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1、现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u n ，1 8 ( 1 7 )- 1 9 7 9 攀! 每蟹譬戮 简易悬吊术制备大鼠深静脉血栓模型 张惠明，张力 ( 广西中医学院第一附属医院，广西南宁5 3 0 0 2 3 ) 【摘要】的建立一种简便、适合动态研究的大鼠深静脉血栓模型。方法将6 0 只 体质量为( 2 5 0 2 0 ) g 的S D 大鼠按随机数字表法分为3 组：
2、动物模型组3 6 只，对照组1 8 只， 假手术组6 只。动物模型组采用改良下腔静脉结扎法( 简易悬吊术) 制备动物模型。造模后观 察血管内膜及血栓不同时期的病理变化，并与对照组及假手术组做观察比较。蛄秉采用改 良法制作模型后，大鼠下腔静脉内不仅均形成稳定的血栓，而形成血栓的大鼠存活率很高，符 合人体静脉血栓形成急性期的病理演变。簟论简易悬吊术可以成功制作适合动态研究的 大鼠深静脉血栓模型。 关键词大鼠；深静脉血栓；简易悬吊术 中图分类号】R 一3 3 2 【文献标识码】A【文章编号1 0 0 8 8 8 4 9 1 2 0 0 9 ) 1 7 1 9 7 9 一0 3 D e e pv e
3、n o u st h r o m b o s i sm o d e li nr a t sp r e p a r e dw i t hs i m p l ea n de a s yv e n t r o f i x a t i o n 。 Z h a n gH u i m i n g ，Z h a n gL i ( T h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fG u a n g x iT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c a lC o U e g e ，N a n n i n g5 3
4、0 0 2 3 ，G u a n g x i ，C h i n a ) A b s t r a c t ：0 b j e c t i v eI ti st oe s t a b l i s hak i n do fc o n v e n i e n td e e pv e n o u st h r o m b o s i s ( D v T ) m o d e li nr a t st Os u i td y n a m i c s t u d y M e t h o d s6 0S Dr a t sw 瞄eb o d ym a 鹃w a s ( 2 5 0 2 0 ) gw e r ed i
5、 v i d e di n t oa n i m a lm o d e lg r o u pi nw h i c ht h e r ew a s3 6 r a t s ，c o n t r o lg r o u pi nw h i c ht h e r eW R q1 8r a t sa n ds h a n lo p e r a t i o ng r o u pi nw h i c ht h e r ew a s6r a t Sw i t hr a n d o md i g i t st a b l e m e t h o d I m p r o v e di n f e r i o rv
6、e n aa 1 v al i g a t i o nm e t h o d ( s i m p l ea n de a s yv e n t r o f i x a t i o n ) W a Su s e di na n i m a lm o d e lg r o u pt O p r e p a r ea n i m a lm o d e l A f t e rm o d e lp r e p a r e d ，t h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so ft h r o m b u sa n de n d a n g i u mi nd i f
7、 f e r e n tp e r i o di na n i - r e a lm o d e lg r o u pw e r eo b s e r v e da n dc o m p a r e dw i t ht h o s ei nc o n t r o lg r o u pa n ds h a mo p e r a t i o ng r o u p R e s u l t sA f t e rm o d e l p r e p a r e dw i t hi m p r o v e dm e t h o d ，s t a b l et h r o m b u sW a sf o r
