沉默人p38MAPK基因表达的RNA干扰的逆转录病毒载体的构建.pdf

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1、现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC l i r 螂ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 8O c t 。1 7 ( 3 0 )4 6 6 7 簸霞鬻 沉默人p 3 8 M A P K 基因表达的R N A 干扰的逆转录 病毒载体的构建 朱美华1 ，温红艳1 ，唐普润1 ，梁敏1 ，刘启才2 ( 1 广州医学院第二附属医院，广东广州5 1 0 2 6 0 ；2 广州医学院实验医学研究中心，广东广州5 1 0 1 8 2 ) 摘要】目的

2、构建沉默人p 3 8 M A P K 基因表达的R N A 干扰的逆转录病毒表达栽体。方 法查找人p 3 8 M A P Kc D N A 序列，利用软件设计并合成能够形成互补双链并能转录出靶向人 p 3 8 M A P K 基因的短发夹状R N A 的两条寡核苷酸序列，退火后连接至线性化载体p S I R E N 上， 获得重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K ，酶切和测序进行鉴定。饽秉双酶切重组质粒获得特定的 酶切图谱，证实所合成核酸片段的正确重组；测序结果显示重组核酸片段序列与设计的序列完 全相同。肇论成功构建了沉默人p 3 8 M A P K 基因的重组质粒p S

3、 I R E N p 3 8 M A P K 。 【关键词】R N A 干扰；p 3 8 M A P K ；逆转录病毒表达栽体 中图分类号】R 一3 3 文献标识码 A 文章编号】1 0 0 8 8 8 4 9 2 0 0 8 ) 3 0 4 6 6 7 一0 3 C o n s t r u c t i o no faR N A i n t e r f e r i n gr e t r o v i r u sv e c t o rf o rm a k i n gs i l e n c eo fp 3 8 M A P Kg e n ee x p r e s s i o n Z h uM e i

4、h u a l ，W e l lH o n g y a n l ，T a n gP u r u n I ，L i a n gM i n l ，L i uQ i c a i 2 ( 1 T h eS e c o n dA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fG u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ，G u a n g z h o u5 1 0 2 6 0 ，G u a n g d o n g ，C h i n a ；2 E x p e r i m e n t a l R e s e a r c hC e n t e

5、 ro fG u a n g z h o uM e d i c a lC o l l e g e ，G u a n g z h o u5 1 0 1 8 2 ，G u a n g d o n g ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e c t l v eI ti st oa p p r o a c ht h em e t h o do fc o n s t r u c t i n gaR N Ai n t e r f e r i n gr e t r o v i r u av e c t o rf o rm a l d n gs i l e n c e t

6、h ee x p r e s s i o no fp 3 8 M A P Kg e n e M e t h o d sS e a r c hf o rt h es e q u e n c eo fh u m a np 3 8 M A P Kc D N A ，d e s i g na n ds y n t h e s i z ew i t h s o f t w a r et w os h o r th a i r p i n - s h a p ed i g o n u c l e o t i d es e q u e n c et h a tc a nf o r mac o m p l e

7、m e n t a r yd o u b l e - s t r a i na n dt r a n s c r i p tt a r g e t h u m a np 3 8 M A R Kg e n e ，a f t e ra n n e a l i n g ，c o n n e c t i n gt ot h el i n e a rv e c t o ro fp S I R E N ，h a r v e s t i n gar e c o m b i n a n tp l a s m i d p S I R E N p 3 8 M A P K ，i d e n t i f i c a

8、t i o nt h r o u g he n z y m ed i g e s t i o na n ds e q u e n c i n gw a sm a d e R e s u l t sS p e c i f i er e s t r i c t i o ne n z y m e m a pW a so b t a i n e df r o md o u b l ee n z y m ed i g e s t i o n ，v e r i f i e dc o T f e c t n e 8 8o ft h er e c o m b i n a t i o no fs y n t h

9、 e s i z e dn u c l e a t ef r a g m e n t ； s e q u e n c i n gs h o w e di d e n t i t yb e t w e e nt h er e c o m b i n a n tn u c l e a t ef r a g m e n ta n dt h ed e s i g n e ds e q u e n c e C o n c l u s i o nT h er e e o m b i n a n tp l a s m i dp S I R E N p 3 8 M A P Kt h a tC a nm a k

