神经前体细胞在成年小鼠脊髓颈段的分布特征.pdf

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1、 8 实用临床医学2 0 0 8 年第9 卷第6 期P r a c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e ，2 0 0 8 ，V o l9 ，N 0 6 神经前体细胞在成年小鼠脊髓颈段的分布特征 陶玉慧8 ，徐仁佃6 ( 南昌大学a 研究生院医学部2 0 0 5 级；b 第一附属医院神经内科，南昌3 3 0 0 0 6 ) 摘要：目的观察和分析在成年动物脊髓颈段的神经前体细胞( N P C s ) 分布特征。方法采用巢蛋白第二内含子 增强子控制的L a c Z 启动子转基因小鼠和L a c Z 染色及阳性细胞量化技术，观察分析脊髓颈段的N P C s

2、 分布特征。 结果N P C s 在成年小鼠的整个脊髓颈段都可见，但是在不同区其数量和密度不同，在后角最多，其次是中央管，前 角和侧角最少。在脊髓后角区N P C s 主要分布在胶状质，在中央管N P C s 主要分布在室管膜带，在脊髓髓质( 白质) 区很少，灰质明显比白质多，左右两边无明显差别。绪论在N P C s 的分布可能与临床疾病脊髓的损伤和修复有 相关性，N P C s 分布少的区易于损伤且难于修复，像前角和侧角。在后角、中央管和神经胶质细胞分布最多，则难于 损伤，较易修复。 关键词：脊髓；神经前体细胞；转基因动物；小鼠 中图分类号：R - 3 3 2文献标识码：A文章编号：1 0

3、0 9 - - 8 1 9 4 ( 2 0 0 8 ) 0 6 - - 0 0 0 8 - - 0 3 D i s t r i b u t i o nF e a t u r eo fN e u r a iP r e c u r s o rC e l l s i nS p i n a lC o r dC e r v i c a lS e g m e n to fA d u ltMi c e T A OY u - h u i 。X UR e n s i “ ( a 2 0 0 5G r a d eo fM e d i c a lD e p a r t m e n to fG r a d u a t

4、 eS c h o o l ；b D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y ， t h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a l ，N a n c h a n gU n i v e r s i t y ，N a n c h a n g3 3 0 0 0 6 ，C h i n a ) A B S T R A C T ：O b j e c t i v e T oo b s e r v ea n da n a l y z eN P C sa m o u n ta n dd e n s i t yi ne a c h

5、s p i n a lc o r dc e r v i t a ls e g m e n to fa d u l tm i c e M e t h o d s E x p e r i m e n t a li n v e s t i g a t i o no fn e u r a lp r e c u r s o rc e l l s ( N P C s ) d i s t r i b u t e df e a t u r ei ns p i n a lc o r dc e r v i c a ls e g m e n to fa d u l ta f i i m a lw a sc o n

6、d u c t e db yn e s t i ns e c o n d i n t r o ne n h a n c e rc o n t r o l l e dL a c Zr e p o r t e rt r a n s g e n i cm i c e ( p N e s T g ) T h ep N e s T g t r a n s g e n i cm i c e ，L a c Zs t a i n i n ga n dp o s i t i v ec e l lq u a n t i f i c a t i o n sw e r eu s e d R e s u l t sN

7、P C sw e r eo b s e r v e di nw h o l es p i n a lc o r dc e r v i c a ls e g m e n to fa d u l tm i c e ，b u ta m o u n ta n dd e n s i t yw a sd i f f e r e n t i nd i f f e r e n tr e g i o n T h ed o r s a lh o r nr e g i o nw a st h em o s ta n dt h en e x tw a sc e n t r a lc a n a l T h ev e

8、n t r a la n dl a t e r a lh o r nw a sl e s si ns p i n a lc o r d I nd o r s a lh o r nr e g i o nN P C sm a i n l yd i s t r i b u t e di ns u b s t a n t i ag e l a t i n o s a ，i nc e n t r a lc a n a lN P C sm a i n l yd i s t r i b u t e di ne p e n d y m a lz o n e ，t h em e d u l l a e ，n u

