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1、中华烧伤杂志2 0 0 6 年4月第2 2 卷第2 期C h i n J B u r n s , A p r i l 2 0 0 6 , V o l . 2 2 , N o . 2 1 3 3 短 篇 - L 著 磷酸化S m a d 2 和S m a d 7 在增生性疲痕成纤维细胞中的表达 潘妹利天增李叶扬张涛梁氓 S m a d s 蛋白家族是近年来发现的转化生长因子( T G F ) R , 受体下游信号蛋白， 也是目 前公认的介导T G F - (3 , 胞内反应 的主要通路。笔者通过检测体外培养的增生性瘫痕成纤维 细胞( H S F ) 和正常皮肤成纤维细胞( N S F ) 中磷酸
2、化 S m a d 2 和抑制性信号介导子S m a d 7的表达差异， 拟探讨二者在增生 性瘫痕发病机制中的作用。 一、 材料与方法 1 . 细胞来源及分组: 因增生性瘫痕住院进行整形手术的 患者共6 例， 其中男3 例、 女3 例， 年龄I 一 3 5 岁， 瘫痕增生时 间3 - 6 个月。H S F 组标本取 自上述患者的瘫痕， 部位包括 上肢2 例、 面部4 例; N S F 组标本为相同患者手术后的残余 正常皮肤， 均经患者知情同意。两种标本分别采用组织块培 养法， 取第2 一 4代的成纤维细胞进行实验。 2 . 磷酸化 S m a d 2 和S m a d 7的定位: 分别取两种细
3、胞种植 于载玻片， 参照链霉亲和素一 生物素复合物( S A B C ) 试剂盒 ( 武汉博士德生物工程有限公司) 说明书进行实验， 以磷酸盐 缓冲液代替一抗， 设立相应的阴性对照。 3 . S m a d 2 和 S m a d 7 m R N A的表达: 采用逆转录聚合酶链 反应( R T - P C R) 法。S m a d 2 ( 4 2 9 b y ) : 上游引物: 5 - A T G C - C A C G G T A G A A A T G A C - 3 ; 下游引物: 5 - T T G A G C A A C G C A C T - G A A G G - 3 o S m
4、 a d 7 ( 4 3 3 b y ) : 上游引物: 5 - A G C A G A A A T C - C A A G C A C C - 3 ; 下游引物: 5 - C T G G C A G G A A G G G A A T A A G - 3 o 以甘油醛- 3 - 磷酸脱氢酶( G A P D ) 引物( 上海生工生物工程有 限公司) 为内参照， 用 I B A S 2 . 0图像分析系统( 德国 K o n t r o n 公司) 分析电泳结果， 用 目的基因与 G A P D的积分吸光度 ( I A) 值之比表示目的基因 m R N A的相对表达量。 4 . 磷酸化 S m
5、 a d 2和 S m a d 7蛋白表达: 采用蛋白质印迹 ( We s t e r n b l o t ) 法。常规提取蛋白， 以考马斯亮蓝法测定提取 蛋白浓度。经 1 0 0 g / L十二烷基硫酸钠一 聚丙烯酞胺凝胶 ( S D S - P A G E ) 电泳后转移至聚偏氟乙烯( P V D F ) 膜上， 分别加 入 1 : 1 0 0 0稀释的磷酸化 S m a d 2和 S m a d 7多克隆抗体， 4 过夜。加人 1 : 2 0 0 0辣根过氧化物酶( H R P ) 标记的羊抗兔 二抗， 室温作用 1 h ， 常规方法显影、 定影。杂交信号在图像 分析系统中进行吸光度(
6、A) 值分析。 5 . 统计学处理: 数据以x 1 表示， 应用 S P S S 1 0 . 0 统计 软件进行分析， 进行成组设计的t 检验。 二、 结果 1 . 磷酸化 S m a d 2和 S m a d 7定位: 磷酸化 S m a d 2在 H S F 组位于细胞核， 在 N S F组则主要位于细胞质中。S m a d 7在 N S F 组和 H S F 组均位于细胞核内。 2 . S m a d 2和 S m a d 7 m R N A的表达: R T - P C R产物电泳结 果显示， 两组细胞在4 2 9 , 4 3 3 及 3 0 0 b y 位置上均出现特异性 条带， 与预
