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1、9 3 2中 华 麻醉 学杂志 2 0 0 5 年 1 2 月第 2 5 卷 第 12期C h i n 1 A n e s i h e s io l . D . . . . b , 2 0 0 5 . V o l 2 5 . N . . 1 2 论 著 摘 要 神经病理性痛大鼠脊髓背角神经元凋亡及 B a x 和B c l - 2 的表达 孑 L 明健胡兴国曾因明 早期的组织学研究表明外周神经损伤后脊髓背角抑制 性中间神经元可发生跨突触变性死亡，近年的研究采用 末端生脱氧核糖核普酸转移酶介导生物素标记( T U N E L ) 技 术 证 实 凋 亡 是 外 周 神 经 损 伤 后 脊 髓 神
2、 经 元 死 亡 的 重 要 方 式 ，。B -和 M- 2 是一对作用相反的凋亡调控蛋白， 在病 理状态下神经元凋亡中发挥重要的调控作用 一 。本研究拟 观察神经病理性痛大鼠脊髓背角神经元凋亡及凋亡相关蛋 白B a x 和B c l -2的表达 材 料 和 方 法 实验动物及分组键康成年雄性 S D大鼠2 8只， 休重 2 3 。 一 2 7 0 g ， 由徐州R学院实验动物，卜D 提供。将大鼠随机 分为空白对照组( n二4 ) , 假手术组( n二1 2 ) 和 C C I 组( n二 1 2 ) 0假手术组和C C l 组又按术后取材时间的不同分为三个 亚组( n =4 ) ， 分别为术
3、后 3 d亚组、 术后9d亚组和术后 1 4d 亚 组 动物模型制备按文献 4 的方法制作慢性坐骨神经压 迫性损伤( C C I ) 模, 腹腔注射( i . P) 戊巴比妥钠4 0 m g / k g 麻醉后， 暴露坐骨神经， 用3 .0丝线每间隔1 n n . 结扎坐骨神 经， 使神经外膜轻度凹陷， 但不阻断血供， 结扎时偶可见肢体 轻微抽动， 共结扎四道。手术时间 5 一8而。 。假手术组仅分 离皮肤、 肌肉， 不结扎坐骨神经 脊髓背角凋亡细胞的检测采用T U N E L标记法。假手 术组和C C I 各亚组、 空白对照组分别取4只大鼠. 1 %戊巴比 妥钠6 0 m g / k g ，
4、P深麻醉， 经升卞动脉依次灌注4 9 C 生理敖 水( 1 0 0 m l ) . 4 %多聚甲醛( 4 0 0 n 11 , 0 . 1 -11 L P B , p H 7 . 4 ) ,取 11 _ . 脊髓节段置于多聚甲醛中固定 6 1 ( 4 9C) ， 冰冻横断切片， 片厚4 0 p m 。切片经通透液( 0 . 1 % T n 1 u a X - 1 0 0溶于0 . 1 %构 椽酸溶液中) 通透处理5 m m ( 冰浴中) , P B S洗去通透液， 滴加 T U N E L反应混和液( 末端脱氧核糖核酸转移酶: 核有酸混和 液二1 : 9 ， 北京， 1 ， 山细胞凋亡原位检测
5、试剂盒) ， 3 7C 孵育6 0 . m, P B S冲洗后加人转化齐 U P O D 3 7 C孵育3 0 m in , D A B 4 b . 色 5- 1 0 m i n 。冲洗、 酒精梯度脱水， 一甲苯透明， 中性树胶封 片. 光镜下观察并计数阳性细胞数( 细胞核棕褐色染色) ， 阴 性 对 照 以 蒸 馏 水 代 替 末 端 脱 氧 核 糖 核 有 酸 转 移 酶 . 未 见 阳 性 基 金 项 口:江 苏 省 省 级 高 校 重 点 实 验 室 开 放 课 题 资 助 ( K J S 0 3 0 8 3 ) 作 者单位 : 2 2 1 0 0 2 徐 州医学 院江 苏省麻 醉医学
6、 研究所 ( 孔 明 健 、 曾因明 ) ; 湖南 省桃源 县人 民医院麻 醉科( 胡兴 国) 染色的神经兀。每只动物取5张脊髓切片， 在 O l y m p u s 光学 显微镜F计数脊髓背角阳性细胞数，计算凋亡细胞对数转 换值L 凋亡细胞对数转换值=I A g ( 凋亡细胞数+1 0 ) 脊髓背角 B 。和 B c l- 2阳性神经元计数及灰度分析采 用免疫组织化学法。上述切片经 。0 1 m m o l / L P B S漂洗后， 依次加人3 %H仇, 3 0 %封闭血清封闭1 0 m m， 加人一抗( B - : 1 8 0 0 , B d - 2 : 1 : 4 0 0 ， 均为兔抗
