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1、第 川卷第 1 、 期 2 0 川 年 1 0月 中国现代医学杂志 C hin :, I o u n u l o f Mn d e m Me d l d n c V 长L I( V i 2 v ,2 0 0 白细胞介素 1 刺激破骨细胞性 骨吸收作用的实验研究 第四军医大学西京医院全军骨科研究所( 西安7 1 0 0 3 2 ) 康凯 华中科技大学同济医学院协和医院骨科( 武汉4 3 0 0 2 2 ) 杜靖远 目 的: 了 解白 细胞介素t P ( I L - 招 ) 在破骨细胞性骨吸收中 的刺激作I tl 及其相应的作用机制, y 法 分别 将新生大厌 破骨细胞单 独以 及和成骨细胞联合接
2、种于 预笠象牙 片的培养板中 2 4 1, 后培养液中加入不同浓 度的I L 一 1 门继续 培养4 8 h , 然后取出 象牙 片， 超声 处理后 行甲 苯 胺蓝染色， 光 镜下 观察骨吸 收陷窝的 数日 并 计算其总面积。结果: 比一 1 能够明显 增加 破骨细胞和成骨细胞联合培养组象牙 片上吸收陷窝的数目和面 积 且刺激作用呈剂量依赖性， 但对单独培养的破骨Sw 胞无明显刘激作用。结论: I L 一甲的刺激骨吸收柞用 由 成甘细胞所介导 而非直 接作用于 破骨细 胞 关键词白细胞介素 t 成骨细胞破骨细胞骨吸收 分类号R一 3 3 2 骨吸收的过程复杂， 有多种细胞和炎症介质参 与， 破
3、管细胞是骨吸收过程的效应细胞。破骨细胞 的生成、 活化及其在骨吸收中的作用受细胞因子和 细胞间相互作用所调节。白细胞介素 l ( l l 一1 ) 是 一种骨吸收刺激因子 可在多种骨吸收性疾病( 如骨 质疏松症等) 中异常地增高， 但其作用机制目前尚不 十分清楚为此， 本实验采用体外破骨细胞培养和 成骨细胞与破骨细胞联合培养的方法来观察 I L一I 对破骨细胞性骨吸收的刺激作用并探讨其可能机 制 1 材料和方法 1 . 1 药物和分组 主 要 药 物为大鼠白 细 胞介素1 队 r 1 L 一 1 (3 , S ig m a 产品) 实验分组为 对照组, I L 一 华处理组( H L 一 招
4、浓度为0 . I n g / m l , l n g / m 和l o n g / m l ) ， 各实验组又 分破骨细胞单独培养和成骨细胞与 破骨细胞联合培 养两个亚组。 1 2 大鼠成骨细胞的培养和准备 采用二次胶原酶消化培养方法， 将 1 d龄新生 S D大鼠置人 7 5 %酒精中浸泡消毒5 m i n . 无菌操作 下完整取出N7 i 盖骨， 清理洗涤后 用 1 %工型胶原酶 ( S ig m 。公司) 分别于室温、 3 7 消化 3 0 m i n和 2 0 n i i n . 收集第2 次消化的细胞悬液、 I o 0 o r / m i n离 心 L O 。 、 二， 弃上清 用少
5、量含量 巧%胎牛血清( F C S ) 的D M E M ( G i b a 公7) 培养液( 含青霉索和链霉素 各1 0 0 u / n i l ) 将细胞吹打均匀. 按 I x1 0 个/ m l 接利 于 培养瓶中， 3 7 1 ， 5 %C 快， 饱和湿度培养， 至细胞 汇合后消化传代本实验用系第二代成M细胞， 浓 度为2 x 1 0 0 个/ n 讼 1 3 破骨细胞的分离、 培养以及和成骨细胞混合培 养 取 叼龄新生S l 大鼠、 拉颈处死后7 5 %乙醇浸 袍5 m i n ， 分离其股骨、 胧骨和胫骨， 清除骨表 I 软组 织和骨能， 骨干部分放入盛有 ME M ( G i b
6、 c o 公司) 培 养液( 含 1 5 %胎牛血清、 2 5 n i m o l / L H E P E S缓冲液 I O O u / h n l 青霉素、 0 0 u / n i l 链霉素, P H T 0 一7 . 1 ) 的 玻璃平皿中， 用解剖刀纵行将骨质轻轻刮人培养液， 吸管反复冲打骨质碎片2 m i n , 静止3 0 s 后， 收集 f . 清， 调整细胞浓度为1 X1 0 “ 个/ m l ， 再均匀接种于预 置象牙片( 6 m m X 6 m m , 厚3 0 1m 1 ) 或盖破片的2 4 孔 培养板中 8 1 ， 后取出盖玻片， 行破骨细胞染色鉴 定) ， 常规条件培
