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1、2 0 0 3 年 1 0 月 广西师范大学学报( 自然科学版) J OUR N AL O F G UA NGX I N OR MAL UNI V E R S I T Y Vol . 21 No 时间分辨荧光法对 D 一 和L 一 色氨酸的手性识别 卫艳丽 ， 魏玉越 , C a r m e n W, H u i , 黄川 ( 1 . 山西大学 化学化 工学院 . 分析科 学与 药学系 山 西太原 。 3 0 0 0 0 ; 2 香 港浸会 大学 化华系 . 九戈跪 入鱼 飞魄 、 本文用时间分辨荧光探针技术实现了不经分离识别 D一 和 I . 一 色氨酸， 其中， 用灵敏的微环境探针 花做探
2、针. 该法基于B S A与 D和 , 色氨酸不同的相互作用， 因此， 改变了探针的微环境性质如极性和荧 光寿命， 花在B S A体系中能发射强且稳定的荧光， 而D 一 和I . 色氨酸则可对它们发生不同程度的淬灭. 基 于不同的淬灭速率常数则可达到对D一 和I , 一 色氨酸的手性识别. 该法简单， 快速， 样品损耗少， 适宜于D和 I ,色氨酸的手性识别. 同时 也为对映体的识别开辟了一条新的道路. 仪器和试荆S I O O P T I 激光诱导时Ill 分辨荧光光度计; 高纯氮( 9 9 . 9 9 9 %) ; 花( 9 8 % , A l d r i c h , U S A) , 1
3、)色氨酸和I , 一 色氮酸( 9 9 0 o , A c r o s 试剂公司) . B S A体系中花的微环境性质研究花是非常灵敏的微环境探针， 它的第一和第三荧光振动带( I / m ) 通常用做探测有序介质微极性的探针. 作为一种蛋白质， B S A由手性氨基酸组成， 另外含糖部分组成 糖蛋白， 形成三级折叠结构， 它能通过疏水作用， 静电作用及氢键与花形成稳定的络合物， 我们考察了茁在 B S A体系中的微环境性质， 实验表明花的 工 / m 的值随着 B S A浓度的增加而减小， 最后到达一个最小值， 同时， 荧光寿命实验表明， 它的荧光寿命随着B S A浓度的增大而增加， 最后到
4、达一个最大值. 这表明花与 B S A逐渐形成了稳定的络合物. 由于其疏水性， 花的溶解位点可能位于 B S A的极性核心， 并且它的荧光 衰减在所有情况下都呈单指数衰减， 而且， 在4 8 0 n m处没有缔合物的荧光峰出现. 30 0 00 0 25 川 0 ( 1 8.5 0 00 0 80 0 00 0 】 川】 阴 川1 0 0 00 0 5 0 00 0 dS- , Yr/3三 2 0 1 1 2 5 0 3 11 0 .1 5 0 3 5 0 4 0 0 11 1 0 5 0 c口7 1 1 2 1 2 8 3 5 入i n m a n m 图1 花/ B S A随着D一 色氨酸
5、增加荧光光谱图2 D和I ,色氨酸对花/ B S A 色氨酸的浓度从， 到d : a . 1 5 m m o l/ L . b . 1 0 mm o l / L . c . 5 m m o l / L . d . 1 m m a l / L ) . ( 2 0 i , m o l / L) 的单线态淬灭曲线 . D 一 和 I . 一 色氨酸在B S A体系中的手性识别图 1 显示了花在B S 八体系中( 2 0 I n i o l / I ) 在 D色氨酸存 在下的荧光激发和发射光谱， 在3 5 0 - 5 0 0 n m范围内荧光强度随着色氨酸浓度的增加而减弱， 同时， 激发 光谱蓝移.
