弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的比较.pdf

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1、收稿日期:2 0 0 5 - 0 9 - 0 1;修回日期:2 0 0 5 - 1 1 - 1 0 基金项目:国家自然科学基金资助项目(3 0 3 0 0 3 0 6) 作者简介:潘萌(1 9 6 9 -) ,女,上海人,副主任医师,博士,主要 从事大疱性皮肤病的研究。 弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的比较 潘萌1,蒋浩琴1,周芸2,郑捷1 (1.上海交通大学医学院附属瑞金医院皮肤科,上海 2 0 0 0 2 5;2.上海交通大学医学院 上海市免疫学研究所, 上海 2 0 0 0 2 5) 摘要:为研究、比较不同佐剂对诱导小鼠产生获得性免疫应答的不同作用, 以卵清白蛋白(O

2、VA) 为抗原,分别混合完全 弗氏佐剂(C F A) 或A l(OH) 3佐剂,对C 5 7 B L/6小鼠进行常规免疫,采用流式细胞技术对细胞内细胞因子I F N - 和I L - 4进 行检测;E L I S A方法对特异性抗OVA抗体滴度及抗体亚型进行了检测。结果显示在免疫后C F A组产生以I F N - 为主的细 胞因子而A l(OH) 3组产生以I L - 4为主的细胞因子;两组中均产生特异性抗OVAI g G抗体,但C F A组以I g G 2 a亚型为主, 而A l(OH) 3组则以I g G 1亚型为主,不产生I g G 2 a亚型抗体。实验表明,经C F A加抗原免疫后机体

3、产生的免疫应答以T h 1 型细胞免疫为主,抗体类型为I g G 2 a;而A l(OH) 3佐剂则诱导机体产生T h 2型细胞免疫应答,抗体类型为I g G 1。 关键词:弗氏佐剂;A l(OH) 3佐剂;T h 1、T h 2细胞因子;抗体型别 中图分类号:R 3 9 2. 1 1 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1 - 2 4 7 8(2 0 0 6)0 2 - 0 0 9 8 - 0 4 佐剂作为一种免疫调节剂在动物实验中被广泛 应用,适当运用佐剂可以调节甚至改变机体免疫系 统产生抗原特异性的体液和/或细胞免疫应答的类 型 1。目前使用最为广泛的是弗氏佐剂,其中完全 弗氏佐剂(

4、c o m p l e t eF r e u n dsa d j u v a n t,C F A) 是 T h 1型细胞强有力激活剂,可诱导产生T h 1型细 胞因子,并能增强细胞以及体液免疫应答;不完全 弗氏佐剂( i n c o m p l e t eF r e u n dsa d j u v a n t,I F A) 则 一般诱导T h 2型细胞因子。已有实验证实在动物 免疫时单用C F A可诱导T h 1型细胞免疫应答,而 单用I F A则诱导T h 2型免疫应答 2,但未有对 A l (OH) 3佐剂的相关报道。目前A l(OH)3佐剂由于 其使用安全、方便,已广泛地应用于人体疫苗免

5、 疫 3,可刺激机体产生持久的高水平抗体,但其在 动物免疫中的免疫特性则不详。 本文分别采用弗氏佐剂(F A) 或A l(OH) 3佐剂 混合卵清白蛋白( o v a l b u m i n,OVA) 免疫C 5 7 B L/6 小鼠,通过检测其抗体水平与抗体类型以及白细胞 介素4( I L - 4) 、干扰素 (I F N - ) 等细胞因子的表 达,比较两者在诱导机体产生不同免疫应答中的作 用,对抗体型别的转换以及进一步将其应用于自身 免疫病的治疗提供实验依据。 1材料与方法 1. 1 研究对象小鼠品系:C 5 7 B L/6, 雄性, S P F级,共2 0只,6 8周龄。购自复旦大学医

6、 学院实验动物部,由上海交通大学医学院实验动物 科学部负责饲养。 1. 2 实验方法 1. 2. 1 动 物 免 疫 小 鼠 分 为 两 组,C F A 组 和 A l(OH)3组各1 0只。C F A组:每只小鼠每次免疫 1 0 0gOVA,溶解于5 0l生理盐水中,加入5 0 lC F A(P i e r c e) ,彻底乳化;A l(OH)3组:每只小 鼠每次1 0 0gOVA溶于5 0l生理盐水中,加入 5 0lA l(OH)3(P i e r c e) , 完全混合。均于足跖皮 下注射,总剂量为1 0 0l。初次免疫后第1 4天和 第2 8天各加强免疫一次,剂量和方法同初次免疫。 1

