精原细胞异基因移植研究进展及其面临的困惑.pdf

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1、第 12 卷 第 3 期中华男科学杂志Vol. 12 No. 3 2006 年 3 月National Journal of AndrologyMar. 2006 综述 精原细胞异基因移植研究进展及其面临的困惑 马良宏 综述；丁 强，王 翔 审校 （复旦大学附属华山医院泌尿外科，上海 200040） 摘要：将供体精原细胞移植入异基因受体生精小管中， 可看到供体精原细胞分化形成供体形态特征的精子。伴随 着冷冻保存、 体外培养和干细胞富集技术的发展， 精原细胞异基因移植必将在基础科学、 临床医学、 动物繁殖等领 域有非常重要的应用前景。另外， 这些技术也可用于接受大剂量放疗或化疗的肿瘤患者的性腺保

2、护和生育力保 存。本文综述精原细胞异基因移植研究进展， 并对该技术在今后临床应用中所存在的问题进行讨论。 关键词：精原细胞；干细胞；异基因；移植；精子发生 中图分类号：R321. 1 文献标识码：A 文章编号： 1009-3591（2006）03-0258-05 Advances in Xenogeneic Transplantation of Spermatogonial Stem Cell and Its Bewilderment in Clinical Application MA Liang-hong，DING Qiang，WANG Xiang Department of Urolog

3、y，Huashan Hospital，Shanghai Medical College，Fudan University，Shanghai 200040，China Correspondence to：WANG Xiang，E-mail：seanw medmail. com. cn Abstract：Results from the transplantation of donor spermatogonia into xenogeneic recipient seminiferous tubules indicate that donor germ cells are capable of

4、differentiating to form spermatozoa with morphological character of the donor species. With the advances in freezing，culturing in vitro and enriching germ cell populations，germ cell transplantation procedures have applications of paramount values in medicine，basic science and animal reproduction. Ad

5、ditionally，these techniques can serve as an alternative approach for go- nadal protection and fertility preservation especially in patients accepting large dose of chemotherapy or radiotherapy. In this article we reviewed the recent advances in xenogeneic transplantation of spermatogonial stem cell

6、and also analyzed the potential problems existing in its clinical application. Natl J Androl， 200.， /2 （0） ： 21232.2 Key words：spermatogonia；stem cell；xenogeneic；transplantation；spermatogenesis 卵细胞胞质内单精子注射 （ intracytoplasmic sperm injection， ICSI） 是目前治疗男性不育的有效方 法。但在一些非梗阻性无精子症患者 （如： 青少年淋 巴瘤或白血病患者接受全身

7、大剂量放疗或化疗后失 去生育能力者） 中， 因无法获取单倍体生殖细胞， 使 ICSI 的应用受到限制。精原干细胞具有永生化和多 能化潜能， 是精子形成的前体细胞， 在睾丸等微环境 中具有增殖、 分化的能力 1。1994 年 Brinster 首次 报道了精原干细胞移植实验， 引起人们广泛的关注。 在此实验报道后， 各种改进和新的方法相继涌现， 尤 其精原细胞异基因移植呈现出更加广阔的应用前 景， 不仅用于探寻精子的发生和调控机制， 还可作为 非梗阻性无精子症患者的治疗策略。本文综述精原 细胞异基因移植的研究进展， 并对该技术将来应用 于临床所存在的问题进行探讨。 852 收稿日期： 2005-

8、09-11；修回日期： 2005-11-28 基金项目：国家自然科学基金 （30400441， 30200262） 、 上海市科技发展基金 （02QB14011） 作者简介：马良宏 （1975-） ， 男， 宁夏银川市人， 主治医师， 博士研究生， 从事泌尿外科及男科学临床与基础研究。 通讯作者：王 翔，E-mail：seanw medmail. com. cn 1 精原细胞异基因移植 1. 1 大鼠-小鼠间移植 1996 年 Clouthier 等 2将 大鼠精原细胞移植入免疫缺陷小鼠生精小管内， 在 10 个小鼠睾丸中均可见到大鼠来源的精子发生， 并 在一些小鼠附睾内见到大鼠来源的精子。R