9、 c l e u sr e g i o n si ns p i n a lc o r dw e r el e s s T h e r ew e r en od i f f e r e n c eb e t w e e nt h el e f ta n dr i g h ts i d e s C o n c l u s i o nT h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tN P C sd i s t r i b u t i o np o s s i b l ya r er e l a t i v et Od a m a g ea n dr e c o v

10、 e r yo fs p i n a lc o r di nc l i n i c a ld i s e a s e s ，t h er e g i o n sw h e r ea r ed i f f i c u l tt or e c o v e ra n de a s yt o d a m a g el i k ev e n t r a la n dl a t e r a lh o r nw e r el e s s ，o p p o s i t e l y ，i nd o r s a la n dc e n t r a lc a n a lw e r em o r e K E YW O

11、 R D S ：s p i n a lc o r d ；n e u r a lp r e c u r s o rc e l l s ；t r a n s g e n i ca n i m a l ；m i c e 以前一贯的观念认为在成熟的中枢神经系统不 存在神经前体细胞( n e u r a lp r e c u r s o rc e l l s ，N P C s ) ， 在出生后神经前体细胞生长停止，因而，神经组织在 损伤后不能修复，但是，最近的研究对这一观点提出 质疑。在成年哺乳动物脑中发现N P C s 存在于室管 下带( S V Z ) 和室管膜带( S E Z ) 。现在越来越多的

12、研 究资料提供了证据证明了N P C s 存在成年动物大脑 的中枢神经系统阻4 | 。现在的理论提示，在胚胎发育 收稿日期：2 0 0 7 一0 4 1 0 作者简介：陶玉慧( 1 9 7 5 一) ，女，硕士研究生，主要从事脑血管病、神经变性疾病研究。 万方数据 实用临床医学2 0 0 8 年第9 卷第6 期P r a c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e ，2 0 0 8 ，V o l9 ，N 0 6 阶段停止后的成年中枢神经系统存在N P C s ，N P C s 可以被诱导分化某一特定的神经细胞来取代损伤的 神经细胞，这为功能重建和神经损

13、伤带来希望。最 近几年N P C s 研究被引起广泛关注，特别是刺激内 源性的N P C s 使之增殖、分化，从而迁移到损伤的部 位来修复损伤的神经细胞 2 q 。N P C s 在脊髓的分 布特点是研究内源性N P C s 修复损伤的脊髓的前提 工作。目前在成年动物脊髓N P C s 的分布特征( 特 别是分布部位、数量和密度) 还不完全清楚。本研 究主要观察这些N P C s 在成年动物脊髓的分布特 征。 1 材料和方法 1 1 转基因动物 本实验中使用的巢蛋白( N e s t i n ) 第二内含子增 强子控制的L a c Z 启动子转基因C 5 7 B L 6 J 成年转 基因小鼠(

14、 n e s t i ns e c o n d i n t r o ne n h a n c e rc o n t r o l l e d L a c Zr e p o r t e rt r a n s g e n i cm i c e ，p N e s T g ) 最初购买 于美国杰克逊实验室( J a c k s o nL a b o r a t o r y ，B a r H a r b o r ，M E ，h t t p ：w w w j a x o r g ) ，鼠龄7 0 8 0d 。转基因动物在动物房常规喂养，成年后用特 定的引物通过常规的聚合酶链反应( P C R ) 来筛选。

15、选取带有目的基因的成年小鼠用于实验。 1 2 L a c Z 染色 乙醚麻醉小鼠，在室温下先用2 0m L0 9 的 生理盐水缓冲液，再用4 0m L4 的多聚甲醛磷酸 缓冲液( p H7 5 ) 对成年转基因小鼠和对照小鼠进 行心脏灌注。在冰盘中分离小鼠脊髓，并放在4 的多聚甲醛固定剂洗液中固定2 4h ，再放在2 0 葡 萄糖液1 磷酸缓冲液( p H7 5 ) 中浸泡4 8h 。包埋 后，在冷冻切片机上从喙部到尾部按冠状位切割 1 2 弘m 厚的组织切片，每间隔1 2 0 弘m 间距选用一张 切片，收集到载破片上。在L a e Z 染色前，切片先用 1 P B S 洗涤2 次，然后在室温