7、养3 0 m i n 后， 用 ME M培养液冲掉 未贴壁细胞。 更换培养液， 每孔加人 ME M/ F C S 1 . 5 m 1 和成骨细胞悬液0 . 5 m l ( 破骨细胞单独培养亚 组仅加人 M E M/ F C S 2 . 0 m 1 ) ， 共同培养2 4 h 再次 换液并分别加入不同浓度的r 1 L一甲) 继续培养 4 8 h 后取出象牙片 1 . 4 大鼠破骨细胞的鉴定 倒置显微镜观察: 观察培养细胞的形态及运动 情况: 破骨细胞抗酒石酸酸性磷酸酶( C R A P ) 染色: 将含细胞盖玻片经 I %戊二醛4 1 固定 I O mi n , 冲洗 后置人 V R A P孵育
8、液( 由T R A P染色试剂盒配制， 购于中国医科院血液病研究听) ， 3 7 -C孵育5 0 mi n , 万方数据 中国现代医学杂志 疏松症等高转换型代谢性骨病的主要原因。破骨细 胞来源于单核巨噬细胞系统的造血干细胞， 并在巨 噬细胞集落刺激因子( M一 C S F ) , 白细胞介素口1 ) 一 3 和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( G M一C S F ) 的 诱发下能演变为成熟的破骨细胞f l ; 。 破骨细胞 的典型特征为多核、 富含T R A P 、 有丰富的降钙素受 体以及在骨薄片上可形成骨吸收陷窝等l 2 1 。本实 验采用新生大鼠长骨机械分离方法， 并通过活体观 察、 贴壁细
9、胞 T R A P特异性染色以及典型骨吸收陷 窝的形成， 证实所培养的细胞具有明显的破骨细胞 特征 实验研究表明， 成骨细胞在破骨细胞的诱导和 活化过程中发挥重要作用。血源单核前体细胞分化 发育成破骨细胞是在成骨细胞通过分泌细胞因子所 提供的微环境中和胞膜上破骨细胞分化因子直接指 导 下完成的 l i a同样， 在破骨细胞性骨吸收过程 中， 成骨细胞则通过骨形成中分泌的基质活性分子 如骨钙素、 骨桥蛋白等来调控破骨细胞的移行粘附， 皱折缘形成以及泌酸和溶酶体酶释放等功能D J I L 一I 主要来源于单核细胞和巨噬细胞， 具有较强 的刺激骨吸收活性和抑制骨形成作用。研究发现， 绝经后妇女来源的
10、外周血单核细胞培养上清液具有 较强的骨吸收活性， 而补充 比一I 中和抗体后则可 抑制 该培养上清的骨吸收活性f4 i 。另外， 体内注 射I L 一I 受体拮抗剂， 能阻止去势大鼠的骨质丢失。 而且 作用效果与 使用雌激素治疗相似 川。以上结 果提示， I L -硬 在绝经后骨质疏松症的发生中起重 要作用。比一1 在骨吸收中的作用机制尚不十分清 楚， 本实验在破骨细胞和成骨细胞联合培养中发现， 0 . I n g / n il 以上的I L - 甲可以明显增加象牙片上骨 吸收陷窝的数目和面积， 但对单纯破骨细胞培养却 缺乏明显刺激作用。因而本研究提示: 成骨细胞是 介导I L -I 刺激骨吸
11、收作用的重要细胞o I L一工 首 先作用于成骨细胞， 刺激其合成和分泌细胞因子或 刺激因子以旁分泌调节方式或者通过细胞间连接、 接触以直接传递信息的方式来促进破骨前体细胞的 分化成熟和成熟破骨细胞的活化， 从而发挥其促进 骨吸 收的 作 用囚。 本实验结果为 I L- I 的刺激骨吸收作用提供了 有力证据， 并为成骨细胞作为骨代谢研究和基因治 疗载体以及体内阻断 比一I 的释人成为一 种新的骨 质疏松症治疗手段奠定了一定的理论基础。 参考文献 S u d a 丁 汪 ) d a g a w a I . N a k a m u t a T . e t a l . M + lu la t i a
12、 ti o u o f o s t e o c le s t ? af f e r e n t im io n 妙lo c a l f a c t o rs . B - , 1 9 9 5 ; 1 7 ( s u p p 丁2 ) ; 8 7 5 - 9 1 5 K u t c h i , J . H e e t x h e J N M. ( k t e x l e s t ic In n , e e a o P t ia t ; i n v i t ro a n a ly , l s o f t h e r a t e o f r e e o r p t io n a n d r n i g