8、m e di ni n f e r i o rv e n aa s v so fr a t s T h es u r v i v a lr a t eo fr a t sw h i c h h a dt h r o m b u st o r m e dw a sv e r yh i g h T h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so fa n i m a lm o d e lw e r ec o n s i s t e n tw i t ht h ep a t h o l o g i c a lv a r i a t i o no fv e n o u
9、 st h r o m b o s i sd u r i n ga c u t es t a g ei nh u m a nb o d y C o n c l u s i o nS i m p l ea n de a s yv e n t r o f i x a t i o nc a nb eu s e dt Os u e - c e s s f u l l ye s t a b l i s hD V Tm o d e li nr a t st Os u i td y n a m i cs t u d y K e yw o r d s ：r a t s ；d e e pv e n o u st
10、 h r o m b o s i s ；s i m p l ea n de a s yv e n t r o f i x a t i o n 在动态研究药物对深静脉血栓形成( D v T ) 溶栓或抗凝 作用机制的过程中，不仅要求动物模型形成的血栓稳定可靠， 符合人体静脉血栓形成的病理学演变，还要求形成血栓的大 鼠能够存活，以便有效动态地观察药物溶栓或抗凝作用的效 果。笔者在R e y e r s 等的大鼠下腔静脉结扎法制备D V T 模 型基础之上，建立了一种新的适合于动态研究抗凝、溶栓药物 机制的模型，现报道如下。 1 实验资料 1 1 动物体质量( 2 5 0 2 0 ) g 的清洁级S
11、 D 大鼠6 0 只，雌 【作者简介】张惠明( 1 9 8 2 一) 男，硕士研究生，主要从事周围血 蕾疾病、烧伤等的肚床与科研工作。 【通信作者】张力( 1 9 6 4 一) ，男。副教授科主任，主要从事周围 血管疾病、烧伤、体表疮疡等的临床与科研工作。T e l ：1 3 0 7 7 7 9 3 6 0 6 ， E m a i l ：g z y w s k 1 6 3 c o r n 基金项目】广西教育厅研究生创新计划资助项目 ( 2 0 0 8 1 0 6 0 0 1 0 0 6 M 1 9 ) 雄不限( 广西医科大学动物实验中心) ，适应性喂养l 周后，采 用随机数字表法分为3 组：动
12、物模型组3 6 只，对照组1 8 只， 假手术组6 只。 1 2 制备方法及观察方法动物模型组：以2 戊巴比妥钠 溶液lm L 1 0 0g 腹腔注射麻醉。入腹，将肠管及其系膜拨向 右侧，打开后腹腔，游离左肾静脉与下腔静脉汇合处及其下方 1 0o n l 长下腔静脉段见图l 。在左肾静脉汇入下腔静脉下 方穿过一条0 号丝线，将结扎线两头穿过腹壁右侧，引出腹 腔。同样的方法在髂总静脉上方置一结扎线。将肠管及其系 膜回纳腹腔，调整结扎线的位置以避免压迫肠管。将2 条结 扎线打结分别固定在腹壁外，2 0m L 生理盐水注入腹腔中， 关腹。需注意结扎线的松紧度，太松则不足于阻断血流导致 造模失败；太紧
13、则会将腹壁拉向腹腔压迫肠管导致一系列不 良后果。结扎线松紧度以可以穿过1 支普通中华牌2 B 铅笔 为度。术后动物保温，自由进食、饮水。制模后，采用随机数 字表法按术后6h 和l 。3 ，7 ，1 0d 不同时点各取6 只大鼠开 万方数据 1 9 8 0 现代中西医结合杂志M o d e mJ o u m a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i d n e2 0 0 9J u n ，1 8 ( 1 7 ) 腹，取出结扎线下方1 0t i n 长下腔静脉段血管。生理盐
14、水漂 洗，投入1 0 甲醛中固定。脱水后石蜡包埋、切片，行眈染 色在2 0 0 倍光镜下观察并摄片。对照组：按照R e y e r s 等 的大鼠下腔静脉结扎法制备D v T 模型。各时点各取3 只大 鼠，其余同动物模型组。假手术组：6 只大鼠仅做开腹、游离 左肾静脉与下腔静脉汇合处及其下方1 0c r n 长下腔静脉段。 并在相应部位穿过结扎线即关腹，2 4h 后开腹取血管标本，其 余同动物模型组。 图1 下腔静脉( 血栓段) 2 结果 2 1 存活情况动物模型组及假手术组无大鼠死亡。对照 组在术后7 1 2h 死亡6 只。死亡原因为二次麻醉及手术打 击；3d 后死亡1 只，死亡原因为肺栓塞
