神经节苷脂GM-1对大鼠缺血性脑损伤保护作用的实验研究.pdf

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1、.3 5 . 神经节昔脂 G M- 1 对大鼠缺血性脑损伤保护作用的实验研究 韩雪梅， 陈佳俊， 邵延坤( 吉林大学中日 联谊医院神经内科， 吉林长春1 3 0 0 2 1 ) 【 摘要 目的: 研究神经节昔脂G M- 1 对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及F a s , B c l - 2 表达的影响。方法: 建立全脑缺血再 灌注模型， 应用二苯胺法和免疫组织化学方法观察脑缺血后3 h , 6 h , 2 4 h 脑组织D N A裂解率变化及F a s , B c l - 2 表达， 以及G M- 1 给药 后的变化。 结果: 随着再灌注时间的延长， D N A裂解率变化明显增加， 2 4

2、h 达高峰， F a s 蛋白表达于再灌注6 h 达高峰， B c l - 2 表达于再灌 注3 h 达高峰， 以后逐渐呈下降趋势; G M- 1 给药组相应时间点的D N A裂解率及F a s 蛋白表达明显减少， B c l - 2 表达增加。 结论: G M- 1 能抑制脑缺血再灌注后细胞凋亡的发生， 对脑缺再灌注损伤具有明显的保护作用。 关挂词 l神经节昔脂G M - 1 ; D N A裂解率; F a s 蛋白B c l - 2 蛋白 中图分类号: R - 3 3 2文献标识码: A文章编号: 1 0 0 4 - 0 4 1 2 ( 2 0 0 4 ) 0 2 - 0 0 3 5 -

3、0 3 E f f e c t s o f G M- 1 o n t h e D N A s p l i t t i n g r a t e a n d t h e e x p r e s s i o n o f F a s a n d B c l - 2 p r o t e i n i n r a t f o l l o w i n g c e r e b r a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o n i n j u r y H A N X u e - n +e i , C H E N J i a n - j u n , S H A 0 Y ，- k

4、 u n ( D e p a rt m e n t o f N e u r o s u r g e r y , C h i n a - J a p a n U n i o n H o s p i t a l o f J i l i n U n i v e r s i t y , C h a n g c h u n 1 3 0 0 3 1 , C h i n a ) A b s t r a c t : O b j e c t i v e T o s t u d y t h e n e u r o p r o t e c t i v e e ff e c t s o f g a n g li o

5、s i d e G M一 1 a n d i t s e ff e c t s o n D N A s p li t t i n g r a t e a n d t h e e x p r e s s i o n o f F a s a n d B c l - 2 p r o t e i n . Me t h o d I n t h e a n i m a l m o d e l o f g l o b a l c e r e b r a l i s c h e m i a r e p e r f u s i o n ,u s i n g i m m u n o h i s t o 一 c h

6、 e m i s t ry m e t h o d , t h e a u t h o r s o b s e r v e d t h e c h a n g e o f D N A s p li t t in g r a t e a n d t h e e x p r e s s i o n o f F a s a n d B c l - 2 p r o t e i n a t 3 h , 6 h ,2 4 h a f t e r r e p e r f u s i o n a n d c h a n g e a f t e r G M一 1 w a s a d m i n i s t e

7、r e d . R e s ul t s Wi t h t h e p r o l o n g i n g o f r e p e r f u s i o n t i m e , D N A s p li t t i n g r a t e i n - c r e a s e d , a n d p e a k e d a t 2 4 h a f t e r r e p e r f u s i o n .T h e e x p r e s s i o n o f F a s p r o t e i n p e a k e d a t 6 h a f t e r r e p e r f u s

8、i o n . T h e e x p r e s s i o n o f B c l - 2 p r o t e i n p e a k e d a t 3 h a f t e r r e p e r f u s i o n ,a n d g r a d u a ll y d e c r e a s e d . T h e d a m a g e o f G M- 1 g r o u p w a s l e s s t h a n t h a t i n t h e r e l a t i v e t i m e o f N S g r o u p , a n d t h e e x p r