13、 mt S m t o f in d i v id u a l - cl as 巧 . lbl e ， 988:9:73 高建军 破骨细胞成熟和活化以及骨吸收机制 国外医学内分泌 学分研 1 9 9 8 ; 1 8 ( 2 ) : 5 7 -6 1 C o h e , 、 一 S o l a l M E, G c a n le t A M, D e - MA, e t , l P e ; p h e r a l b lo o d m m u n y t e c u lt u r e s u p e ma t m n s o f t n e u u p a u s e l w o m e n c
14、 a n in d u c e b o n e r e ero r p ti o n : in wl v e m e n t o f c o k m e s . J C l i n E n d cer in o l M e t a b . 1 9 9 3 ; 77: 1 6 4 8 -1 6 5 3 K ir o b l, R B . v - i c , 儿， B lred o w f ) C 7 . , t a 1 . k n t e r l, u k m I r e c e p to r m ; a k o n i m d e c r m - b o n e la a , a n d G
15、n x m t o c p t i a t i n o v a r ; e c w m f z e d . t s . J C G n h , - 1 . 1 9 9 4 汐3 : 1 9 5 9 - 1 9 6 7 H o - i u M C . C y ro k i n e a 5 m t d e s t r o g e n in h a r e : A t n io s t m p o m t i c e t t e c t, . S c ie n c e . 1 9 9 3 ; 2 6 0 ; 6 2 6 -6 2 9 ( ? 1 1 0 1 一 0 3 一1 2 收藕龙文荣审孩曾文军
16、编辑) ( 上接第5页) 增加， 其C y c l i n E / C d k 2 表达增强， 在分化的K 5 6 2 细 胞中. 伴随着D N A合成减少， 其C y c l i n D , / C d k 5 表 达增加， 说明在细胞从增殖向分化途径逆转时， 伴随 着一些特殊的C y c l i n / C d k 的表达， 提示这些C y c l i n / C d k 在调控细胞从细胞增殖进人分化的过程中发 挥 关键作用. 为进一步探讨苦参碱诱导K 5 6 2细胞分 化的分子机制提供了有力的实验依据。 木课题在香 港大学医学院生物化学系完成、 得到该系多位导师的指导和 支持. 特此致谢
17、! ) 参考文献 F n m u【 C y c lin d e p e n d e nt k i n - re g u l a ti o n . C u r r e n t Op i n io n in C e l l Ho l o g y . 1 9 9 5 0: 7 7 3 - 7 8 0 张 莉萍 蒋纪 恺 谭 荣安， 等 苦参玻对K 5 6 2 细胞诱导分化作 用 的机制研究 中华血液学杂志, 1 9 9 9 ; 6 Wh i e e h e a d T P , T t -p e G H G , C a t e r T I N . Enhanced I -i n -e n c e p
18、r o c e d u r e f o r s e n s i t iv e d . - u t a t io n o f p e ro x id - - l h e l le d c ant R a t e s in in m m n o a e yN W t ., I 卯3 ; 3 0 5 : 1 5 8 Z h a n R L . H r o m c h a k R , B lo c h A . D i f f e r e n t ia l e x p r e s io n 。 p r o t e in s r e g u l a t i n g c e ll c y c le p ro
19、 g r e s s io n i n g ro w 山 v a . d if f e r e t n ia t io n 8 : 1 7 7 2 -口 既 I k bb a s h i Y, K n d o h T. Ma t s u r n i n e A, e t a l . J B l o l C h e w, 1 9 9 5 ; 2 7 0 ; 2 3 0 3 1 一2 3 0 3 7 P a g e n o M, T h a x k- A M, T a n gy S W, e t a l G c as e . D e , 1 9 9 1 ; 8 ; 1 6 2 7 一1 6 3 9
