E SOF T 日 A DrTI ON A L C HI N E SE V OI ， 2 5N 氏1 2 【 掩 吧20 07 的药物稀释度。 3 结果 3 . 1 药物对M DCK细胞和鸡 胚的毒性 结果见表1 。实验结果表明固本解毒合剂、 处方2 、 处 方5 在各倍比稀释浓度下， 对M DcK细胞和鸡
11、胚均无毒 性， 因此药物的无毒限量为5 00o 9 生药/ m Lo 表1 药物的毒性作用 处方2处方5固木解毒合剂 药物浓度 M D C K细胞鸡胚MIXK细胞鸡胚M l 减 二 K细胞鸡胚 病变管数接种致 存活数接种数 存活数病变管数 接种数 0000 45写叶气 55气写 弓月兮 心J呢廿 000n叶 一: :几 接种管数 4 4 4 4 接种管数 4 4 4 4 病变管数 0 0 O 0 接种管数 4 4 4 4 存活数 5 5 4 5 1 : 240544054405， 3 . 2 流感病毒 半数 致死量( ID ， ) 的 测定 血凝试验结果见表2 。 根据K 出 知 江 公式计算
12、得病毒悬 液进 行1 : 1 侧 X I 倍稀释， 。2 o L 含1 以 T 1 几; 进行卜 31 6 倍 稀释， 。 . Z m L 含l ooEID50 。 结果见表30 表2 流感病毒半数致死量( ID动的测定 M D C K细胞鸡胚 区、 季节气候和人群体质有关。 但是， 从目 前相关研究情况 来看， 由于缺乏系统理论的指导与传统经验的归纳， 从而普 遍存在着药理研究与辨证理论分离、 注重抗病毒轻脏腑本 能、 重祛邪轻扶正、 重已 病治病轻已病防变的问题， 同时对 其内在的传变规律缺乏认识。 表4 药物对甲型流感病毒的抑制作用 鸡胚法) 病毒稀释度 接种管数 被感染的细胞比 例 接
13、种数被感染的比 例被保护鸡胚的比例 0/4叭0/40/40/40/40/4 4/44/44/44/44/44/44/4 4/44/44/41/41/40/40/4 4/43/40/4D/40/40/40/4 4/44/42/4从1/40/40/4 444)月444 4/44/44/43/41/40/40/4 4/44/44/44/4圳0/40/4 44)，4444 10-I 1 0 一 2 1 0 一 3 1 0 月 . 0 一 ， ! 0 一 0 一 7 药 物 稀 释度 接种数 处方2 处方5固本解毒 细胞对照 病毒对照 3 . 3 药物对流感病毒的抑制 作用 结果见表3 一 4 。根据儿
14、d er公式计算得固本解毒合 剂在1 ， 22药物浓度( 0 . 以5 扩 m L)时可保护50%细胞不产 生病变， 在1 : 18药物浓度(0. 056 酬m L)时可保护50%鸡胚 不受感染。 处方2 保护50%细胞不产生病变和50%鸡胚 不受感染的 药物浓度分别为1 : 川 。 . 的1 盯 m L)、 1 二 9 (0. 川 m L); 处方5 保护50%细胞不产生病变和50%鸡胚不受 感 染的 药物浓度分别为1 : 1 5 (0. 06 7 留 m L)、 1 : 4 药物浓度 ( 0 . 25m L)。实验结果表明， 各种药物在一定浓度下对病 毒均有抑制作用， 而固本解毒合剂对病毒
15、的抑制作用比其 他处方强。 表3 药物对甲型流感病毒的抑制作 用 细胞培养法) 1 : 2 1 : 4 1 : 9 1 : 1 6 1 : 3 2 1 盆 64 1 : 1 2 8 声 物 稀释度 被保护细胞的比例 处方2 处方5 固本解毒 细胞对照 病毒对照 中华中医药 0/40/40/40/40/40/40/4 4/44/44/44/44/44/44/4 4/44/44/43/41/40/40/4 4/44/44/4洲0/40/40/4 4/44/43/41/4叭D/40/4 过咔J月444 :2踌:8场32M 11-卜卜卜 1 : 1 2 名4 一 云 妥 学刊 4 讨论 当前， 病毒引
16、起的疾病， 如传染性非典型肺炎( S A RS， 简称非典) 、 艾滋病、 B型肝炎、 高致病型禽流感等， 严重地 威胁着人类的 健康与生命， 人们在积极寻找抗病毒疫苗等 特异性防治方法的同时， 普遍把目 光转向中医药。从近几 年发生的传染性病毒感染性疾病的流行情况和临床特点分 析: 一是符合热证的病理特点， 属于温病的范畴; 二是初起 病在肺卫. 但三焦或卫气营血传变的规律不明显; 三是与地 中药从整体上调节机体的功能， 其作用是多方面的。 在前期的研究中， 已证实了固表解毒合剂具有增强免疫和 抑制肉芽 肿及 抗炎等作用 一 2 。 本次实验结果表明， 固表 解毒合剂及其他两组中药处方均对于
17、甲型流感病毒感染的 M D C K细胞和鸡胚有保护作用， 这种作用因宿主的不同和 药物浓度的不同而有区别， 而固本解毒合剂对病毒的抑制 作 用比 其 他 处方 强。 现 代药 理研 究 川认 为， 黄 茂 具有增强 机体免疫功能、 利尿、 抗衰老、 保肝降压和较广泛的抗菌作 用。鱼腥草素对金黄色葡萄球菌、 肺炎双球菌、 甲型链球 菌、 流感杆菌、 卡他球菌、 伤寒杆菌以及结核杆菌等多种革 兰氏阳 性及阴性细菌， 均有不同程度的抑制作用; 金银花具 有广谱抗菌作用， 对钩端螺旋体、 流感病毒、 及致病霉菌等 多种病原微生物亦有抑制作用及明显抗炎、 解热作用; 甘草 有镇咳祛痰、 抗炎、 抗过敏作
18、用， 能保护发炎的咽喉和气管 的钻膜。 可见， 固表解毒合剂在立法上充分考虑中药的功 效和现代药理研究成果的结合， 本研究的结果进一步表明， 中药防治病毒感染的作用不是单一的， 除了抗病毒外还体 现在多因素的综合作用和调整内外环境。因此， 为了更好 地发挥中医 药作用， 在病证结合的基础上做到因人、 因时、 因地制宜是十分重要的。 参考文献 【 11李灿东， 王瑞国， 杜建， 等. 几种sAR S 的中医治法对小鼠 免 疫系统功能 影响的比 较研究【 J ， 福建中医药， 以 刀 ， 3 6 ( 3): 1 2 【 2 李 灿东， 王 瑞国， 杜建. 等 固 表 解毒 合剂对 大鼠 棉 球肉 芽肿 形成的 影响【 J. 福建中医 学院 学报， Z I X 陌 ， 1 6 ( 2 ) : 5 一 8 3 高学敏. 中药学【 M ， 北京: 中国中医药出版杜， 2 门洲 !2 : n 叭 1 3 7502酬 J 7 万方数据