10、 es i l e n c et h eh u m a np 3 8 M A P Kg e n ei ss u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d K e yw o r d s ：R N Ai n t e r f e r i n g ；p 3 8 M A P K ；v e c t o ro fr e t r o v i r u se x p r e s s i o n 支气管哮喘是一种常见的呼吸道疾病，据统计全球约有 1 7 亿哮喘患者，且发病率逐年上升。支气管哮喘以气道 慢性炎症、气道高反应性、气道重塑为特征，其发病涉及到一 个复杂炎症反应的网络

11、系统。目前以糖皮质激素为主的治疗 策略使急性期气道炎症得到缓解，但对于慢性气道重塑的改 善作用很小，且不少患者还存在激素抵抗。因此，防治和改善 气道重塑成为哮喘研究的另一大课题。气道重塑的基础是支 气管平滑肌细胞增生、肥厚，目前研究认为，其主要机制是多 种细胞炎症因子与细胞膜受体结合后，通过改变细胞的信号 传导途径引起平滑肌细胞的增殖。在众多与细胞信号相关的 转导酶中，促分裂原活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i n k i n a s e ，M A P K ) 中的p 3 8 亚家族是引起哮喘支气管平滑肌细 作者简介】朱美华( 1

12、 9 6 2 一) ，女，儿科主任医师。主要从事儿科 哮喘相关临床与实验研究。 基金项目】广东省医学科研基金项目( A 2 0 0 6 3 0 6 ) 胞增殖的关键酶 引。本课题利用R N A i 技术3 4 j ，通过沉默 p 3 8 M A P K 基因表达，期望从控制气道重塑方面为慢性支气 管哮喘的治疗开辟一条新路。 1 材料与方法 1 1 主要材料p S I R E N R e t r o Qv e c t o r 载体购自美国C l o n t e c h 公司( 经B a m H I 和E c o R I 双酶切并回收) ；T 4D N A 连 接酶、限制性内切酶B g ll I

13、和E c o RI 为N E B 公司产品，D N A m a r k e rD L 2 0 0 0 与D L l 5 0 0 0 为日本T a k a r a 公司产品；质粒小 量提取试剂盒购自德国Q I A g e n 公司。 1 2 方法 1 2 I 制备小发夹状R N A ( S h R N A ) 模板的设计 G e n B a n k 查询p 3 8 M A P K 基因的c D N A 序列，序号为N M - 0 0 1 3 1 5 ，通过 A m b i o n 公司提供的R N A i 设计工具确定5 一C A A G A C A A T a 麟A G 、G 3 为沉默的靶序

14、列。经B l a s t 比较， 该序列与同种属其他基因无同源性。根据载体转录生成 s h R N A 的要求合成两条反向互补的寡核苷酸：分别为正义链 万方数据 4 6 6 8 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 8O c t 1 7 ( 3 0 ) S ! 一G 虹C C G C A A G 睑C T G G G A G G T 陬C A A G K C A C C T C

15、C C A G A T T G T C T T G T T T T T T G G A A G 一3 和反义链 5 一A A T T C T T C C A AA A A A C A A G A C A A T C T o G G A G G T G T c T C r T G A A C A C C T C C a 地T TT C T T G C G 一3 。正义链5 端加框区为干扰的靶序列，37 端加框区为与之反向互补序 列，中间为l o o p 结构。同时在寡核苷酸两端分别引入限制性 内切酶B a m HI 和E c o RI 酶切位点。提交序列给T a K a R a 公司合成寡核苷酸

16、。 1 2 2 逆转录病毒载体p S I R E N p 3 8 M A P K 的构建首先 将合成的两条寡核苷酸溶于相应体积的灭菌超纯水中，制成 终浓度为2g L 的D N A 溶液。然后取正义链与反义链D N A 溶液各1 肛L ，加入4 8p L 的退火缓冲液( 含1 0 0m Mp o t a s s i u m a c e t a t e ，3 0m MH E P E S K O Hp H7 4 ，2m Mm a g n e s i u ma c e t a t e ) ，充分混匀，9 5 变性3m i n ，3 7 复性ih 。将退火后 的双链寡核苷酸溶液稀释为8m g L 后与载