20、 ( 2 0 0 0 一 0 8 一 0 1 IMA * Wd i f ti 5 彭WO W 万方数据 中国现代医学杂志 疏松症等高转换型代谢性骨病的主要原因。破骨细 胞来源于单核巨噬细胞系统的造血干细胞， 并在巨 噬细胞集落刺激因子( M一 C S F ) , 白细胞介素口1 ) 一 3 和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子( G M一C S F ) 的 诱发下能演变为成熟的破骨细胞f l ; 。 破骨细胞 的典型特征为多核、 富含T R A P 、 有丰富的降钙素受 体以及在骨薄片上可形成骨吸收陷窝等l 2 1 。本实 验采用新生大鼠长骨机械分离方法， 并通过活体观 察、 贴壁细胞 T R A P
21、特异性染色以及典型骨吸收陷 窝的形成， 证实所培养的细胞具有明显的破骨细胞 特征 实验研究表明， 成骨细胞在破骨细胞的诱导和 活化过程中发挥重要作用。血源单核前体细胞分化 发育成破骨细胞是在成骨细胞通过分泌细胞因子所 提供的微环境中和胞膜上破骨细胞分化因子直接指 导 下完成的 l i a同样， 在破骨细胞性骨吸收过程 中， 成骨细胞则通过骨形成中分泌的基质活性分子 如骨钙素、 骨桥蛋白等来调控破骨细胞的移行粘附， 皱折缘形成以及泌酸和溶酶体酶释放等功能D J I L 一I 主要来源于单核细胞和巨噬细胞， 具有较强 的刺激骨吸收活性和抑制骨形成作用。研究发现， 绝经后妇女来源的外周血单核细胞培养
22、上清液具有 较强的骨吸收活性， 而补充 比一I 中和抗体后则可 抑制 该培养上清的骨吸收活性f4 i 。另外， 体内注 射I L 一I 受体拮抗剂， 能阻止去势大鼠的骨质丢失。 而且 作用效果与 使用雌激素治疗相似 川。以上结 果提示， I L -硬 在绝经后骨质疏松症的发生中起重 要作用。比一1 在骨吸收中的作用机制尚不十分清 楚， 本实验在破骨细胞和成骨细胞联合培养中发现， 0 . I n g / n il 以上的I L - 甲可以明显增加象牙片上骨 吸收陷窝的数目和面积， 但对单纯破骨细胞培养却 缺乏明显刺激作用。因而本研究提示: 成骨细胞是 介导I L -I 刺激骨吸收作用的重要细胞o
23、 I L一工 首 先作用于成骨细胞， 刺激其合成和分泌细胞因子或 刺激因子以旁分泌调节方式或者通过细胞间连接、 接触以直接传递信息的方式来促进破骨前体细胞的 分化成熟和成熟破骨细胞的活化， 从而发挥其促进 骨吸 收的 作 用囚。 本实验结果为 I L- I 的刺激骨吸收作用提供了 有力证据， 并为成骨细胞作为骨代谢研究和基因治 疗载体以及体内阻断 比一I 的释人成为一 种新的骨 质疏松症治疗手段奠定了一定的理论基础。 参考文献 S u d a 丁 汪 ) d a g a w a I . N a k a m u t a T . e t a l . M + lu la t i a ti o u o
24、 f o s t e o c le s t ? af f e r e n t im io n 妙lo c a l f a c t o rs . B - , 1 9 9 5 ; 1 7 ( s u p p 丁2 ) ; 8 7 5 - 9 1 5 K u t c h i , J . H e e t x h e J N M. ( k t e x l e s t ic In n , e e a o P t ia t ; i n v i t ro a n a ly , l s o f t h e r a t e o f r e e o r p t io n a n d r n i g mt S m t
25、 o f in d i v id u a l - cl as 巧 . lbl e ， 988:9:73 高建军 破骨细胞成熟和活化以及骨吸收机制 国外医学内分泌 学分研 1 9 9 8 ; 1 8 ( 2 ) : 5 7 -6 1 C o h e , 、 一 S o l a l M E, G c a n le t A M, D e - MA, e t , l P e ; p h e r a l b lo o d m m u n y t e c u lt u r e s u p e ma t m n s o f t n e u u p a u s e l w o m e n c a n in d