9、 e s s i o n o f F a s r e d u c e d , t h e e x p re s s i o n o f B c l - 2 i n c r e a s e d . C o n c l u s i o n G M- 1 c a n i n h i b i t t h e a p o p t o s i s o f c e r e - b r a l i s c h e m i a , s o i t h a s n e u r o p r o t e c t i v e e ff e c t s o n c e r e b r a l i s c h e m i

10、a re p e r f u s i o n刘u ry . K e y w r o d s . G a n g l i o s i d e G M- 1 ; D N A s p li t ti n g r a t e ; F a s p r o t e i n ; B c l - 2 p r o t e i n 神经节昔脂 G M- 1 是细胞膜的重要成分之一， 在哺乳动物 的神经组织中含量特别丰富。近年的研究提示外源性G M- 1 促 进神经细胞生长并减轻神经细胞损伤及细胞的凋亡过程。本文 主要探讨 G M- 1 的脑保护作用及其抑制神经细胞凋亡的可能作 用机制。 1 材料与方法 1 . 1

11、 实验动物与分组: 健康雄性Wi s t a r 大鼠4 0 只， 体重( 2 2 0 1 5 0 ) g ， 鼠 龄3 - 4 个月， 由 原白 求恩医科大学实验动物中心提供。 大鼠随机分成8 组， 每组5 只。I 组: 假手术对照组; II 组: 单纯 缺血3 0 m i n 组; I n 组: 脑缺血/ 再灌注组， 其中又根据再灌注时间 不同分为， H a : 再灌注3 h 组， I Q b : 再灌注6 h 组， I n c : 再灌注2 4 h 组; N组: G M- 1 组， 即G M- 1 腹腔注射组， 即G M- 1 腹腔注射 3 0 m i n 后脑缺血3 0 m i n -

12、再灌注3 h , 6 h , 2 4 h o Na 3 h , I V b 6 h , Wc 2 4 h , G M- 1 按2 0 m g / k g 腹腔注射给药， 其他实验组于同 一时间给予相同容量的生理盐水腹腔注射。G M- 1 由香港精优 作者简介: 韩雪梅( 1 9 7 1 - ) ， 女， 吉林省长春市人， 主治医生， 博士 研究生， 主要从事神经内科临床工作。 公司提供。 1 . 2 动物模型制备: 采用P u l s i n e ll 四血管闭塞法制备大鼠全脑缺 血再灌注模型( 具体制作步骤略) 。在相应的时间点断头取脑。 1 . 3 二苯胺法测定D N A裂解率: 取皮层

13、I O O m g 加0 .9 m i 裂解 液制成 1 0 % 匀浆，加人离心管中，反复冻融, 1 3 0 0 0 r / m i n 离心 1 5 m i n ，收集上清和沉淀，沉淀溶于 1 .5 m l T E ( 1 O n u n o l / L T r i s ; I m m o “ E D T A p H 8 .0 )中，上清管和沉淀管均加人 1 . 5 r r il 1 0 % T C A过夜， 1 3 O O O r / m i n离心 1 5 m i n 。沉淀加人 0 .6 n il 1 5 % T C A 1 0 0 水浴 1 5 mi n ， 冷却后 4 0 0 r

14、/ n u n离心 1 5 m i n ， 收集上清加人 2 倍体积的 二苯胺溶液( 1 .5 g 二苯胺加1 0 0 m 1 乙酸和浓硫酸， 临用 时取2 0 m 1 上述液加1 . 5 m 1 乙醛) 3 0 C。 反应 1 6 - 1 8 h ， 于6 0 0 n m处 用分光光度计测定其吸收值。D N A裂解率= 上清吸收值/(上清 吸收值十 沉淀吸收值) 。 1 . 4 光镜下形态学观察: 届时对大鼠断头取脑， 切取左侧半球， 用 4 %甲醛固定， 石蜡， H E染色， 光镜下观察。 1 . 5 免疫组化染色， 观察F a s 及B c l - 2 蛋白。 1 . 6 免疫组化染色步