9、ussell 等 3将大鼠精原细胞移植入免疫缺陷小鼠生精小管 内， 实验也取得成功。在大鼠精子发生的起始阶段， 观察到小鼠 Sertoli 细胞与大鼠精子发生间关联的超 微结构， 证实精原细胞分化需要 Sertoli 细胞的支持 作用。Franca 等 4将大鼠精原细胞移植入小鼠睾丸 内， 在移植后 12. 9 13 d 处死小鼠， 发现小鼠睾丸 内处于发育阶段的大鼠生精细胞为粗线期精母细 胞， 处于大鼠精子发生周期的 期。在移植后 的小鼠睾丸内， 发现精原细胞发育的两个独立时相： 一个为大鼠生精时相， 另一个为小鼠生精时相。若 大鼠精原细胞在小鼠体内由小鼠 Sertoli 细胞所决 定， 移

10、植后大鼠的精原细胞与在大鼠自身体内的精 原细胞的生精周期以及精子发生结构的模式应不 同。实验发现： 大鼠精原细胞在小鼠睾丸内的精子 发生周期与在大鼠自身睾丸内的精子发生周期相 同。说明精子发生周期由精原细胞唯一决定， 并不 受 Sertoli 细胞影响。以前人们推测 Sertoli 细胞在精 子发生中起重要作用， 但缺乏形态学支持， 通过动态 观察携带报告基因的精原细胞移植后的迁移过程， 证实生精上皮中存在干细胞 “壁龛” ， 即 Sertoli 细胞 为生精过程所营造的微环境。 1. 2 大型动物-小鼠间移植 Dobrinski 等 5将兔、 狗、 猪、 牛、 马的精原细胞移植入小鼠的生精小

11、管内， 在受体睾丸内没能产生供体精子。所有接受移植的 小鼠为免疫缺陷鼠， 移植前 4 周经过白消安预处理。 在 12 个月观察过程中， 这种克隆模式没有改变。将 狗的新鲜、 冷冻保存或体外培养的精原细胞移植入 小鼠睾丸中， 发现移植后供体精原细胞以成对、 短链 状或小网状结构定居在受体生精小管内， 较兔在受 体生精小管内的克隆面减少。猪的精原细胞在受体 生精小管内， 形成由细胞间桥相连的圆形细胞链和 网络样结构， 但未观察到精子发生的更高分期。牛 的精原细胞在受体生精小管内开始呈现与猪相似的 结构， 但随后变成纤维组织。马的精原细胞几乎在 受体生精小管内不能增殖。Dobrinski 等 5观察

12、到许 多哺乳类动物新鲜或冷冻后的精原细胞能在小鼠睾 丸中定居， 但不能分化。认为供体和受体间种系差 异越大， 在受体睾丸内完全进行供体来源精子发生 的可能性越小。Shinohara 等 6认为： 该实验所用受 体经过白消安预处理， 白消安同样对受体 Sertoli 细 胞有毒性作用， 可能影响了 Sertoli 细胞的分泌功能， 使受体 Sertoli 细胞不能支持供体精原细胞分化； 研 究已证实受体鼠选用未成年小鼠较成年小鼠更适 合， 而该实验选用成年小鼠作为受体。基于以上情 况， 该实验所推测得到供体精原细胞不能分化的原 因， 不能被大家认可。尽管睾丸具有免疫豁免特性， 是否受体 Sert

13、oli 细胞能够支持种间差异越大的供体 精原细胞分化， 仍存争议， 尚需进一步研究。 1. 3 增加移植效能的方法 Sertoli 细胞表达功能 性 FasL， 与致敏 T 细胞表面的 Fas 相互作用， 致使侵 入睾丸内的 T 细胞凋亡， 对保持睾丸组织内的免疫 豁免状态起决定作用 7。Shimamoto 等8向接受仓 鼠精原细胞移植的大鼠生精小管内， 注射 -干扰素 （-干扰素可上调 FasL 的表达） ， 或注射大鼠自身的 前房眼细胞 （前房眼细胞表达 FasL） ， 使受体睾丸内 FasL 的表达增加， 生精小管内的免疫豁免状态明显 增强， 移植效能增加。Zhang 等 9将 Long

14、-Evans 大 鼠精原细胞移植入白消安处理过的 SD 大鼠睾丸内， 予受体环孢霉素治疗， 并予适量卵泡刺激素刺激 Sertoli 细胞增殖、 睾酮促进精子发生， 发现应用环孢 霉素抑制受体免疫排异后， 可明显增加供体精原细 胞克隆数量与精子发生质量， 这提示： 提高受体睾丸 的免疫豁免特性是增加不同种属间移植效能的有效 方法。Ogawa 等 10将携带 lacZ 报告基因的转基因 小鼠精原细胞移植入 SD 大鼠生精小管内， 在 55% 的大鼠睾丸内观察到小鼠精原细胞克隆， 并可见到 小鼠来源的精子发生。移植前， 以白消安破坏大鼠 内源性生精功能较小鼠困难， 建立大鼠隐睾模型， 并 用 GnR

