碱性成纤维细胞生长因子对兔甲状软骨细胞的影响.pdf

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1、1 4 医药论坛杂志2 0 0 5 年5月第2 6 卷第1 0 期 论著 碱性成纤维细胞生长因子对兔甲状 软骨细胞的影响 杨彩荣马 藉马季青梁传余， 河南省人民医院耳鼻咽喉科郑州市 4 5 0 0 0 3 摘要目 的 研究碱性成纤维细胞生长因 子( b F G F ) 对兔甲状软骨细胞的影响， 探索软骨细胞体外扩增 方法， 为软骨组织工程提供理论依据。 方法 分离 兔甲 状软骨细胞， 分4 组培养， 每组用含不同 成分的培养基。 第1 组: 只用D M E M培养 基; 第2 组: D M E M培养基+ 1 0 %小牛血清; 第3 组: D M E M培养基加b F G F ( 1 O n

2、g / m l ) ; 第4 组: D M E M培养基+ 1 0 %小牛血清十 b F G F ( I O n g / m l ) 。采用软骨细胞计数观察各组细胞增殖情况。结果 在培养基成分相同时， 补充b F G F 组比未补充组细胞数目 明显增多， 即第3 组多于第1 组， 第4 组多于第2 组。 结论b F G F 能够促进单层培养中兔甲状软骨细 胞的增殖， 在软骨组织工程细胞增殖阶段， 可能成为软骨细胞体 外大量扩增的主要生长因子之一。 关键词碱性成纤维细胞生长因 子甲 状软骨 中图分类号: R - 3 3 2文献标识码: A 软骨细胞细胞增殖组织工程 文章编号: 1 6 7 2 -

3、 3 4 2 2 ( 2 0 0 5 ) 1 0 - 0 0 1 4 - 0 2 Ba s i c F i b r o b l a s t Gr o wt h F a c t o r P r o mo t e s P r o l i f e r a t i o n o f R a b b i t T h y r o i d C h o n d r o c y t e s Y A N G C a i r o n g , M A S o n g , M A J i q i n g , e t a l H e n a n P r o v i n c i a d P e o p l e s H o s

4、 p i t a l , Z h e n g z h o u 4 5 0 0 0 3 ， C h 王 几几 A B S T R A C T O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h e i n fl u e n c e o f b a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( b F G F ) o n t h e p r o l i f e r a t i o n o f r a b b i t t h y r o i d c h o n d r o c y t e s a n

5、 d t o s e e k t h e c e l l e x p a n s i o n m e t h o d s o f c h o n d r o - c y t e s i n v i t r o f o r c a r t i l a g e e n g i n e e r i n g . Me t h o d s T h e r a b b i t t h y r o i d c h o n d r o c y t e s w e r e i s o l a t e d a n d p l a t e d i n t o 4 g r o u p s o f D u l b e

6、c c o m o d i f i e d E a g l e m e d i u m: g r o u p 1 ， D u l b e c c o m o d i f i e d E a g l e m e d i u m ( D M E M) o n l y ; g r o u p 2 ， D M E M a n d 1 0 % n e w b o rn c a l f s e r u m ; g r o u p 3 ， D M E M a n d b F G F( 1 0 n 岁 m l ) ; g r o u p 4 ， D M E M a n d a c o m b i n a t

7、i o n o f 1 0 % n e w b o r n c a l f s e r u m a n d b F G F ( l 0 n 剔M I ) . T h e n u m - b e r o f c h o n d r o c y t e s w e r e u s e d a s i n d i c a t o r s o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . R e s u l t s T h e c e l l c o u n t s i n t h e g r o u p s s u p p l e m e n t e d b F G F

8、 w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n t h e g r o u p s u n s u p p l e m e n t e d w h e n t h e m e d i u m c o m p o s i t i o n w e r e t h e s a m e . N a m e l y t h e c e l l c o u n t s i n g r o u p 3 w e r e h i g h e r t h a n t h a t i n g r o u p 1 a n d g r