7、. 2. 2 细胞因子I F N - 、I L - 4的检测选取I F N - 和I L - 4两个代表性的T h 1和T h 2细胞因子作为 检测对象。分别于初次免疫和第二次加强免疫后的 第7天( 即免疫后第7天和第2 1天) 处死小鼠。取 脾脏,得到悬浮的脾细胞,经细胞记数后,调整细 胞浓度至每毫升21 0 6个细胞。在2 4孔细胞培养 板中,每孔中加入1 m l细胞悬液, 单独或联合 OVA抗原1 0 0g/m l于3 7、5%C O2培养箱培 养。4 8h后收集细胞, 用P B S洗涤后加入1 m l 1%多聚甲醛( 国药集团化学试剂有限公司) 固定, 经再次P B S洗涤后加入0.

8、5%皂苷( S i g m a)5 0 0l 89 现代免疫学2 0 0 6年第2 6卷第2期 室温孵育5m i n。加入标有不同荧光染色剂的荧光 抗体: 细 胞 色 素- C D 4(B D P h a r m i n g e n) 、F I T C - I F N - (B DP h a r m i n g e n) 、P E - I L - 4 (B D P h a r m i n - g e n) ,抗体稀释度为1 : 1 0 0。避光,室温孵育 4 5 6 0m i n。经洗涤后使用流式细胞仪(F l u o r e s c e n c e A c t i v a t e dC e

9、l lS o r t e r,F A C S) 进 行 读 数, 检 测 C D 4 +T细胞中的细胞因子I F N - 和I L - 4的表达 量。 1. 2. 3T细胞极化试验 用上述细胞悬液调整细 胞浓度为11 0 6/ m l,在4 8孔细胞培养板中每孔 加入1 m l细胞悬液, 分别在中性、T h 1极化和 T h 2极化三种条件下诱导极化。中性条件为每孔中 加入抗C D 3抗体( B DP h a r m i n g e n,1 0g/m l) 、抗 C D 2 8抗体(B DP h a r m i n g e n,1g/m l) 及I L - 2(B D P h a r m i

10、n g e n,1 : 5 0 0稀释) 4;T h 1极化的条件是 在上述中性条件的基础上加有I L - 1 2(B DP h a r m i n - g e n, 5n g /m l) 及抗I L - 4抗体( B DP h a r m i n g e n,1 0 n g /m l) ;T h 2极化的条件是在上述中性条件的基 础上加有I L - 4(B D P h a r m i n g e n,2 0n g/m l) 和抗 I F N - 抗体(B DP h a r m i n g e n,1 0n g /m l) 。4 8 h后 培养液中加入I L - 2( 1 : 5 0 0稀释)

11、 。在培养的最后 6 h收集细胞, 用抗C D 3和抗C D 2 8抗体再次刺 激,使细胞进一步活化,分泌细胞因子。最后进行 细胞内细胞因子I F N - 和I L - 4的检测。 1. 2. 4 抗OVA抗体滴度和抗体类型的检测 初 次免疫后1周起至第7周,每周对小鼠进行眶眦采 血1 0 0l,分离血清。使用标准9 6孔酶标板(C o s - t e r) ,OVA1g/孔进行包被。封闭后加入1:4 0 0 稀释的小鼠血清7 0l,行3复孔,置3 7孵育1 2h。孵育结束后经洗涤加入生物素标记的抗小 鼠I g G( B DP h a r m i n g e n,1 : 40 0 0稀释) ,

12、I g G 1或 I g G 2 a抗 体 (B D P h a r m i n g e n,1 : 20 0 0稀 释) , 3 7孵育4 5m i n。经彻底洗涤后,加辣根过氧化 酶(HR P) 标记的酶标抗体(B D P h a r m i n g e n,1 : 1 0 0 0稀 释)1 0 0l。 最 后 加 适 量 底 物 邻 苯 二 胺 (O P D) ,避光室温孵育至阳性孔显色,加入终止 液2 m o l/L H2S O 4终 止 反 应。经 酶 标 仪 (B I O - R A D) 于4 9 0n m波长处测定。每次实验中加用同 一阳性标本,作为组间参照。 1. 3 统计学