16、下在p 半乳糖 ( B g a l ) ( 4m m o l L 亚铁氰化钾，2m m o l LM g C l 2 ， 4 0 0 1 9 m Lp - g a l ) 溶液中染色6h 。然后用1 P B S 洗涤6 次，然后在7 0 的酒精中固定。 1 3 图像收集和分析 所有的图像由配有数码相机的E 8 0 0N i k o n 荧 光显微镜( N i k o nC o r p o r a t i o n ，东京) 收集，并用图像 分析软件分析。在放大2 0 0 倍视野下，计算每张切 片的每个脊髓部位的L a c Z 阳性细胞数，计算每个 部位的所有切片的L a c Z 阳性细胞总数，然

17、后除以 切片数，得出每一脊髓部位的平均值。每组5 只小 鼠，平均数进行定性分析。 9 1 4 统计分析 在成年小鼠脊髓颈段的不同的部位的L a c Z 阳 性细胞数的统计分析是用配对t 检验，所有的数据 由均数标准差表示，P 中央管 其他 区( 前侧和侧角) ( P O 0 5 ) 。在脊髓后角区N P C s 主要分布在胶状质，在中央管N P C s 主要分布在室 管膜带。N P C s 数目在脊髓的左侧和右侧没有显著 不同，在灰质中的明显比白质的多( P O 0 5 ) 。详 见封二图1 3 ，图4 。 3 讨论 图4N P C s 在小鼠脊髓颈段的分布 巢蛋白( N e s t i n

18、) 是一种中间丝蛋白质，在胚胎 发育期间，当N P C s 将分化成神经元和神经胶质细 胞时短暂表达。在中枢神经系统中所有N P C s 都表 达巢蛋白，巢蛋白的阳性表达可以证明N P C s 的存 在，巢蛋白被认为是N P C s 的特定的生物标记。免 疫组织化学技术证实所有N P C s 的巢蛋白染色都显 示阳性结果。目前，巢蛋白被认为是中枢神经系统 的N P C s 可靠的生物标记物，用来鉴别活体和离体 内所有的N P C s 的存在，区别N P C s 和成熟神经细 胞5 小 。 p N e s - T g 转基因小鼠使得巢蛋白在成年小鼠中 枢神经系统中N P C s 的特殊表达，同时

19、通过p - g a l 使 得特殊染色L a c Z 染色表达来识别N P C s 的存在。 转基因小鼠很大的改善了N P C s 的特殊识别，消除 了很多假阳性和阴性N P C s ，该研究方法是比较好 万方数据 1 0 实用临床医学2 0 0 8 年第9 卷第6 期P r a c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e , 2 0 0 8 , V o l9 ，N 0 6 的用来研究在中枢神经系统中N P C s 分布特征的技 术方法。过去的研究方法主要是应用免疫组织化学 技术，主要缺陷是假阳性和假阴性较多 2 叱” 。所 以，本研究采用p N e

20、s - T ga n dL a c Z 染色技术检测成 年鼠脊髓中N P C s 的分布特征。 N P C s 是中枢神经系统的一种神经祖细胞， N P C s 包括神经干细胞，神经干细胞有持久分化和 增殖能力，可以分化成神经元、星形胶质细胞和少突 神经胶质细胞 1 h 1 3 ，因而N P C s 成为神经元修复的 理想选择。在过去研究中，研究者证实了N P C s 移 植到中枢神经系统可以显示足够的可塑性，参加胚 胎、成年和老年阶段的神经发生，分化成神经元、星 形胶质细胞和少突神经胶质细胞 1 1 | 。但是，无论是 取代死亡的还是机能障碍的神经元细胞均未得到满 意的实验结果，一些研究表明

21、外源性的N P C s 可以 存活在移植的区且分化成神经元细胞，但不能有效 的构建突触连接和神经元存活的微环境，如产生神 经营养因子等，发挥正常的生理功能和修复神经机 能障碍。 诱导N P C s 增殖、分化及向损伤区迁移可能是 神经修复的一个突破点，可能克服外源性N P C s 移 植的缺陷。诱导N P C s 迁移到损伤的中枢神经系统 区并且分化成神经细胞。在理论上是最好的神经修 复方法。对大脑和脊髓每个部分N P C s 的分布特征 的研究是所有关于中枢神经系统N P C s 修复损伤的 神经细胞的前题。目前在成年动物每个脊髓部分的 N P C s 的分布特征不十分明确，因此，作者建立此