9、 o u p 4 h i g h e r t h a n g r o u p 2 . C o n c l u s i o n b F G F c a n a u g m e n t t h e p r o l i f e r a t i o n o f r a b b i t t h y r o i d c h o n - d r o c y t e s i n m o n o l a y e r c u l t u r e a n d c a n b e e m p l o y e d t o a c c e l e r a t e t h e c h o n d r o c y t e g

10、 r o w t h d u r i n g t h e a m - p l i f i c a t i o n s t e p o f c a r t i l a g e e n g i n e e r i n g . K E Y WO R D S B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ; T h y r o i d c a r t i l a g e ; C h o n d r o c y t e s ; C e l l p r o l i f e r a - t i o n ; T i s s u e e n g i

11、n e e ri n g 喉气管狭窄的治疗是一个临床难题， 组织工 程的出现为喉气管重建带来了新的希望， 但是， 构 建组织工程软骨需要大量的种子细胞， 未来的人 类组织工程细胞来源可能仅仅是一次活检标本。 如何使种子细胞在体外大量扩增， 是组织工程解 决的关键问题之一。本实验研究碱性成纤维细胞 生长因子( b a s ic f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r , b F G F ) 对 兔甲状软骨细胞的影响， 探索软骨细胞体外扩增 的方法， 为喉损伤与修复提供理论参考。 1 四川大学华西医院耳鼻喉科成都市6 1 0 0 4 1 J o u

12、rna l o f Me d i c a l F o rum V o l 2 6 N o . 1 0 Ma v 2 0 0 5 1 5 1 材料与方法 1 . 1 材料 b F G F ( G I B C O , U S A ) ， 小牛血清( n e w - b o rn c a l f s e r u m , N C S ， 成都哈里生物工程有限公 司) , 1 1 型胶原酶( S i g m a , U S A ) , D M E M培养基和 胰蛋白酶( G I B C O , U S A ) 。 F A L C O N聚苯乙烯一次 性培养瓶和2 4 孔培养板。 1 . 2 兔甲状软骨细

13、胞的分离与培养无菌条件 下取4 周龄新西兰白兔甲状软骨， 经机械分离及 0 . 2 5 %胰蛋白 酶, 0 . 2 %1 1 型胶原酶联合消化， 获得 高成活率的甲 状软骨细胞， 加人D M E M培养基， 制 成 细 胞悬液， 调整细胞密度为5 x 1 0 8 / L ， 接种于 2 5 c m 2 培养瓶中， 于3 7 :C , 5 % C O : 培养箱中培养。 原代细胞汇合成单层后传代， 取第3 代软骨细胞作 实验用。 1 . 3 实 验分组 将 第3 代软骨细 胞按5 x 1 0 4 / 孔， 分 4 组接种于2 4 孔板， 各组细胞分别用含不同补充 成分的D M E M培养基培养。

14、第 1 组: 只用 D M E M 培养基， 不补充其它成分; 第2 组: D M E M培养基 + 1 0 %小牛血清; 第 3组: D M E M培养基 + b F G F ( 1 0 n 留M I ) ; 第4 组: D M E M培养基 + 1 0 %小牛血 清+ b F G F ( I O n 梦m l ) 。 1 . 4 软骨细胞计数每日 于倒置相差显微镜下 观察细胞生长情况， 各组细胞分别于培养第2 , 4 , 6 , 8 天， 取3 孔计数， 取其平均 值。 1 . 5 统计学处理采用S t u d e n t t 检验， 以P 0 . 0 5 为差异有统计学意义。 2 结果

15、各组软骨细胞计数结果见表 1 ， 可见除第i 组 细胞接种后无明显增殖外， 其余3 组细胞数目均较 接种时明显增多; 组间比较结果， 在培养基成分相 同时， 补充 b F G F组比未补充组细胞数 目明显增 多， 即第3 组多于第 1 组( P 0 . 0 1 ) ， 第4 组多于 第2 组( P 0 . 0 5 ) 。各组细胞活力均在%以 上。 绝大部分细胞变成梭形外貌。未补充b F G F 组， 细 胞呈圆形或多角形。 3 讨论 b F G F 最初是从牛脑垂体分离出来的， 是由 1 4 6 个氨基酸组成的多肤， 具有很强的促有丝分裂 活性。研究表明， 碱性成纤维细胞生长因子可促 进软骨细