13、处理 相关数据应用S P S S 1 1. 5分析 软件进行统计分析。 2 结果 2. 1 细胞内细胞因子I F N - 和I L - 4的表达 C F A组 和A l(OH) 3组小鼠分别于免疫后第7天和第2 1天, 各处死2只小鼠, 取其脾脏, 体 外 用OVA1 0 0 m g /m l与脾细胞进行联合培养,4 8h后经荧光标 记,用F A C S方法进行细胞因子I F N - 和I L - 4的 检测。结果显示,在免疫后第7天,C F A组中产 生I F N - 的C D 4 +T细胞平均为7. 6 8%,I L - 4为 0. 8 7%,其比值为8. 8 3, 以T h 1型细胞因子

14、为 主;而A l(OH) 3组中产生I F N - 的C D 4 +T细胞 为3. 5 2%,I L - 4为1. 4 5%, 其比值为2. 4 3( 表 1) ,I L - 4的表达明显高于C F A组,说明初次免疫 后A l(OH) 3组出现T h 2型细胞免疫应答的倾向。 加强免疫后A l(OH) 3组I F N - /I L - 4的比值小于 1,细胞因子的产生以I L - 4为主,表现为强的T h 2 型细胞免疫应答,而C F A组虽然I F N - /I L - 4比 值明显降低,为1. 1 6,但仍以I F N - 为主。 表1 C F A或A I(O H)3联合O V A免疫后

15、细胞因子I F N - 和I L - 4的表 达 类别 7d C F A A l(OH)3 2 1d C F A A l(OH)3 I F N - 7. 6 8%3. 5 2%0. 7 9%0. 8 3% I L - 40. 8 7%1. 4 5%0. 6 8%0. 8 9% I F N - /I L - 4 8. 8 32. 4 31. 1 60. 9 3 2. 2C F A和A I(O H)3组小鼠免疫后T细胞的极化 C F A和A l(OH) 3组小鼠免疫后第7天,取其脾 细胞,经不同的极化条件刺激后分别出现T细胞 向T h 1或T h 2转化。在T h 1极化条件下,两组小 鼠的T细胞

16、显示出高表达T h 1型的细胞因子I F N - ( 分别为3 9. 9 8%和3 8. 8 5%) ,I F N - /I L - 4的比 值约为3 0 0;在T h 2极化条件下,则为高表达T h 2 型的细胞因子I L - 4( 4. 8 3%和3. 2 8%) ,I F N - /I L - 4的比值为0. 1 8;而在中性条件下,其细胞因子的 表达则介于T h 1和T h 2极化条件之间, 偏向于 T h 1,I F N - /I L - 4的比值约为3 5。 2. 3E L I S A结果 经C F A和A l(OH) 3分别联合 OVA免疫后,每周进行眶眦采血,分离血清,采 用E

17、 L I S A的方法进行特异性抗OVA抗体滴度及 抗体类型的检测,结果显示C F A组的总I g G抗体 滴度较A l(OH) 3组出现早,滴度高。免疫后第2 1 天,其平均A值为1. 1 3 9,而后者为0. 6 7 5。最高 峰两 组 均 出 现 在 第3 5天,C F A组 为1. 4 8 9, A l(OH)3组为1. 1 2 3( 图1) 。进一步对抗体亚型的 分析表明,两组在免疫后第2 1天均出现I g G 1抗 体的升高,但总的滴度仍以C F A组为高( 图1) 。 在I g G 2 a的表达上,C F A组出现较高滴度的表 99 弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答

18、作用的比较 达,其高峰出现在免疫后第3 5天,其平均A值为 0. 5 9 6。尤其突出的是A l(OH)3组小鼠几乎不表达 I g G 2 a,其A值都在0. 1以下( 图1) 。经统计学分 析,两组在第3 5天时I g G 2 a的表达有显著性统差 异( P而A l(OH) 3则为 I L - 4,倾向 于T h 2型。虽 然 在 实 验 中 观 察 到 在 C F A组小鼠中有一定量的I L - 4表达,而A l(OH)3 组中亦有I F N - 的表达,但从其比值来看,C F A 组小鼠在免疫后第7天I F N - 和I L - 4的比值为8. 8 3,A l(OH)3组为2. 4 3,