15、H 激动剂亮丙瑞林处理大鼠， 可增加小鼠精 原细胞在大鼠睾丸内的克隆数量。Ogawa 等 10认 为在精原细胞移植前， 对受体睾丸做预处理是非常 重要的， 且在不同种属间有差别。 1. 4 冷冻保存后的精原细胞移植 Ogawa 等 11将 冻存复温后的仓鼠精原细胞异基因移植入免疫缺陷 小鼠睾丸内， 观测到仓鼠来源的精子发生。但应用 冻存复温后的精原细胞移植的结果不如应用新鲜精 原细胞悬液移植后的结果好， 在前者的小鼠生精小 管内观察到一些形态异常的仓鼠精子细胞， 尤其长 形精子细胞头部常存在异常； 在前者的小鼠附睾内 仓鼠精子顶体也常常缺如或发育不良。而 Kanatsu- Shinohara

16、等 12将转基因小鼠精原细胞冷冻保存后 移植入 W/ WV小鼠睾丸中， 发现受体睾丸内供体来 源精子发育正常， 采用人工授精的方法可产生健康 的子代。这说明： 不同冷冻保存方法对精原细胞的 952第 3 期 马良宏 等 精原细胞异基因移植研究进展及其面临的困惑 生精质量有重要影响， 不同种属精原细胞对外界环 境变化的抵抗力不同。目前在冷冻保存剂的选用和 配方上尚未找到一种理想的方案， 尚需进一步研究。 1.5 体外培养后的精原细胞移植 Nagano 等 13将 转基因小鼠精原细胞在含 DMEM +10% 胎牛血清的 STO 滋养层细胞上培养 4 个多月， 将其移植入 C57BL/6 小鼠睾丸中

17、， 能成功进行供体来源的精子 发生。在有滋养层细胞的培养条件下， 精原细胞可 保持活性达 111 d。滋养层细胞与精原细胞间的相 互作用所分泌的生长因子或细胞因子， 可能促进了 精原细胞增殖。Kanatsu-Shinohara 等 14在培养液中 加入胶质细胞源性神经营养因子、 表皮生长因子、 碱 性成纤维细胞生长因子、 白血病抑制因子， 可在体外 使精原细胞持续增殖 5 个月以上， 细胞数量扩增 1014多倍， 将其移植入突变不育鼠株 W/ WV生精小管 内， 这种体外培养的精原细胞可在异基因睾丸内增 殖、 分化。建立精原细胞体外培养系统， 不仅有助于 探寻精子发生机制， 而且为人类未来建立

18、 “精原干细 胞库” 和开展精原细胞的基因修饰治疗奠定基础。 2 人类精原细胞异基因移植 Reis 等 15将人类精原细胞移植入突变不育鼠 株 W/ WV和 SCID 小鼠睾丸内， 未能建立人类精原细 胞克隆。此实验中， 人类精原细胞来自非梗阻性或 梗阻性无精子症成年患者穿刺所取的睾丸组织。对 移植后 150 d 的小鼠睾丸组织做切片检测， 生精小 管内主要是小鼠 Sertoli 细胞， 并没有发现异基因来 源的精原细胞。Reis 推测人类精原细胞不能在小鼠 睾丸内生存和克隆， 是由于细胞间的互不相容以及 种属间的免疫排斥所综合作用的结果。然而， Reis 的结论并不为大家所认可。理由如下：

19、为了鉴定 人类精原细胞， 作者所使用抗体靶向的前顶体蛋白， 仅在分化型精原细胞的后期出现， 未分化型精原细 胞和早期的原始精母细胞不能用该方法检测到； 所移植的人类精原细胞数量少； 未使用任何方法 来进一步增加小鼠睾丸的免疫豁免特性； 所选用 的受体既不是未成年鼠， 也不是新生鼠； 所选用的 小鼠已予白消安预处理或本身就没有精子发生的能 力 （W/ WV鼠株携带不能生精的突变基因） 。 白消安可能影响受体 Sertoli 细胞的分泌功能， 并影响支持精原细胞分化的雄激素结合蛋白构型。 另外， 生精功能受阻受体的 Sertoli 细胞可能存在分 泌功能障碍， 不能与移植的精原细胞相互作用。因 此