15、。 2 2 大体观察假手术组：大鼠下肢均未见肿胀，下腔静脉 通畅，腹腔内未见有静脉血管扩张。取材血管管径粗细均匀， 管壁薄而柔软，内膜面呈乳白色，平整、光滑。动物模型组：制 模过程中阻断下腔静脉6h 后，可见结扎线下方有黑色血栓 形成，且该1 0c m 长下腔静脉段血管壁弹性下降。剖开血管 可见已形成的黑色血栓停滞在结扎线下方，见图1 。大鼠后 肢与腰臀部肿胀在术后6h 即出现，随着时间推移，未见明显 加重，血栓形成后4d 逐渐有缓解，活动增加。血栓形成后1 4 d 后肢与腰臀部仍有轻度肿胀。腹腔内均可见肠系膜静脉血 管明显扩张。血栓形成率1 0 0 。对照组大体观察与模型组 类似。 2 3
16、镜下观察对照组及假手术组：整个血管内膜表面平 整，内皮细胞大小均匀、排列整齐，管腔中无血栓，见图2 。动 物模型组：术后6h ，静脉管腔被血栓堵塞，血管内皮断裂、 不完整，内皮下层裸露，见图3 。术后1d ，静脉管腔被血栓 堵塞，血管内皮断裂血管壁炎性细胞浸润较为严重，静脉内血 栓为混合血栓。术后3 d 血栓收缩与血管壁无粘连，血管 内皮不全，静脉周围炎性细胞增多，血栓开始有机化现象，见 图4 。术后7d 血栓与静脉内表面机化粘连粘连区域已 无内皮细胞存在，血管壁炎性细胞浸润存在，见图5 。术后 1 0d 血栓与静脉内表面大部分粘连，中央区血栓崩解，形成 腔隙，腔隙表面内皮细胞可见机化组织向内
17、部深入，替代了 较多的血栓部分，血管壁炎性细胞浸润仍较为严重。对照组 均可形成稳定的血栓，其血栓演变规律与模型组类似。 3 讨论 图2 正常血管管腔 图3 模型组术后6h 静脉管腔 图4 模型组术后3d 静脉管腔 图5 模型组术后7d 静脉管腔 D V T 是一类严重危害人类健康的常见疾病。因此建立简 单、快速、稳定而价格低廉并符合血栓动态变化的实用D V T 模型十分重要。综合文献，在研究药物在体内抑制血栓形成 的作用及机制时，以R e y e r s 等【lJ 建立的大鼠下腔静脉结扎法 D V T 模型最为经济、常用。其步骤及原理是：麻醉大鼠后开 腹、分离其下腔静脉，于左肾静脉下方用粗丝线
18、结扎下腔静 脉，引起局部血流淤滞、缺氧。导致血管内皮细胞损伤，启动内 源性凝血系统；此外，黏聚的血小板与局部生成的凝血因子也 因血流受阻停留在局部，致使血栓形成。一( 下转第1 9 8 9 页) 万方数据 现代中西医结合杂志M o d e r nJ o u r n a lo fI n t e g r a t e dT r a d i t i o n a lC h i n e s ea n dW e s t e r nM e d i c i n e2 0 0 9J u n ，1 8 ( 1 7 ) 性，电镜下观察细胞形态学的变化。结果显示：细胞普遍脂滴 较多，部分细胞出现典型的凋亡早期中期改变，
19、表现为细胞膜 微绒毛消失，边缘变平直，细胞核皱缩，染色质聚集在核模下， 可见典型的凋亡小体。 凋亡是细胞在基因调控下的一种程序性死亡。大多数抗 癌药物都可引起肿瘤细胞凋亡，诱导细胞凋亡可能是不同机 制抗癌药物发挥作用的共同通路【9 】。黄芪注射液是如何直接 诱导L o v o 细胞凋亡呢? 本试验用流式细胞仪分析了黄芪注 射液对L o v o 细胞生长周期的影响。实验结果示：对照组L o V O 细胞自然凋亡率为0 5 2 ，黄芪注射液作用L o v o 细胞4 8 h 后，0 0 5g m L 、0 1g m L 、0 1 5g m L 、0 2g m L 各组的凋 亡率分别为4 8 ，1
20、8 6 ，4 2 1 ，6 4 8 。细胞周期分析 显示实验组G 0 G 1 期细胞百分比增高，S 期细胞的比率下 降，从而使得肿瘤细胞的增殖速度减慢。 本研究表明：黄芪注射液对人结肠癌L o v o 细胞的体外增 殖具有抑制作用，并能使L o v o 细胞阻滞于G o G 1 期，诱导 L o v o 细胞凋亡。本研究为黄芪注射液用于治疗结肠癌提供 了有力的科学实验依据。 【参考文献】 1 】蔡小燕，许艳丽，林小军黄芪注射液对系统性红斑狼疮患者细 胞凋亡和免疫功能的影响 J 中国中西医结合杂志，2 0 0 6 2 6 ( 5 ) ：4 4 3 4 4 5 2 刘唐威，伍伟锋，冯震博等黄芪对小
21、鼠病毒性心肌炎细胞凋 亡及b c l 一2 b a x 基因转录的影响 J 】广西医科大学学报， 2 0 0 3 2 0 ( 6 ) ：8 2 5 8 2 8 3 】g a n gH 。A h nK S ，C h oC ，e ta 1 1 m m u n o m o d u l a t o r ye f f e c to fA s t r a g a l iR a d i xe x t r a c to nm u r i n eT h l 厂r h 2c e l ll i n e a g ed e v e l o p m e n t J 】B i o lP h a r m a B u l l