19、加强免疫后A l(OH)3组 的比值小于1,明显的高表达I L - 4,从而证明了 C F A和A l(OH)3两种佐剂在诱导机体产生不同的 免疫效应时,可使机体环境向T h 1或T h 2方向发 展。值得一提的是,在进一步的T细胞体外诱导 极化的过程中,实验显示不管体内何种环境下的T 细胞在体外的极化条件下都可出现再次地向T h 1 或T h 2方向极化, 说明在一定细胞因子的干预 下,无论T细胞在体内是I型还是I I型T辅助细 胞,都有能力继续向T h 1(T h 2) 或向相反的方向趋 化。 另外,已有研究表明T h 1和T h 2型效应细胞 亦可辅助B淋巴细胞产生不同亚型的抗体,在小

20、鼠体内,前者辅助产生I g G 2 a亚型的抗体,而后 者则辅助产生I g G 1亚型的抗体 1 1,1 2。在实验中, 免疫后用E L I S A方法进行抗体滴度及其抗体类型 的检测。结果显示, 经A l(OH) 3佐剂免疫的小鼠中 不表达I g G 2 a亚型抗体,而是以I g G 1亚型为主; 在C F A免疫的小鼠中虽然有一定量的I g G 1的表 达, 但 显 示 有 相 对 高 滴 度 的I g G 2 a, 且 与A l (OH) 3组有显著的统计学差异。 本次实验进一步验证了C F A和A l(OH) 3佐剂 分别作为T h 1和T h 2型细胞激活剂的免疫作用, 为通过细胞因

21、子干预进行I g G抗体亚型型别的转 换奠定实验基础。 参考文献 1 周光炎,主编.免疫学原理M.上海:上海科学技术文献 出版社,2 0 0 0:8. 2 Y i pHC,K a r u l i nAY,T a r y - L e h m a n n M,e ta l .A d j u - v a n t - g u i d e dt y p e - 1a n dt y p e - 2i mm u n i t y:i n f e c t i o u s/n o n i n - f e c t i o u sd i c h o t o m yd e f i n e s t h e c l a s

22、 s o f r e s p o n s eJ. J I mm u - n o l,1 9 9 9,1 6 2(7) :3 9 4 2 - 3 9 4 9. 3 L i n d b l a dE B.A l u m i n i u ma d j u v a n t s - i nr e t r o s p e c ta n dp r o s - p e c tJ.V a c c i n e,2 0 0 4, 2 2(2 7 - 2 8) :3 6 5 8 - 3 6 6 8. 4 Y i nZ,C h e nC,S z a b oS J,e ta l .T - b e te x p r e s

23、 s i o na n d 001 现代免疫学2 0 0 6年第2 6卷第2期 f a i l u r eo fGATA - 3c r o s s - r e g u l a t i o n l e a d t od e f a u l tp r o d u c t i o n o fI F N - g a mm ab yg a mm a d e l t a Tc e l l sJ.JI mm u n o l, 2 0 0 2,1 6 8(4) :1 5 6 6 - 1 5 7 1. 5 M o s m a n nT R,C o f f m a nR L. T h 1a n dT h 2c e

24、 l l s:d i f f e r e n t p a t e r n so fl y m p h o k i n es e c r e t i o nl e a dt od i f f e r e n tf u n c t i o n a l p r o p e r t i e sJ.A n n uR e vI mm u n o l,1 9 8 9,7: 1 4 5 - 1 7 3. 6 B u c yR P,K a r rL,H u a n gGQ,e ta l . S i n g l ec e l l a n a l y s i s o f c y t o k i n eg e n e

25、c o e x p r e s s i o nd u r i n gC D 4+T - c e l lp h e n o t y p e d e v e l o p m e n tJ. P r o cN a t lA c a dS c iU S A,1 9 9 5,9 2:7 5 6 5 - 7 5 6 9. 7 C r a n e I J,F o r r e s t e r J V. T h 1a n dT h 2l y m p h o c y t e s i na u t o - i mm u n ed i s e a s eJ. C r i tR e vI mm u n o l,2 0

26、0 5,2 5(2) :7 5 - 1 0 2. 8 李敬来. T h 1,T h 2型细胞因子与免疫排斥反应及免疫耐受 J.上海免疫学杂志,2 0 0 0,2 0(6) :3 8 0 - 3 8 2. 9 李渊,孙红祥.不同类型免疫佐剂的作用比较J.浙江畜 牧兽医,2 0 0 3,2 8:1 6 - 1 7. 1 0 A v r a m i d i sN,V i c t o r a t o sP,Y i a n g o uM,e ta l .A d j u v a n t r e g u l a t i o no f c y t o k i n ep r o f i l ea n da n