20、， Shinohara 等 6认为该实验所得到的阴性结果， 不是由于细胞间相互作用的不相容， 而部分因 Reis 所选用的实验方法和受体不当所致。随后， Nagano 等 16将梗阻性无精子症患者和精子发生成熟受阻 患者的精原细胞移植入免疫缺陷小鼠睾丸中， 发现 人类精原细胞至少存活6 个月以上， 在移植后的第1 个月观察到人类精原细胞增殖， 实验取得成功。这 启示人们： 人类精原细胞不但可在啮齿类动物睾丸 中保存， 其数量尚可扩增。 3 精原细胞异基因移植研究的意义 3.1 以动物为宿主， 保存肿瘤患者生育力 冷冻保 存和移植技术联合， 可用于保存肿瘤患者的性腺细 胞或组织， 尤其对接受全身

21、大剂量放疗或化疗的青 少年肿瘤患者的生育力保存更有价值。移植的人类 精原细胞亚群能在动物睾丸内有丝分裂， 将患者的 精原细胞异基因移植入动物睾丸内， 可增加人类精 原细胞的数量， 并有使精原细胞减数分裂的潜能。 对肿瘤患者来讲， 这种冷冻保存联合精原细胞移植 技术较单独应用冷冻保存有明显优势， 因为前者可 使移植的精原细胞在受体睾丸内数量增加。在放疗 或化疗前获取肿瘤患者的精原细胞， 冷冻复温后移 植入免疫缺陷动物睾丸内， 放疗或化疗结束后， 可将 大量的精原细胞从宿主动物体内转移回患者睾丸 内， 使患者恢复生育能力。 Jahnukainen 等 17将自发性白血病大鼠肿瘤细 胞混入睾丸细胞悬

22、液中， 移植入健康 PVG 大鼠睾丸 内， 发现受体发生白血病； 将混有肿瘤细胞的睾丸细 胞悬液冷冻保存后移植， 也得到相同的结果。在宿 主动物体内进行精原细胞移植， 安全性受到人们的 密切关注， 可能会致肿瘤再次复发， 也可能会将动物 体内的病毒一同带入人类体内。 von Schnfeldt 等 18采用免疫磁珠分选方法从 睾丸细胞悬液中富集精原细胞， 避免了所移植的细 胞悬液中混有肿瘤细胞。精原细胞膜表面表达干细 胞因子受体 （c-kit） ， 他们以 c-kit 抗体作为细胞分选 免疫磁珠， 从仓鼠、 小鼠、 狨猴睾丸细胞悬液中纯化 出部分精原细胞。采用这种细胞分选技术， 可避免 供体细

23、胞悬液受肿瘤细胞污染， 避免了移植后肿瘤 复发的风险。然而，c-kit 在所有分化期精原细胞中 表达， 但在未分化的精原细胞中微弱甚至没有表达， 以 c-kit 抗体为生精细胞分选免疫磁珠仅使分化期 精原细胞富集。真正的干细胞不能通过 c-kit 免疫 检测， 而且应用 c-kit 抗体偶联磁珠所分选的细胞再 次增殖的指数降低 19。改进方法将肿瘤细胞在移 植前从精原细胞悬液中清除出去， 或采用新技术早 期检测精原细胞悬液中混有的肿瘤细胞， 是另一条 062中华男科学杂志2006 年 3 月 第 12 卷 可选之路， 这种免疫磁珠分选技术目前尚没被接受 作为常规方法。 3. 2 应用精原细胞移

24、植技术治疗不育 人体 Serto- li 细胞和 Leydig 细胞分泌功能异常 （如： 精索静脉曲 张） ， 有时可致无精子症。Ogawa 等 20将这种因分 泌功能异常致不育的患者精原细胞， 移植入 Y 染色 体 AZFc 区域缺失的无精子症患者生精小管内， 可在 受体睾丸内产生供体来源的精子。提示不育受体 Sertoli 细胞和生精小管内的生化环境， 可能支持不 育供体精原细胞进一步分化。这说明， 将没有遗传 缺陷的无精子症患者的精原细胞， 移植入因遗传缺 陷致生精过程完全受阻的无精子症患者睾丸内， 可 在后者睾丸内产生前者来源的精子。移植前给受体 促性腺激素释放激素 （GnRH） 拮抗