6、大色氨酸也发生同样的情形. 花的 I / 1的值测量表明随着色氮酸浓度的增大而减小. 同时 荧 光寿命实验表明当I , 色氨酸的浓度在。 一1 0 m mo l / I时， 花的荧光寿命没发生什么变化， 当 I , 色氨酸的 浓度在 1 0 - 5 0 mmo l / I时， 茁的荧光寿命减小. 这表明在低浓度( 1 0 mm o l / I ) 的1 , 一 色氨酸存在时则发生动态淬灭. 而D 色氮酸则只发生一种形 作者简介: 董川( 1 9 6 3 -) . 男. 教授. 研究方向: 分子光谱分折. 电话: 0 3 5 1 - 7 0 1 1 3 2 2 : E - mn il : d o
7、 包, x - e d u . c n . 万方数据 广西师范大学学报( 自然科学版)第 2 1 卷 式的动态淬灭. 通过测量静态荧光强度和荧光寿命随淬灭剂的减小可求得淬灭效率 对于动态淬灭可通过 S t e r n - V o l me r 动力学方程( 方程 ll: r o / r =l a / 1 =1 十K二 仁 T r p =1 +k j a 仁 Tr p ( 1 ) I 。 和I , r 。 和r 分别是没有淬灭剂和存在淬灭剂时的荧光强度和寿命 K二 是S t e r n - V o l m e r 常数， 等于淬灭 速 率常数k 、 和没有淬灭 剂存在时的荧光寿命的乘积. 在此涉
8、及到两种淬灭机理， 动态淬灭和静态淬灭. 动态淬灭是由于淬灭剂在介质内扩散到激发态， 这 个过程给出了淬灭剂通过手性基质的动力学信息. 第二种机理( 静态淬灭) 涉及到花在激发前与B S A和色 氨 酸之间 形成 络合物， 得不到动力学信息 静态淬灭提供了有关 探针的和 淬灭剂在手性主体分子内 的相 对 配置的信息. 在静态淬灭过程中， 不需要反应物之间的扩散， 激发态的一部分立即消失从而导致稳态荧光 强度减弱. 然而， 由于激发态没有与淬灭分子形成络合物， 从而使得激发态没有发生淬灭， 荧光寿命保持恒 值 这样， r d: 是恒定值， 方程( 力中的相应于络合物的络合常数 色氨酸对 B S
9、A ( 2 0 p m o l / l . ) 体系中花的S t e r n - V o l m e r 淬灭图如2所示. 可以看出. 在高浓度的I . 一 色 氨酸存在时的淬灭效率较小. 同时表明， I , 一 色氨酸存在时， 花至少是以两种形式发生淬灭的. 高浓度时淬 灭效率的降低表明花与 B S A形成的络合物保护了 I . 一 色氨酸对花的激发态的失活. 我们推测在高浓度的 I , 一 色氨酸对花- B S A络合物的淬灭过程中， I . 一 色氨酸与B S A有强的复合键合， 而在低浓度存在时， 则只有 弱的键合或没有键合， 而对于D一 色氨酸来说， 花只发生了一种形式的淬灭. 这表
10、明D 色氨酸不能与B S A 键合或只发生弱的键合. 由S t e r n - V o l m e 淬灭方程可以求得淬灭速率常数， 根据它们的淬灭速率不同从而 可以观察到D 和L 一 色氨酸的手性识别( 用k ( D - T r p ) / k , ( L - T r p ) 表示， 列于表1中) . 由表中的数据可以 看出B S A可以对色氨酸进行较好的手性识别. 同时 荧光寿命差异实验结果列于表 2中， 可见， 它们在 B S A体系中的荧光寿命差异由水中的。 . 6 n s 增大到4 1 . 7 n s . 表1 D一 和 L 一 色撅酸对花的淬灭速率常致 秒 识 别 剂 基 于 1 o
11、 / /基 于 r / r k( 刀 - T r p ) ( L m o l - 5 生 ) k , ( L - T r p ) k , ( D - T r p ) / k , ( D- T r p ) ( L m 0 1 5 一 )k( L - T r p ) ( L m o t 一 5 一 t ) k , ( L - T r p ) k , ( D- T r p ) / ( L m o l - , s - ) k , ( L - T r p ) B S A ( 9 . 8 9 1 土0 . 3 9 ) x1 0 ( 7 . 4 5 1 十 0 . 3 1 ) 沐 1 0 3 2 7 ( 2
12、 . 0 4 9 士 0 . 0 9 ) 只 1 0 ( 1 . 5 8 2 士 0 . 0 8 ) X 1 0 表2 龙在水和B S A体系中荧光寿命差异比较 介质 花 ( 5 X 1 0 - mo l / L ) +D一 色氨酸( 8 mmo l / L) I / r / n s 花 ( 5 X 1 0 7 mo l / L ) +L 一 色氨酸( 8 -m o t / L) I / .r / n s R e s u l t s c o mp a r e ( 乙 r / r ) / % 二次水B S A ( 1 2 . 5 mm o l/ 1 ) 2 3 . 4 6 土0 . 4 1 31
13、 4. 7士 4 .9 1 3 6 2 2 . 8 6 士 0 . 5 4 3 8 3 2 7 3 . 0 + 4 . 7 6 r / n s 0 . 6 4 1 . 72. 5613 . 2 5 CHI RAL DI S CRI M I NATI ON OF D- AND L- TRYPTOPHAN BY TI M E RE S OL VE D FL UORE S C E NC E TE CHNI QUE WEI Ya n - l i , WEI Yu - x i a Xa r me n W. Hu i . DONG Ch u a n ( I . C h e mis t r y a n d C h e mic a l E n g in e e r in g I n s t it u t e , S h a n x i Un i v e r s i t y . T a iy u a n 0 3 0 0 0 6 , C h in a ; 3 . H o n g K o n g B a p t is t Un i v e r s i t y . K o w lo o n T o n H o n g K o n g . C h i n a ) ( 责任编拆马殷华) 万方数据