17、体进行连接。在 连接体系中加入：线性p S I R E N R e t r o Qv e c t o r ( 2 5m g L ) 2 止，退火的双链寡核苷酸( 8m g L ) 2 肛L ，1 0 T 4 连接酶反 应缓冲液2 肛L ，灭菌超纯水1 3p L ，最后加入T 4 连接酶1 肛L ， 充分混匀，1 6 反应过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌 T G l ，挑选单克隆菌落摇菌过夜，少量提取质粒。 1 2 3 重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K 酶切鉴定和测序按 Q I A g e n 质粒少量提取试剂盒说明书，提取各单克隆菌落中的 质粒，建立2 0 弘L 双酶

18、切体系：质粒p S I R E N p 3 8 M A P K ( O 2 3g L ) 8 止，1 0 3 号缓冲液2 止，B g lI I ( 1 5I U 以L ) I p L ，E c o RI ( 2 0I U 以L ) 1 弘L ，补灭菌超纯水8 弘L ，3 7 水浴4 h 进行酶切反应。酶切产物在1 的琼脂糖凝胶中电泳。凝 胶成像系统观察结果并照相。选择经双酶切鉴定的阳性重组 质粒送T a k a r a 公司进行序列分析。 2 结果 2 1 重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K 的酶切按照实验设计 的双链寡核苷酸模板的5 端和3 端被分别引入了B a m

19、H I 位点和E c o RI 位点，而在p S I R E N R e t r o Q 载体B a m HI 酶 切位点上游2 6 3b p 处有一B g l I I 酶切位点。用B g l I I 和E c o R I 酶切重组质粒应得到3 2 6b p 片段为和6 1 8 的2 b p 载体片 段。酶切产物凝胶电泳结果显示长度分别为3 2 6b p 和6 1 8 的2 b p 的特异条带( 图1 ) ，样本1 和2 均为阳性重组质粒。 泳道1 ：D L l 5 0 0 0 ；泳道2 和3 ：重组质粒1 和2 ；泳道4 ：D L 2 0 0 0 图1 重组质粒B g l 和E c o R

20、I 双酶切电泳图 2 2 重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K 的序列分析 重组质粒 1 和2 的测序结果( 图2 ) 与设计合成的寡核苷酸模板序列完 全一致；1 和2 号重组质粒即为成功构建可沉默人p 3 8 M A P K 基因表达的逆转录病毒表达载体。 t 矗岬 柚。 - 川o 1 嚣T o 嚣o m i 慕州。，耳 o 6 丛盐蝴。墨。6 6 6 醢6 ：血。趔l 摧拯幽。3 8 6 6 。6 。也6 6 d 6 。 图2 重组质粒p S I R E N p 3 8 M A P K 测序结果 3 讨论 M A P K 的激活是支气管平滑肌细胞增生肥厚的共同通 路，

21、故若能找到一种有效措施抑制其活性，就能使支气管平滑 肌细胞增生受到抑制。近年来的分子生物学的快速发展及其 相关技术的运用为这一问题的解决提供了新的思路及方法， 也为该问题的解决提供了可能。R N A 干扰( R N Ai n t e r f e r e l l o e ，R N A i ) 是近年来的重大科技发现，被S C I E N C E 评为 2 0 0 2 年十大科技成果之首。其基本原理是应用一类小分子 干扰R N A ( s m a l li n t e r f e r i n gR N A ，s i R N A ) ，可以高效特异地 阻断特异基因的表达，使同源m R N A 发生降

22、解，诱使细胞表 现出特定的基因缺失的表型，起到类似“基因敲低”的作用，称 为R N A 干扰【3 - 4J 。本研究采用的是体外构建抑制 p 3 8 M A P K 基因表达的R N A 干扰( R N A i ) 逆转录病毒表达载 体p 3 8 M A P K ，能产生明显的R N 效应。 本研究筛选出p 3 8 M A P K 基因1 条1 9b p 的s i R N A 靶序 列5 一C A A G A C A A T C T G C A G G T G 一3 。按照制备s h R N A 模板的要求，在正义序列与反义序列之间加入9 个核苷酸用 于形成s h R N A 的环状结构，有研

23、究证明9b p 的结构抑制效 率明显高于5 ，7b p bJ 。实验选用的线性化p S I R E N 载体两端 分别是B a m H I 酶切位点和E c o RI 酶切位点，因此在序列的 57 端引入B a m HI 位点，3 端为E c o RI 位点，2 个酶切位点均 呈黏性末端。序列的下游加入r n T n 作为转录终止信号。 研究中选用p S I R E N R e t r o Q 作为表达s i R N A 的逆转录病毒 质粒载体，除外源基因克隆位点上游含有人1 5 6 启动子及多 个限制性内切酶位点外，还有原核筛选位点A r n p r 及真核筛 选位点P u r o r ，方