26、 u c e b o n e r e ero r p ti o n : in wl v e m e n t o f c o k m e s . J C l i n E n d cer in o l M e t a b . 1 9 9 3 ; 77: 1 6 4 8 -1 6 5 3 K ir o b l, R B . v - i c , 儿， B lred o w f ) C 7 . , t a 1 . k n t e r l, u k m I r e c e p to r m ; a k o n i m d e c r m - b o n e la a , a n d G n x m t o
27、 c p t i a t i n o v a r ; e c w m f z e d . t s . J C G n h , - 1 . 1 9 9 4 汐3 : 1 9 5 9 - 1 9 6 7 H o - i u M C . C y ro k i n e a 5 m t d e s t r o g e n in h a r e : A t n io s t m p o m t i c e t t e c t, . S c ie n c e . 1 9 9 3 ; 2 6 0 ; 6 2 6 -6 2 9 ( ? 1 1 0 1 一 0 3 一1 2 收藕龙文荣审孩曾文军编辑) ( 上接第
28、5页) 增加， 其C y c l i n E / C d k 2 表达增强， 在分化的K 5 6 2 细 胞中. 伴随着D N A合成减少， 其C y c l i n D , / C d k 5 表 达增加， 说明在细胞从增殖向分化途径逆转时， 伴随 着一些特殊的C y c l i n / C d k 的表达， 提示这些C y c l i n / C d k 在调控细胞从细胞增殖进人分化的过程中发 挥 关键作用. 为进一步探讨苦参碱诱导K 5 6 2细胞分 化的分子机制提供了有力的实验依据。 木课题在香 港大学医学院生物化学系完成、 得到该系多位导师的指导和 支持. 特此致谢! ) 参考文献
29、F n m u【 C y c lin d e p e n d e nt k i n - re g u l a ti o n . C u r r e n t Op i n io n in C e l l Ho l o g y . 1 9 9 5 0: 7 7 3 - 7 8 0 张 莉萍 蒋纪 恺 谭 荣安， 等 苦参玻对K 5 6 2 细胞诱导分化作 用 的机制研究 中华血液学杂志, 1 9 9 9 ; 6 Wh i e e h e a d T P , T t -p e G H G , C a t e r T I N . Enhanced I -i n -e n c e p r o c e d
30、 u r e f o r s e n s i t iv e d . - u t a t io n o f p e ro x id - - l h e l le d c ant R a t e s in in m m n o a e yN W t ., I 卯3 ; 3 0 5 : 1 5 8 Z h a n R L . H r o m c h a k R , B lo c h A . D i f f e r e n t ia l e x p r e s io n 。 p r o t e in s r e g u l a t i n g c e ll c y c le p ro g r e s
31、s io n i n g ro w 山 v a . d if f e r e t n ia t io n 8 : 1 7 7 2 -口 既 I k bb a s h i Y, K n d o h T. Ma t s u r n i n e A, e t a l . J B l o l C h e w, 1 9 9 5 ; 2 7 0 ; 2 3 0 3 1 一2 3 0 3 7 P a g e n o M, T h a x k- A M, T a n gy S W, e t a l G c as e . D e , 1 9 9 1 ; 8 ; 1 6 2 7 一1 6 3 9 ( 2 0 0 0 一 0 8 一 0 1 IMA * Wd i f ti 5 彭WO W 万方数据