15、骤: 石蜡切片脱腊至水: 3 % H Z O : 室温孵育 5 - 1 O m i n ， 以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗， P B S 浸 .3 6 . 3h6h4h ，山 泡5 m i n ， 抗原修复， 5 % -1 0 %正常血清封闭， 室温孵育 1 0 m i n 。倾 去血清，滴加适当比例稀释的一抗工作液， 3 7 9 0 孵育6 0 m i n , P B S 冲 洗， 5 m i n x 3 次。 滴加二抗工作液， 3 7 90孵育 1 0 - 3 0 m i n , P B S 冲 洗， 5 m i n x 3次。滴加辣根酶标记链雷卵白素( P B S 稀释) ,

16、3 7 9 0 孵 育1 0 - 3 0 m i n , P B S 冲洗， 5 m i n x 3 次， D A B显色，自 来水充分冲 洗， 复染， 封片。 1 . ， 图象分析及统计学处理: 将切片在显微镜下放大 1 0 0 倍， 随机选4 个视野， 分别测定灰度， 取平均值。实验数据由x 1 : 表 示。进行方差分析及t 检验。 2 结果 2 . 1 大脑皮质 DNA裂解率变化: 脑缺血后 DNA裂解率增加， 于再灌注2 4 h 达高峰。 G M- 1 治疗组与盐水对照组相比， 相同时 间点的D N A裂解率减少， 差异显著( P 0 . 0 1 ) ， 见表t o 裹1 D N 人裂

17、解率的变化 衰 3G M- 1 对B c l - 2蛋白的作用 n N S + 再灌注 1 5 0 . 5 9 9 9 13 . 2 6 4 1 5 4 . 0 5 4 6 1 4 . 5 1 3 1 6 4 . 9 5 3 2 1 2 . 9 7 5 G i n a t o n + 再灌注 1 4 2 . 3 7 9 肚6 . 5 0 1 m 1 4 5 . 0 2 3 5 1 6 . 1 6 9 2 1 5 6 . 5 3 5 1 士 7 . 0 5 5 ) P 0 . 0 5 , v s N S + 再灌注 3 h ; )P 0 . 0 5 , v s N S + 再灌注 6 h ; P

18、 0 .0 5 , v s NS + 再灌注 2 4 h . D NA裂解率 盐水对照组 C入叨 _1 N S + 再灌注 3 h 6 h 2 4 h 再滋注时间 2 4 h 5 0 . 5 7 6 2 8 1 0 . 0 3 2 9 6 0 . 6 6 7 3 6 1 0 . 0 4 3 0 9 0 . 6 7 8 0 2 1 0 . 0 5 0 8 4 G i n a t o n + 再灌注 0 . 4 9 5 9 3 1 0 . 0 3 3 4 户 0 . 5 4 7 0 4 1 0 . 0 2 4 0 9 6 0 . 5 5 7 2 8 士 0 . 0 3 5 5 1 匆 圈1 皮质D

19、 N A裂解率的变化 灰 度 1 5 51 5 0 尸jl乃 hh 月J6 OP 0 .0 5 , )P 0 . 0 1 , P 0 .0 0 1 , v s N S + 再灌注， 3 h ; .P 0 .0 5 , P 0 .0 1 , P 0 .0 0 1 , v s N S + 再灌注， 6 h ; )P 0 .0 5 , .P 0 . 0 1 , P 0 .0 0 1 , v s N S + 再淮注 2 4 h 2 . 2 病理组织学观察结果: 假手术组大脑皮质及海马神经细胞 形态正常， 无脑水肿; 单纯缺血组大脑皮质大部分神经细胞及海 马神经细胞体积变小呈三角形， 脑核浓缩深染， 结