16、胞增殖。但软骨细胞的组织来源不同， 对b F G F 反应也不同川， 因 此， 有必要研究b F G F 对 兔甲状软骨细胞的影响， 为喉软骨组织工程提供 理论基础。 b F G F 能使单层培养中甲状软骨细胞短期内 大量增殖， 接种后第4 , 6 , 8 d ， 在无血清存在时， b F G F 能使细胞数目 较接种时增加2 倍以上; 在有 血清存在时， 细胞数目 增加8 倍以上， 在软骨组织 工程细胞增殖阶段， b F G F 可能成为软骨细胞体外 大量扩增的主要生长因子之一。 我 们先前的 研究 发现， 兔甲 状软骨细胞在 培养至第4 代时， 有一半细胞变成梭形， 第6 代绝 大多数变成

17、梭形。本实验所用细胞为第3 代， 在培 养第3 d ， 补充b F G F 组软骨细胞已基本变成梭形， 软骨细胞提前出现“ 反分化” ， 说明b F G F 可能促进 了软骨细胞的反分化。软骨细胞出现反分化后， 其胶原合成类型从 II型变为 I 型。因此， 应用生 长因子促进软骨细胞增殖的同时， 应考虑到其对 种子细胞分化的影响。 b F G F 在有血清或无血清条件下均能够促进 兔甲状软骨细胞增殖， 研究表明， b F G F能抑制鼠 肋软骨细胞的分化， 它的促有丝分裂作用伴随着 II 型 胶 原 合 成的 下降 3 j 。 推测b F G F 的 促有 丝分 裂作用原理， 可能是通过抑制软

18、骨细胞的终末分 化。 参考文献 表 1 兔甲状软骨细胞计数结果( x土 、 ) 分组 平均细胞计数x 1 0 4 C e l l s / m l 第2 d 第 1 组 第 2 组 第3 组 第4组 4 ( 0 . 1 4 ) 8 ( 0 . 5 0 ) 9 ( 0 . 3 8 ) 7 ( 0 . 7 4 ) 第4 d 7 ( 0 . 5 0 1 4 ( 0 . 6 3 2 1 ( 1 . 1 5 4 8 ( 1 . 8 8 第6 d 4 ( 0 . 2 5 1 2 ( 0 . 7 6 2 3 ( 0 . 3 8 4 7 ( 0 . 6 3 第8 d 2 ( 0 . 2 5 ) 1 2 ( 0

19、. 2 5 ) 1 6 ( 0 . 7 6 ) 5 1 ( 1 . 3 8 ) L e e J D , H w a n g 0 , K i m S W, e t a l . P r i m a ry c u l t u r e d c h o n - d r o c y t e s o f d i f f e r e n t o r i g i n s r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o b F G F a n d T G F 一 (3 . L i f e S c i e n c e s , 1 9 9 7 , 6 1 ( 3 ) : 2 9 3 -

20、 2 9 9 杨彩荣， 梁传余， 李胜富， 等. 兔甲状软骨细胞体外培养 及生物学特性研究. 中国耳鼻咽喉颅底外科杂志， 2 0 0 2 , 8 ( 1 ) : 4 5 - 4 7 D u n h a m B P , K o c h R J . B a s i c f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r a n d i n s u l i n l i k e g r o w t h f a c t o r I s u p p o r t t h e g r o w t h o f h u m a n s e p - t a l c h o n d r o c y t e s i n a s e r u m - f r e e e n v i r o n m e n t . A r c h O t o l a r - y n g o l H e a d N e c k S u r g , 1 9 9 8 ， 1 2 4 ( 1 2 ) : 1 3 2 5 - 1 3 3 0 2 0 0 5 -0 3 - 1 1 收稿 相差显微镜下可见， 培养第3 d ， 补充b F G F 组