7、) 4 C孵育 2 4 h 。 P B S冲洗后， 加 入滴加生物素标记的二抗( 羊抗兔 1 薛) 3 7 C 孵育 I h 后 P B S 漂洗=次， 滴加辣根酶标记链霉卵白素, 3 7 T孵育 I h 后 P B S 漂洗， D A B显色， 酒精梯度脱水， 一甲苯透明， 中性树胶封片， 每只动物切取5张脊髓切片， 光镜 卜 计数阳性细胞( 细胞核 棕色染色) 。阴性对照实验中， 用 P B S 代替一抗或二抗 未见 阳性细胞。应用 L E I C A Q Win图像处理和分析系统( 英国 L e i s 。 公司) 进行染色深度分析， 用平均灰度表示 平均灰度 二背景灰度一测量点灰度)
8、脊髓背角神经元 B u 、和B O - 2蛋白表达采用免疫印迹 ( We a l , - b l耐 方法。大鼠在戊巴比妥钠( 6 0. 副k g , i . p . ) 深麻 醉下急性处死， 迅速取出I , I 脊髓节段， 将标本放置在冰盆 中。 冠状面将脊髓等分为前后各半侧， 将后半侧脊髓 移至液 氮保存。将脊髓组织在预冷的蛋白质抽提缓冲液 ( m m o l / L ) 1 0 H E P E S , I N 8 , V 仇 、 1 . 5 M g C I,、 1 0 K C I , 5 0 N . F , 0 . 1 E D T A, 0 . 1 E C T A, 0 . 5 P M S
9、 F , 1 D it h io t h re it o l 和0 . 0 2 % 蛋白酶抑制剂 wc k t a il I p H 7 . 9 中低温匀桨， 静置 1 0 m m， 加人9 0 闪l 0 % N P - 4 0后剧烈震荡3 0 s , 4 9C 8 0 0 r / m in离心1 5m in , 取上清液， 即为 细胞浆成分。按 B r a d f r d 法测定样本蛋白浓度， 加人4倍样 本缓冲液( 2 5 0 m m n l / I . T r is / H C I , p H 6 . 8 , 0 . 0 1 %考马斯亮兰， 8 % S D S , 2 0 0 m m o
10、 l/ L蔗糖和3 0 0 m m n l/ L D i th in th re i m l ) , 9 5 水 浴5 m m。取等量样本加至 1 2 % S D S - 聚丙烯酞胺凝胶恒压电 泳， 压缩层胶8 0 V ， 分离胶 1 5 0 V o半干法将蛋白转移至硝酸 纤维素膜。3 %牛血清封闭 1 h后加一抗( B . . : 1 : 1 0 0 0 , B c l - 2 : 1 : 6 0 0 , 免抗) 4 0 C 孵育过夜， T B S T冲洗, 1 .5 m m， 共3次， 加人 碱性磷酸酶标记的二抗( 11 0 0 0 ) , 室温摇床孵育 1 . 5 h . T B S T
11、 冲洗3 x1 5 m in ， 用N B T / B C I P检测反应条带， 计算灰度和面积 乘积为蛋白相对表达丰度， 空白对照组为1 0 0 % 统计学处理采用S P S S 1 1 .0统计软件，计量资料以均 数士标准差( 王士s ) 表示， 组内比较采用双因素方差分析， 组 间比较采用单因素方差分析， P 0 . 0 .5为差异有统计学意 义 。 中华麻 醉学杂志 2 0 0 5 年 1 2 月第 25 卷第 1 2 期C h in J A - - l,e e io l, D e c e m b e r 2 0 0 5 , V o l 2 5 , N o . 1 2 9 3 3 表2
12、 各组术后脊髓背角B -和 M- 2阳性神经元计数和灰度分析的比较( n =4 , z士: ) B - B c l - 2 组别阳性细胞数平均灰度阳性细胞数平均灰度 0 d 3 d 9 1 4 d 0 d 3 d 9 d 1 4 d 0 d 3 d 9 d 1 4 d 0 d 3 d 9 d 1 4 d 空 白 对 照 组14 】 空 3 2 假 手 术组 一 : : 一一2，。 C 口组 1 3 . 2 3 37 7 93土 1 3 6 子口 1 5 . 5 士 2 6 1 4 7. 2 x 1 1 2 2 4 x 29 7 9 6 士 1 3吕 “. 9J 士 26 2 94士 60 .