20、构消失， 血管 周围间隙增宽， 大部分神经细胞周围出现间隙， 呈轻度脑水肿改 变;缺血/ 再灌注组神经细胞病变及脑水肿较单纯缺血组重， 出 现噬节现象及神经细胞脱失。 G M- 1 组神经细胞轻度肿胀， 脑水 肿程度轻( 见图1 ) o 2 . 3 免疫组化染色结果: 假手术组未见F a s , B c l - 2 表达。 单纯缺 血组、缺血/ 再灌注组的皮层及海马均有 F a s 及 B c l - 2阳性表 达。 阳性细胞为细胞膜及细胞浆呈棕黄色染色。 F a s 于再灌注6 h 阳性表达最多，且广泛分布于皮层及海马的神经细胞。再灌注 2 4 h 二者阳性细胞减少。缺血后有B c l -

21、2 表达， 再灌注3 h阳性 细胞明显增多， 阳性细胞为细胞膜及细胞浆呈棕黄色染色。 再灌 注6 h阳性细胞减少， 再灌注2 4 h 仅少数细胞阳性表达。G M- 1 组于盐水对照组相比相应时间点的F a s 表达减少， B c l - 2 表达增 加( 见图2 和图3 ) o 裹 2 G M- 1 对 F a s 蛋白的影响 盐水对旅组 CM -1 再注注时间 圈2 F a s 的灰度值 口 盐水对照组 .CM -1 勺050tj05O工，0 7766554433 ，上，且，且，人，几立，二，lji，几 灰度 3 h 6 h 2 4 h 再灌注时间 N S + 再滋注 2 4 h 5 1 4

22、 8 . 2 7 7 5 9 1 3 . 3 7 7 1 3 6 . 9 6 5 3 2 士 3 . 5 2 7 1 4 2 . 1 4 8 7 6 1 2 . 2 0 5 G u n t o n 十 再灌注 1 5 8 . 3 4 0 7 2 1 1 . 9 8 2 m 1 5 1 . 5 9 2 6 4 1 4 . 8 7 9 2 1 5 4 . 2 9 2 9 4 1 5 . 2 2 6 . P 0 .0 0 1 v s N S + 再灌注3 h ; )P 0 .0 0 1 。N S + 再灌注6 h ; P 0 . 0 0 1 v s N S + 再灌注 2 4 h . 2 . 4 图

23、像分析: G M- 1 组与盐水对照组相比， 相应时间点的F a s 蛋白免疫强度减弱， 即灰度值提高( P 0 . 0 1 ) ， 见表2 . G M- 1 组与 盐水对照组相比，相应时间点的B c l - 2 的免疫强度增强 ( P 0 .0 5 ) ， 见表3 , 圈 3 B c l - 2灰度值 3 讨论 神经节昔脂G M- 1 是一种酸性神经糖鞘脂， 外源性神经节 昔脂容易通过血脑屏障，以亲脂性的神经酞胺插入胞膜脂质双 分子层， 能模仿内源性的G M- 1 的某些功能， 发挥神经营养和保 护作用。 细胞凋亡后， 不仅D N A裂解率增加， 还有凋亡基因相关 蛋白的表达。 本实验结果显

24、示: 随着再灌注时间的延长， D N A裂 解率明显增加， 2 4 h达高峰， F a s 蛋白表达于再灌注6 h 达高峰， 再 灌注2 4 h 减少; B c l - 2 蛋白表达于3 h 达高峰， 以后逐渐呈下降趋 势。而G M- 1 给药组相应时间点的D N A裂解率减少， F a s 蛋白 表达减少， B c l - 2 表达增加病理组织学观察G M- 1 组细胞轻度 肿胀， 脑水肿程度轻。以上结果说明， G M- 1 不仅能通过细胞坏 死起作用， 还通过减轻细胞凋亡途径来发挥其脑保护作用。 G M- 1 能抑制持续性钙离子内流， 减轻脑水肿u 3 ， 保护N a - K - A T