22、项 研究是为了观察和分析N P C s 在成年动物脊髓的分 布特征。根据L a c Z 染色分析，该研究获得了成年 小鼠脊髓颈段各个区的N P C s 的分布特征。本研究 结果显示：N P C s 分布在成年小鼠脊髓颈段各个结 构部分，但在不同部分其数目和密度是不同的。 N P C s 分布最多的是在脊髓灰质胶状质，其次是在 中央管的室管膜带，其他部分像髓质、神经核、前角 和侧角很少。脊髓左右两半N P C s 的分布没有不 同。本研究作者观察、分析和描述了在成年小鼠脊 髓颈段N P C s 的分布特征，包括各分布区哪里最多、 哪里最少，以及证明了在成年动物脊髓有N P C s 的 存在。从本

23、实验数据提示在临床疾病中N P C s 的分 布是和脊髓的损伤和修复相伴随的，那些易于损伤 和难于恢复的区像腹侧角、胸段和神经元的N P C s 分布很少，相反的，在脊髓后角、中央管和胶质细胞 区N P C s 分布多。N P C s 分布少的神经元区和 N P C s 分布多的胶质细胞和室管膜细胞区也提示 N P C s 的衍生可能与神经胶质细胞和室管膜细胞相 关。 参考文献： 1 3K o r n a e kDR R a k i cP T h eG e n e r a t i o n ，M i g r a t i o n ，a n dD i f f e r e n t i a t i o

24、no fO l f a c t o r yN e u r o n si nt h eA d u l tP r i m a t eB r a i n - J P r o cN a t IA c a dS c iU S A ，2 0 0 1 ，9 8 ( 8 ) ：4 7 5 2 4 7 5 7 2 S h a hx ，C h iL ，B i s h o pM ，e ta 1 E n h a n c e dd eN o v oN e u r o g e n e s i sa n dD o p a m i n e r g i cN e u r o g e n e s i si nt h eS u b

25、 s t a n t i aN i g r ao f 1 - m e t h y l 一4 一p h e n y l 一1 ，2 3 ，6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e - i n d u c e dP a r k i n s o n sD i s e a s e - l i k eM i c e J S t e mC e l l s ，2 0 0 6 ，2 4 ( 5 ) ；1 2 8 0 1 2 8 7 3 3 K eY ，c h iL ，X uR ，e ta 1 E a r l yR e s p o n s eo fE n d o g e n

26、 o u sA d u l t N e u r a l ，P r o g e n i t o rC e l l st oA c u t eS p i n a lC o r dI n j u r yi nM i c e J S t e mC e l l s ，2 0 0 6 ，2 4 ( 4 ) ：1 0 1 1 1 0 1 9 4 3 C b iL 。K eY ，L u oC ，e ta 1 M o t o rN e u r o nD e g e n e r a t i o nP r o m o t e sN e u r a lP r o g e n i t o rC e l lP r o l

27、 i f e r a t i o n ，M i g r a t i o n a n d N e u r o g e n e s i si nt h eS p i n a lC o r d so fA m y o t r o p h i cL a t e r a lS c l e r o s i sM i c e F J S t e mC e l l s 。2 0 0 6 ，2 4 ( 1 ) ：3 4 4 3 5 L e n d a h lU G e n eR e g u l a t i o ni nt h eF o r m a t i o no ft h eC e n t r a l N e

28、 r v o u sS y s t e m F J A c t sP a e d i a t r ( S 0 ) ，1 9 9 7 ，4 2 2 ：8 - 1 1 6 Y a w o r s k yP J ，K a p p e nC H e t e r o g e n e i t yo fN e u r a lP r o g e n i t o r C e l l sR e v e a l e db yE n h a n c e r si nt h eN e s t i nG e n e J D e vB i o l ， 1 9 9 9 ，2 0 5 ( 2 ) ：3 0 9 - 3 2 1