7、期扩增片段的长度相符。提示为特异性 S m a d 2 , S m a d 7 与 G A P D c D N A 。两组 S m a d 2 , S m a d 7 m R N A结果比 较， 差异无统计学意义( P 0 . 0 5 ) 。见表 t o 表 1 不同细胞 S m a d 2和 S m a d 7 m R N A的 表达( I A值， x1 s ) 组别样本数 S ma d 2 . 6 4士0. 1 6 . 58士0. 1 8 S ma d 7 HS F组 N S F至 且 0. 2 7士0. 0 8 0. 31士0. 0 7 3磷酸化 S m a d 2和 S m a d 7
8、蛋白表达: 只能检测到少量 S m a d 2和 S m a d 7 ， 前者 H S F组含量高于 N S F组( P 0 . 0 5 ) 。见表2 0 表2 不同细胞磷酸化 S m a d 2 和S m a d 7 蛋白的 表达( A值， x土: ) 组别样本数磷酸化 S m a d 2 4. 4士2. 1 2 . 8士1 . 6 S ma d 7 HS F组 N S F组 2. 2 t0 . 4 2. 1士0. 5 注: 与 H S F 组比较， *P 0 . 0 5 ) ， 见表 1 ; 大面 积烧伤患者白细胞分类中除白细胞计数值差异无统计学意 义( P 0 . 0 5 ) 外， 中性
9、粒细胞和嗜碱粒细胞计数及比例差异 均有统计学意义( P 0 . 0 1 ) ， 见表2 0 讨论嗜碱粒细胞的细胞质中存在大小不等的嗜碱性 颗粒。五分类血细胞分析仪根据粒细胞形态、 内部结构、 核 质比、 胞内颗粒大小及紧密度等特征， 通过体积( v o l u m e ) 、 导 电性( c o n d u c t i v i t y ) 、 光散射( s c a t t e r ) 技术而达到分类目的。 大面积烧伤患者血液中中性粒细胞发生中毒性改变， 细胞质 内出现中毒颗粒， 其大小不等、 分布不均、 染色较深， 外观与 嗜碱性颗粒相似， 同时由于核分叶减少、 核固缩、 染色质呈圆 块状、
10、核质比失调， 令仪器不能正确区分中性粒细胞和嗜碱 粒细胞， 误将中性粒细胞计为嗜碱粒细胞， 从而造成嗜碱粒 细胞假性升高。分析仪法具有检测快速、 方便的特点， 但对 一些大面积烧伤患者进行白细胞分类时结果不够准确; 目测 计数法比较繁琐， 但比较准确， 排除了仪器对颗粒辨识不清 而误将中性粒细胞内的中毒颗粒计为嗜碱性颗粒的情况。 因此对于大面积烧伤患者， 在采用仪器法对其进行白细胞分 析的同时， 应做瑞氏染色进行手工分类， 以免给临床医师提 供错误信息， 影响患者治疗。 表 1 两种方法检测小面积烧伤患者白细胞分类结果比较( x士， 检测方法 标本数 ( 个 ) 白细胞计数 ( x 1 0 9
11、 / L ) 中性粒细胞计数 ( x 1 0 9 / L ) 中性粒细胞比例嗜碱粒细胞计数 ( x 1 0 9 / L ) 嗜碱粒细胞比例 分析仪法 显微镜 目测计数法 1 1士6 1 2士7 9土5 ， 士 6 0. 8 1 t 0 . 0 8 0. 7 8士0. 0 8 0. 70士0. 2 0 0. 8 0 士0. 3 0 0. 0 6 2土0. 0 0 8 0. 0 6 6 +0. 0 0 9 4242 表2 两种方法检测大面积烧伤患者白细胞分类结果比较( x士、 检测方法 标本数 ( 个) 白细胞计数 ( x 1 0 9 / L ) 中性粒细胞计数中性粒细胞比例嗜碱粒细胞比例 分析仪法 显微镜 目测计数法: : 2 5士9 2 5士8 x 1 0 9 / L ) 1 5士5 2 2士8 0. 6 0 t 0. 0 8 0. 9 2士0. 0 8 嗜碱粒细胞计数 ( x 1 0 9 / L ) 8. 1 0 0 士2. 8 0 0 0 . 8 0 0士0 . 0 2 0* 0.3 1 0 0 士0. 0 400 0. 0 3 2 0士0. 0 005 注: 与分析仪法比较， 。P 0 . 0 1 作者单位: 2 5 0 0 1 4 济南， 武装警察部队山东省总队医院检验科 ( 收稿日 期: 2 0 0 5 - 0 9 - 1 3 ) ( 本文编辑 : 赵敏)