25、P 酶活性2 3 ; 抑制延长的蛋白激酶C 伊 K C ) 转位3 3 ， 抑制兴奋性氨基 hh 飞6 .3 7 . 酸释放， 降低其神经毒性作用， 而不影响N MD A受体的功能a 3 ; 同时， 还能增强神经生长因子抑制凋亡的作用s 3 。 另外， 有报道表 明， G M- 1 能抑制C a s p a s e - 3 的 活性， 即细胞凋亡的 关键蛋白酶。 因此，本实验结果表明G M- 1 的抗凋亡作用不仅与以上作用有 关， 还可能与增强B c l - 2 蛋白表达， 减少F a s 蛋白表达有关。 总之， 脑缺血后， G M- 1 既能减轻神经细胞坏死程度， 又能 抑制细胞凋亡的产生，

26、为其治疗缺血性脑血管疾病提供更进一 步的临床依据。但其作用机制较复杂， 其中许多细节尚需进一步 探讨。 4 参考文献 1 K a r p i a k S E , L i Y S , M a h a d i k S P . G a n g l i o s i d e s r e d u c e m o r t a li ty d u e t o i s c h e m i a :p r o t e c t i o n o f m e m b r a n e f u n c t i o n 口 .S t r o k e , 1 9 8 7 ; 1 8 : 1 8 4 . 2 Ma s s e r

27、i n i M, P i tt o M, F e r r a r e tt o A , e t a l . C l y c d i p i d - p r o t e i n i n - t e r a c t i o n i n t h e m e c h a n i s m o f s i g n a l t r a n s d u c t i o n : s t u d i e s w i t h a p h o t o a c t i v a b l e g a n g li o s i d e a n a l o g u e口 .A c t s B i o c h e m P o l

28、 , 1 9 9 8 ; 4 5 ( 2 ) :3 9 3 . 3 S u n F Y , F a d e n A L .N MD A r e c e p t o r s m e d i a t e p o s t t r a n s m i - t i o n i n c r e a s e o f p r o t e i n k i n a s e C i n t h e b r a i n 口 .B r a i n R e s , 1 9 9 4 ; 6 6 1 : 6 3 . 4 F a v a r o n M,Ma n e r H ,A l h o H , e t a l . G a

29、 n g li o s i d e s p e r v e r t g l u - t a m a t e a n d k a i n a t e n e u r o t o x i c i ty i n p r i m a ry n e u r o n a l c u l t u r e o f n e o n a t a l r a t c e re b e ll u m a n d c o r t e x口 .P r o c N a t l A c a d S c i U S A , 1 9 8 8 ; 8 5 : 7 3 5 1 . 5 D u c h e m i n A M, N e

30、 ff N H ,N a d j i c o n s t a n d n o M.G M- i i n c r e a s e t h e c o n t e n t a n d m R N A N G F in t h e b r a in o f a g e d r a t s 日 . N e u r o R e p o r t , 1 9 9 7 ;8 ( 1 7 ) :3 8 2 3 . 收 稿日 期: 2 0 0 3 - 0 7 - 3 1 低分子肝素钙治疗急性脑梗死临床研究 王同聚， 郭镇荣( 中国人民解放军第3 7 1 医院神经内科， 河南新乡 4 5 3 0 0 0 ) 中圈分

31、类号: R 7 4 3 .3 3文献标识码: B文章编号: 1 0 0 4 - 0 4 1 2 ( 2 0 0 4 ) 0 2 - 0 0 3 7 -01 急性脑梗死( A C I ) 是临床常见的急危重症脑血管病， 致残率2 结果 很高， 早期采取及时有效的治疗至关重要。 现将我们采用低分子肝疗程结束后治疗组基本治愈 1 1 例， 显著进步2 5例， 进步 素钙( L MWH) 治疗急性脑梗死( C A I ) 的情况总结报告如下:1 7 例， 无效7 例。总有效率为8 8 . 3 %; 对照组基本治愈6 例， 显著 1 资料与方法进步 1 2 例， 进步2 0 例， 无效 1 8 例， 总