27、t i b o d y i s o t y p eo f i mm u n e r e s p o n s e st oM y c o p l a s m a a g a l a c t i a ei nm i c eJ. V e rM i c r o - b i o l,2 0 0 2,8 8(4) :3 2 5 - 3 3 8. 1 1 T o e l l n e rKM,L u t h e rS A,S z eDM,e ta l .Th e l p e r1 (T h 1)a n dT h 2c h a r a c t e r i s t i c ss t a r t t od e v

28、e l o pd u r i n gTc e l l p r i m i n ga n da r e a s s o c i a t e dw i t ha n i mm e d i a t e a b i l i t y t o i n d u c e i mm u n o g l o b u l i nc l a s ss w i t c h i n gJ. JE x pM e d,1 9 9 8,1 8 7 (8) :1 1 9 3 - 1 2 0 4. 1 2 洪建. T h 1,T h 2细胞的分类、分化、功能和在某些疾病中 的意义J.上海免疫学杂志,1 9 9 4,1 4(4) :

29、2 4 3 - 2 4 4. C o m p a r i s o no ft h er o l eo fF r e u n dsa d j u v a n ta n da l u m i n u mh y d r o x i d e h y d r a t e i n i n d u c i n gm o u s ea d a p t i v e i mm u n e r e s p o n s e P AN M e n g 1, J I ANG H a o - q i n 1,Z HOU Y u n2,Z HE NGJ i e1( 1.D e p a r t m e n t o fD e r

30、 m a t o l o g y,A f f i l i a - t e dR u i j i nH o s p i t a l,M e d i c a lC o l l e g eo fS h a n g h a iJ i a o t o n gU n i v e r s i t y,S h a n g h a i2 0 0 0 2 5,C h i n a;2. S h a n g h a iI n s t i t u t eo f I mm u n o l o g y,M e d i c a lC o l l e g eo f S h a n g h a iJ i a o t o n g

31、U n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 0 0 2 5,C h i n a) A b s t r a c t:T oc o m p a r e t h er o l eo fd i f f e r e n ta d j u v a n t s i ni n d u c i n gm o u s ea d a p t i v e i mm u n er e s p o n s e,o v a l b u m i n(OVA)w a s u s e da sa na n t i g e n,e m u l s i f i e dw i t hc o m p

32、l e t eF r e u n d sa d j u v a n t(C F A)o ra l u m i n u mh y d r o x i d eh y d r a t eA l(OH)3 ,t oi m - m u n i z eC 5 7 B L/6m o u s ea c c o r d i n gt o t h e r o u t i n ep r o t o c o l . T h ed e t e c t i o n so f i n t r a c e l l u l a r c y t o k i n ee x p r e s s i o na n da n t i b

33、 o d yp r o - d u c t i o nw e r ep r o c e e d e d . I tw a sf o u n dt h a tt h em i c ef r o m C F Ag r o u ps h o w e dd o m i n a n tI F N - c y t o k i n ee x p r e s s i o na n dt h o s e f r o m A l(OH)3g r o u ps h o w e dd o m i n a n t I L - 4e x p r e s s i o n .T h es p e c i f i cI g G

34、a n t i b o d yt i t e rw a si n c r e a s i n gi nb o t hg r o u p s,b u t t h ed o m i n a n t a n t i b o d yi s o t y p ew a sd i f f e r e n t . I g G 2 aw a se l e v a t e di nC F Ag r o u pw h i l eI g G 1w a sh i g h e ri nA l(OH)3g r o u p . T h e s er e s u l t s i n d i c a t e t h a tC F

35、 Ai sas t r o n ga d j u v a n t f o r i n d u c i n gt y p e - 1 i mm u n e r e s p o n s ea n dA l(OH)3i s f o r t y p e - 2r e s p o n s e . K e yw o r d s:F r e u n d sa d j u v a n t;a l u m i n u mh y d r o x i d eh y d r a t e;T h 1,T h 2c y t o k i n e s;a n t i b o d y i s o t y p e s 101 弗氏佐剂与氢氧化铝佐剂对诱导小鼠获得性免疫应答作用的比较