24、便用于筛选及构建稳定表达的细胞株。研究 证明该质粒载体能稳定转染真核细胞并在细胞内稳定表达靶 基因的s i R N A 序列怕J 。本研究所制备的重组质粒经双酶切 及测序验证，证明插入片段的序列大小、方向均与设计的一 致，表明已成功构建了表达p 3 8 M A P Ks h R N A 的重组质粒载 体p S I R E N p 3 8 M A P K 。为以后用于真核细胞的转染、筛选 建株奠定基础；并为进一步研究s i R N A 特异诱导p s m 2 q p 3 8 M A P K 基因表达沉默进而抑制平滑肌细胞的增殖奠定了基础。 参考文献】 1 H e s sJ ，J o n g s

25、t eJ C E p i d e m i o l o g i c a la s p e c t so fp a e d i a t r i ca s t h m a J C l i nE x pA l l e r g y ，2 0 0 4 ，3 4 ( 5 ) ：6 8 0 6 8 5 2 “J ，K a r t h aS ，T a nA ，l a s v o v s k a i aS ，e ta 1 R e g t J l a t i o no fh u m a n a i r w a ye p i t h e l i a l c e l li n t e r l e u k i n - 8

26、e x p r e s s i o nb ym i t o g e n a c t i v a t e d p r o t o nk i n a s e s J A mJP h y s i o lL u n gC e l lM o lP h y s i o l ，2 0 0 2 ， 2 8 3 ：6 9 0 6 9 9 ( 下转第4 6 9 3 页) 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e mJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n

27、 e2 0 0 8O c t ，1 7 ( 3 0 )4 6 9 3 力，实验是形成和检验科学假说与理论的实践基础，要很好地 把握实验的主动性、目的性、精确性、可重复性、可控性等重要 特点，使中西医结合研究凭借实验室的优越条件，超越临床实 践的某些局限，走在临床实践的前面，为中西医结合医学的发 展开辟广阔的途径。必须在I 庙床实践基础上，深入进行实验 室基础理论研究，同时又将其研究成果指导临床实践。只有 这样，才能使中西医学在理论高度上结合起来，才能使阴阳、 五行、脏腑、经络、气血津液、八纲、证候等概念的实质得到现 代科学的阐释，才能进一步提高临床疗效。 4 促进中西医结合理论体系形成的理论性

28、原则 中西医结合医学正在发展中，中医理论和西医理论在目 前尚未达到融汇状态，还没有形成统一的中西医结合理论体 系。而中西医结合医学同一般的中西医结合工作不同，它不 应只是中医知识和西医知识的简单相加，也不只是中医临床 与西医临床之间的简单相加。从中西医各自形成理论的科学 方法上来看，西医总的特征是公理化的逻辑加实验系统，中医 则是以取类比象、悟性直觉的思维模型加经验系统。两者的 差别造成西医注重分析还原，中医注重整体过程；西医长于以 结构来说明功能，中医则从关系中把握功能。多年来许多学 者认为两者格格不入，但到了系统生物学时代，两者在逐步寻 找共同语言。正如分子生物学家陈竺院士所指出的：中医和

29、 西医在系统生物学的基础上进行整合将为医学的发展带来革 命性的变化，有可能创造出一个全新的以认识人体机理为基 础的预防医学体系。 中西医结合是从实践经验开始的。通过数十年的实践， 从人体生理、病理和疾病诊疗过程的众多认识对象中，逐步产 生并经过验证形成了一些有别于中医学或西医学传统理论概 念的、反映认识对象本质特征的思维形式，这种思维形式用专 用的词或词组来概括表述，就形成了中西医结合理论的新概 念。这些新概念不但体现了东、西方思维模式的有机结合，更 重要的是中西医学结合研究不断深化，逐渐形成中西医结合 新理论体系的重要标志。如微观辨证，是中医辨证与微观检 测相结合的中西医结合诊断方法，这种新