32、有效率5 7 . 1 %， 两组间比较 1 . 1 病例选择: 本组病人均为2 0 0 1 年 1 月 2 0 0 2 年 1 2 月在我有显著差异( P 0 . 0 5 ) 。治疗组仅有注射部位癖血， 无颅内或其他 院神经内科就诊的急性脑梗死患者， 诊断依据第四届全国脑血重要脏器出血。 管疾病会议的诊断标准n ， 经头颅C T或MR I 排除脑出血， 无抗3 讨论 凝禁忌者。人选共1 1 6 例， 随机分为低分子肝素钙治疗组( 简称L M WH是由非普通肝素( U F H) 解聚所得， 具有普通肝素的 治疗组) 和对照组， 发病至用药时间在2 d内。 治疗组6 0 例， 男3 6抗凝作用，

33、是一种新型的抗血栓形成药物。L MWH具有显著的 例， 女2 4 例， 年龄4 27 7 岁， 平均6 1 . 4 8 岁。对照组3 4 例， 女2 2抗F X a 活性， 促进血管内皮细胞释放T P A和前列环素样物质， 例， 年龄4 07 9 岁， 平均6 2 . 3 5 岁。 两组间病人年龄和病情严重程抑制纤溶酶原激活抑制因子， 抑制脑缺血后的炎症反应， 避免缺 度无显著差异。血半暗带最终发展成不可逆的梗死灶， 从而缩小梗死灶体积， 具 1 . 2 给药方法: 对照组应用低分子右旋糖醉5 0 0 m 1 十 复方丹参有直接的细胞保护作用t s j , L MWH具有延迟性抗血栓作用， 半

34、衰 2 0 m 1 静滴, 1 d / 次， 共用 1 0 d 。 治疗组在上述治疗基础上给予合肥期长， 临床应用方便， 影响血小板聚集小， 一般不需要实验室监 兆科公司生产的L MWH 0 .5 m l ( 5 0 0 0 A x a I 切 皮下注射， I 次/测。本研究表明， 治疗组疗效明显高于对照组， 两组统计学处理 1 2 h ， 共用 1 0 d 。两组均常规应用肠溶阿斯匹林、 钙拮抗剂、 脑细具有显著差异， 除个别病例注射部位皮肤粘膜出血外， 未见其他 胞活化剂治疗 1 4 d ， 对于合并脑水肿、 高血压等并发症者均给予与治疗有关的副作用，出凝血化验指标无明显异常，提示 相应处

35、理。L MWH治疗A C I 具有安全、 有效， 副作用少等优点， 值得临床推 1 . 3 观察指标: 两组治疗前后均作血小板计数、 凝血酶、 凝血酶广使用。 原时间、 纤维蛋白原测定， 观察期间视病情需要及时复查。疗程4 参考文献 结束后均复查头颅C T 或M R I o 1 1 中 华神经科学会， 中 华神经外科学会.各类脑血管 疾病诊断 1 . 4 疗效观察: 所有病例于治 疗前后按全国 第四 届脑血管疾病要点日 . 中 华神经科杂志， 1 9 9 6 ;2 9 ( 6 ) :3 8 1 . 会议通过的 脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准 及临2 叶 妮， 张临洪. 低分子肝素的药理作用及其在缺血性卒中 床 疗 效评 定 标准进 行 评价 ， 。 基 本痊 愈: 症 状和 体征 恢复 正的 临 床 应 用口 . 国 外医 学 脑 血 管 疾 病 分 册， 2 0 0 1 ;9 ( 1 ) :4 6 . 常， 生 活自 理; 显 效: 临 床 症 状明 显改 善， 肌 力 增加II 级; 有 收 稿日 期: 2 0 0 3 - 0 9 - 0 4 效: 临床症状改善， 肌力增加 I 级; 无效: 症状无改善或恶化。