13、84士 O ， 3 3 . 0+- 6 2 . 甘 6B 士 2 7 5 4 士 2 ! 6I 士 L2 6 0. 1士 ， 9 “ 66 士 3 2 7 3 . 2 x 92 . 1 0 . 5 士 2. 4 1 3 . 6 : 4 4 1 2 士 2 3 多 0土 5 4 二 I L9: 2 . 6 2 39土 4 . 4 母 恤洲如39 与空 白对照组 比较 . P 0 . 0 1 与 假手术组 比较 . , P 0 . 0 1 结果 细 胞 凋 亡 的 比较空 白对 照 组 、 假 手 术 组 各 亚组 未 见 或 偶见凋亡细胞; 与空白对照组和假手术组各亚组比较， C C I 各亚组
14、的凋亡细胞增多( 尸 。0 1 ) ， 术后 9d 亚组细胞凋亡 达 高 峰 ， 术 后 1 4d 亚 组 细 胞 凋 亡 降 至 术 后 3d 水 平 。见 表 t o 表 I各 组 术 后 脊 髓 背 角 细 胞 凋 亡 的 比较 ( 。二 4 . z士、 ) 组别0 d 3 d 9 d 1 4 d 空 白对 照 组LO U n 0 . 0 1 8 假手 术组一1 .0 17 土 0 . 0 3 1 1 .0 10 土 0 . 0 1 3 1 .0 0 7 土 0 .0 1 3 C C I 组一1 . 19 1 士 0 . 0 4 3 ; 1 .3 6 7 士 0 . 0 9 8 毒1 .
15、 17 4 土 0 . 0 74 ; 与 空 自对照组 比较 ， “ P 0 . 0 1 与 假 于术组 比较“ P 0 . 0 1 形 态 学 观 察空 白对 照 组 、 假 手 术 各 亚 组 可 见少 量 B a x 阳性 神 经 元 ， 胞 浆 着 色 ， 染 色较 浅 ; 与空 白对 照 组 和 假 手 术 组 各 亚 组 比较 ， C C I 各 亚 组 B a x 阳 性 神 经 元 增 加 ， 平 均 灰 度 升 高。空白对照组、 假手术各亚组及C C I 术后3d亚组偶见 B c l -2阳性神经元， 胞浆着色， 染色浅; 与空白对照组和假手 术组各亚组和C C I 术后 3
16、 d亚组比较，C C I 术后 9d亚组和 C C l 术 后 1 4 d 亚 组 B c l -2阳 性 神 经 元 增 加 ， 平 均 灰 度 升 高 ( P 0 .0 1 ) 见 表 2 B e x 和 B c l - 2 蛋白表达的比较与假手术各亚组 比较， C C I 术 后 3 d , 9 d 和 1 4 d亚 组 B a x 蛋 白 表 达 增 高 ;C C I 术 后 9 d和1 4d 亚组 B c l - 2 蛋白表达增高( P0 . 0 1 ) ， 见表3 表 3 假 手 术 组 和 C C I 组 术 后 脊髓 背 角 神 经 元 B a x和 B d - 2蛋 白 表
17、达 的 比较 ( rz=4 , x士s ) B a x B c l - 2 组 别 3 d 9 d 1 4 d 3 d 9 d 1 4 d 假 手 术 组o s s t 0 12 L I0 : 0.2 5 0 .91 e 0 10 0 .91 : 0 11 朋兰 O A L m t 0 .10 田 组2 1 1 1 : 0 s 1 4 . 7 2 : 0 b 2 . 9 1 e 0 .4 1 1 6 f6 : 0 . 12 L A a 0 . b 2 . 1 5 e 0 . 2 4 与假 手术组 比较 ， “ 尸 0 0 1 关蛋白R a x和B c l- 2的调控。 研究显示在结扎后 7 一
18、1 0 d , 伤害性热、 化学和机械性刺 激损伤侧后足能引起痛觉过敏和触诱发痛 l o C c l 或外周 神经轴 突切断均 能引起 脊髓背 角神 经元发生 变性 W h it - i d 。 等 2 1 应用T U N E L 技术研究证实在外周神经损伤后 脊髓中可发现凋亡细胞， 预先给予N M D A受体拮抗剂 M K 8 0 1 能延缓热和机械性痛觉过敏的出现， 并缩小成年鼠脊髓背角 轴突切断术后神经元凋亡的范围。提示在神经病理痛模型 中脊髓背角神经元的凋亡在病理痛的形成过程中可能发挥 重 要 作 用 B -蛋白加速细胞的死亡， 3 3 : 8 7 - 1 07 5 N t id d le t ,m G , N - ; ， D a v i e s A B - p ro m o te s n e u ro n a l - v it a l a n d a n ta g o n iz e s th e s u o iv a l e ff e c t s o f - - ,I- p h i, h m to n . D e v e l o p a c o t , 1 9 9 6 , 1 2 2 沈习 5 一 7 0 1 ( 收稿 日 期 : 2 0 0 5 - 0 3 - 1 5 ) ( 本 文 编 辑 : 魏 津 平 )