30、概念的形成促使了 西医学的微观检测和辨病诊断从多方面介入中医辨证论治体 系，为逐渐形成“中西医结合诊断学”奠定了基础。其他如隐 潜性证、生理性肾虚、急瘀证、急性虚证、高原血瘀证、d , J L 感 染后脾虚综合征、茵毒并治等中西医结合新概念，均具有较大 的理论价值和f 临床指导意义。 科学发展的历史表明，在长期实践基础上创造的新概念， 借助概念的逻辑内涵系统描述现象，形成理论的要素，逐渐构 建理论的轮廓；再经过实验与实践的检验与选择；然后运用科 学的逻辑分析与经验实证，形成反映相对真理性的科学理论。 这是现代科学方法的重要原则，推动着自然科学不断向未知 领域发展。中西医结合的最高层次，是通过理

31、论研究，逐步形 成能有效指导中西医结合临床，又有别于中、西医传统概念和 理论的新理论体系。中西医结合新理论概念的形成，不仅仅 是新的思维模式的表述，更重要的是它反映着中西医结合由 初级的兼容结合向高级的理论上的结合的研究不断深化，是 中西医结合新理论体系正在逐渐形成的重要标志。 一门学科的创立、形成与发展，首先有赖于理论体系的突 破和完善。没有成熟的理论总结，再丰富的临床经验也只能 是经验，而不能发展成为独立的学科。理论的发展与创新，既 是I 临床应用的基础，也是一个学科成熟的标志。只有在中西 医结合理论研究上取得重大突破，中西医结合的学术才能取 得划时代的成果。一门学科的理论要逐步完善，需符

32、合三个 基本特征：第一，坚持科学实验。科学实验是科学理论形成的 基础，真理隐藏在科学实验中，任何科学理论都建立在一定科 学事实基础上，而科学实验又是科学理论发展的直接源泉和 动力。第二，科学实验要以科学理论为指导。科学理论以科 学实验为基础，科学理论又反过来指导科学实验。第三，科学 实验和科学理论矛盾的不断出现进而推动科学的前进，激发 人们提出新观点、新学说，寻求新理论。中西医结合医学理论 体系的形成，同时还要处理好五种关系：科学理论和科学实践 的矛盾、科学理论内部的逻辑矛盾、同一学科内部矛盾运动、 不同学科之问的矛盾运动、继承与创新的矛盾。总之，要发扬 学术民主，大胆探索，敢于走前人所没有走

33、过的路。我国的中 西医结合理论体系，经过众多中西医结合研究者多年的艰苦 努力，各专业学科，从基础医学到临床医学，都已取得了较丰 富的系统的理论成果，已出版了中西医结合系列丛书和教材， 出版了各类中西医结合临床或基础专著。在中西医结合的研 究工作中，要进一步重视理论的发展与创新，充分发挥各学科 中西医结合专家及中青年专家的作用，及时进行实践和理论 的系统总结，整理研究成果，努力著书立说，形成越来越多的 中西医结合新理论、新概念，不断完善和发展中西医结合理论 体系，推动中西医结合的学术发展，从而为更高层次中西医结 合的研究与发展创造条件，打下坚实基础。 收稿日期】2 0 0 8 0 4 0 1 (

34、 上接第4 6 6 8 页) 3 H u t v a g n e rG ，Z a m o r eP D Am i e r o R N Ai nam t d t i p l e - t u r n o v e r R N A ie n z y m ec o m p l e x J S c i e n c e ，2 0 0 2 ，2 9 7 ( 5 5 8 9 ) ：2 0 5 6 2 0 6 0 4 B e t a sK ，H i j m a n sE M ，M u U e n d e r sJ ，e ta 1 Al a r g e - s c a l eR N A i s c r e e ni

35、 nh u m a nc e l l si d e n t i f i e sn e wc o m p o n e n t so ft h ep 5 3p a t h w a y J N a t u r e ，2 0 0 4 ，4 2 8 ( 6 9 8 1 ) ：4 3 1 4 3 7 5 B r u m m d k a m pT R ，B e m a r d sR ，A g a m iR As y s t e mf o rs t a b l ee x p r e s s i o no fs h o r ti n t e r f e r i n gR N A si nm a m m a l

36、i a nc e l l s J S c i e n c e ， 2 0 0 2 ，2 9 6 ( 5 5 6 7 ) ：5 5 0 5 5 3 6 M i y a z a k iH ，P a t e lV ，W a n gH ，e ta 1 D o w nr e g u l a t i o no fC X C L 5 i n h i b i t ss q u a m o u sc a r c i n o g e n e s i s J C a n c e rR e s ，2 0 0 6 ，6 6 ( 8 ) ： 4 2 7 9 4 2 8 4 收稿日期】2 0 0 8 0 6 2 5 万方数据