29、7 A o k iY ，H u a n gz ，T h o m a sSS 。e ta 1 I n c r e a s e dS u s c e p t i b i l i t yt o I s c h e m i a - i n d u c e db r a i nd a m a g ei nT r a n s g e n i eM i c eO v e r e x p r e s s i n gaD o m i n a n tN e g a t i v ef o r mo fS H P 2f i J F A S E BJ ， 2 0 0 0 ，1 4 ( 1 3 ) ：1 9 6 5 1

30、9 7 3 8 3M i t s u h a s h iT ，A o k iY ，E k s i o g l uYZ 。e ta 1 o v e r e x p r e s s i o no f p 2 7 K i p lL e n g t h e n st h eG 1P h a s ei naM o u s eM o d e lT h a tT a r g e t sI n d u c i b l eG e n eE x p r e s s i o nt oC e n t r a lN e r v o u ss y s t e m P r o g e n i t o rC e l l s

31、J P r o cN a t lA c a dS c iU S A ，2 0 0 1 ，9 8 ( 1 1 ) ： 6 4 3 5 6 4 4 0 9 3S c h w a r t zPH ，B r y a n tPJ ，F u j aTJ ，e ta 1 I s o l a t i o na n dC h a r a e t e r i z a t i o no fN e u r a IP r o g e n i t o rC e l l sf r o mP o s t m o r t e mH u - m a nC o r t e x F J JN e u r o s c iR e s ，

32、2 0 0 3 ，7 4 ( 6 ) ：8 3 8 8 5 1 1 0 T a k a h a s h iM ，A r a iY ，K u r o s a w aH ，e ta 1 E p e n d y m a lC e l lR e a c t i o n si nS p i n a lC o r dS e g m e n t sa f t e rC o m p r e s s i o nI n j u r yi n A d u l tR a t J JN e u r o p a t h o lE x pN e u r o l ，2 0 0 3 ，6 2 ( 2 ) ：1 8 5 一 1

33、9 4 F I I F u j i w a r aY ，T a n a k aN ，I s h i d aO ，e ta 1 I n t r a v e n o u s l yI n j e c t e d N e u r a lP r o g e n i t o rC e l l so fT r a n s g e n i eR a t sc a nM i g r a t et ot h e I n j u r e dS p i n a lC o r da n dD i f f e r e n t i a t eI n t oN e u r o n s ，A s t r o - c y t

34、e sa n d0 l i g o d e n d r o c y t e s J N e u r o s c iL e t t ，2 0 0 4 ，3 6 6 ( 3 ) ； 2 8 7 2 9 1 1 2 L o t h i a nC ，P r a k a s hN ，L e n d a h lU ，e ta 1 I d e n t i f i c a t i o no fb o t h G e n e r a la n dR e g i o n - s p e c i f i cE m b r y o n i cC N SE n h a n c e rE l e - m e n t si

35、 nt h eN e s t i nP r o m o t e r J E x pC e l lR e s ，1 9 9 9 ，2 4 8 ( 2 ) ：5 0 9 5 1 9 1 3 B a r t l e t tPF 。R i c h a r d sLR ，K i l p a t r i c kTJ ，e ta 1 R e g u l a t i o no f N e u r a lP r e c u r s o rD i f f e r e n t i a t i o ni nt h eE m b r y o n i ca n dA d u l t F S o r e b r a i n

36、 J C l i nE x pP h a r m a c o lP h y s i o l ，1 9 9 5 ，2 2 ( 8 ) ： 5 5 9 - 5 6 2 ( 责任编辑：刘大仁) 万方数据 高频振荡结合部分液体通气治疗急性呼吸衰竭免的实验研究( 正文见第1 页) A ：C M v 组：B ： I F o v 组：C ：H F O V + P F C 组 图1 兔肺组织病理变化 神经前体细胞在成年小鼠脊髓颈段的分布特征( 正文见第8 页) 2 0 x n n c a I d 涮2 0 xc c n I 曲Ic c n L c r 图lN P C s 在颈段的分布 图2N P C s 在颈段后角的分布图3N P C s 在颈段中央管的分布 椎间盘源性下腰痛与椎间盘内神经侵润生长的关系( 正文见第2 4 页) 图1T I B s T 浊显示H R P 标记细胞 图2 对照组中显示的阳性细胞图3 实验组中显示的阳性细胞 万方数据