22、e t i n ，2 0 0 4 2 7 ( 1 2 ) ：1 9 4 6 1 9 5 0 4 J e m a lA T i w a r iR C ，M u r r a yT e ta 1 C a n c e rs t a t i s t i c s J C A C , l m c e l “ JC l i I I 2 0 0 4 ，5 4 ( 1 ) ：8 2 9 5 】李佳黄芪穴位注射升白细胞的临床观察( J 】现代中西医结合 杂志，2 0 0 7 1 6 ( 8 ) ：1 1 0 1 1 1 0 2 6 吴发宝，陈希元黄芪药理作用研究 J 中药材，2 0 0 4 ，2 7 ( 3 ) ：
23、 2 3 2 2 3 4 7 李琼，刘胜黄芪注射液对人类乳腺癌细胞株生长的抑制作用 【J 中国药理学通报，2 0 0 7 ，2 3 ( 2 ) ：1 0 0 1 0 1 8 刘成军，韦世秀，李牡艳等黄芪注射液对人类小涎腺腺样囊 性癌细胞株的抑制作用 J 中国医院药学杂志2 0 0 5 ，2 5 ( 5 ) ： 4 0 6 9 许杜娟，吴强，杨雁，等黄芪总苷的抑瘤作用及其作用机制 J 】中国药理学通报，2 0 0 3 ，1 9 ( 7 ) ：8 2 3 【收稿日期】2 0 0 8 1 l 一2 8 ( 上接第1 9 8 0 页) 般在静脉结扎后2h 血栓形成率为6 0 8 0 ，6h 后血栓形成
24、率为1 0 0 。笔者在研制D V T 模型过 程中发现，R e y e r s 等建立的大鼠下腔静脉结扎法D V T 模型 虽然可以形成稳定的混合血栓，但是不能保障血栓的近心端 通畅，不适合作为对溶栓及抗血栓药物动态研究的模型，也不 符合人体静脉血栓的发病特点。如果为保证已形成血栓的近 心端通畅，在血栓形成后重新打开腹腔，解开下腔静脉结扎 线。虽然血栓质量稳定，但是大鼠经历二次麻醉及创伤，不仅 大鼠死亡率增加，且工作量加大。如果采用某些文献报道的 下腔静脉活结结扎法，结扎线头从切口引出置于皮外固定，因 术后下腔静脉结扎处活结被血液、腹腔渗出液及炎症致粘连， 难以顺利抽出。甚至造成下腔静脉撕裂
25、导致大鼠死亡。 本研究中笔者改进了R e y e r s 的方法，将结扎线在体外打 结固定，从而避免了因术后下腔静脉结扎处活结被血液、腹腔 渗出液及炎症致粘连而难以抽出的情况。且将下腔静脉实验 段血管上、下阻断并放置6h ，不仅形成较多的血栓，而且所形 成的血栓在血液回流下停滞在结扎线下方。此时，因已结扎 汇合处下方下腔静脉各属支，血流相当缓慢。加重了局部血流 淤滞、缺氧，导致血管内皮细胞进一步损伤，这些改变扰乱内 皮细胞功能，产生多种血栓性组织因子，使血小板黏附、聚集， 加速血栓形成 2 q 从而在术后各时点动物模型组中均可形 成稳定的血栓。当静脉内形成的血栓较多较大、不能及时被 完全吸收时
26、，血栓部位的血管壁可生长出肉芽组织进入血栓 内，将血栓逐渐机化、替代，最终使血栓转变成机体的结缔组 织【2 J 。血栓形成后3d 左右开始机化，2 4 周已完全机化并 形成腔隙。在临床工作中，全身主干静脉均可发生D v T ，尤 其多见于下肢。有不少学者报道左下肢更易发生删4 。 但由于大鼠股静脉较细，股动、静脉粘连紧密，大鼠股静脉很 难造模，故多选用下腔静脉作为首选造模血管【5 】。本组术后 6 h 和1 ，3 ，7 ，1 0d 不同时点的动物模型组病理演变过程，符 合人体下肢静脉血栓形成急性期病理演变【2 】，完全可以用于 临床的对深静脉血栓的机制、药物作用靶点等的实验研究。 【参考文献】
27、 1 R e y e r sI ，M u s s o n iL ，D o n a t iM B ，e ta 1 F a i l u r eo fa s p i r i na td i f f e r e r l td o s e st om o l l ye x p e r i m e n t a lt h r o m b o s i si nr a t s J T h r o m b R e s 1 9 8 0 1 8 ( 5 ) ：6 6 9 【2 陆慰萱刘春萍深静脉血栓形成和肺血栓栓塞症的自然病程 J 中华医学杂志，2 0 0 3 ，8 3 ( 1 ) ：8 4 3 高峰，胡建国，关薇薇S D 大鼠深静脉血栓模型的建立及其静 脉壁形态学研究 J 江西医学院学报2 0 0 8 4 8 ( 2 ) ：2 5 【4 李晓强桑宏飞下肢深静脉血栓形成的外科治疗 J 中国普 外基础与临床杂志，2 0 0 6 ，1 3 ( 6 ) ：6 3 8 5 刘政侯玉芬周涛深静脉血栓形成动物模型的建立及应用进 展 J 中国中西医结合外科杂志，2 0 0 5 ，1 1 ( 5 ) ：4 5 1 【收稿日期】2 0 0 9 一0 1 一1 3 万方数据