25、剂破坏其生精功 能， 清除受体内原有的精子细胞、 精母细胞以及精原 细胞。移植后从受体得到供体精子， 采用辅助生育技 术使供体生育。但在应用该方法前， 需考虑伦理问题。 对梗阻性无精子症患者， 采用人工授精或体外 受精 （in vitro fertilization， IVF） 的方法， 可使不育夫 妇获得生育。将梗阻性无精子症患者的精原细胞， 移植入另一 Y 染色体 AZFc 区域缺失的无精子症患 者睾丸内， 临床应用中有一定局限性。然而， 对一些 无精子症患者而言， 在接受精原细胞移植后， 假如受 体能将供体来源的精子射入女性生殖道， 而不是受 体本身的精子， 这类夫妇中有些愿意选择经过性

26、交 的方式受孕。但要应用该方法， 需打破传统生育观 念的束缚。 3. 3 联合 ICSI 技术治疗不育 在非梗阻性无精子 症患者中， 存在相当一部分能进行活性精子发生的 睾丸组织功能巢， 这些巢内的精子发生状态可进展 至精子细胞或精子形成阶段。从非梗阻性无精子症 患者活性精子发生巢内获取精子或次级精母细胞进 行 ICSI， 将受精卵移植回子宫， 可发育形成正常胚 胎 21。相反， 对那些在精子发生过程中减数分裂前 就完全阻滞的非梗阻性无精子症患者， 由于精子发 生巢内没有单倍体细胞， 无法采用辅助生育技术使 其生育。目前对精原干细胞体外诱导分化形成单倍 体生殖细胞尚未成功， 精原细胞异基因移植

27、与 ICSI 技术的联合， 是一个可选方案。将这类患者精原细 胞移植入动物睾丸内， 从动物睾丸内获得人类单倍 体生殖细胞后， 用于 ICSI。对因遗传缺陷直接影响 精原细胞发育和功能的无精子症患者， 不适合精原 细胞异基因移植的方法。对那些在减数分裂前就出 现完全性生精功能阻滞的不可治愈的患者 （如： 精索 静脉曲张、 腮腺源性睾丸炎、 外伤等） ， 这种联合方法 是此类患者生育的唯一希望。 尽管在非梗阻性无精子症患者睾丸组织中， 广 泛和大量地分布着精原细胞巢， 但在穿刺所取得睾 丸组织中不易寻找到单倍体生殖细胞。将精原细胞 移植入动物睾丸内， 成功诱导其在动物睾丸内减数 分裂， 促其完成精

28、子发生过程， 这可增加单倍体生殖 细胞的数量， 用于 ICSI。 3. 4 联合冷冻保存技术保护珍稀物种 冷冻保存 和移植技术联合， 可用于保存没有生育力的老年动 物、 有经济价值动物及濒危动物的精原细胞株。在 进行冷冻保存和移植前， 建立体外培养系统使精原 细胞数量扩增， 可冻存大量的精原细胞。冷冻复温 后的精原细胞， 移植入宿主动物睾丸内其数量可进 一步扩增。一些供体精原细胞能在受体睾丸内产生 精子， 通过辅助生育技术使这些物种得以延续。 4 精原细胞异基因移植技术临床应用的困惑 将从动物睾丸中产生的人类精子细胞或精子用 于辅助生育技术， 需考虑伦理问题， 并需关注动物对 人在遗传、 免疫

29、及感染等方面易感的相关风险性问 题 22， 而这些问题也正是临床应用所面临的困惑。 4.1 感染性问题 虽然， 细胞核内的 DNA 受核膜 保护， 在核的周围又有胞质环绕， 理论上讲， 在动物 睾丸中产生的人类精子或精子细胞核中的遗传物质 不可能受动物细胞核中的 DNA 污染， 但有必要通过 进一步研究来证实。在受体睾丸内人类精子发生的 过程中， 人类精原细胞与受体 Sertoli 细胞或精原细 胞长期接触， 可能会将受体种属特异的分子或抗原 结合到人类精原细胞膜上。将这种从动物睾丸中获 取的人类精子细胞或精子用于 ICSI， 所产生的人类 胚胎中可能携带动物的抗原分子， 而这种抗原分子 在正

30、常人类中没有。在宿主动物睾丸内存在的病 毒， 可能感染移植的人类精原细胞， 进而感染单倍体 细胞， 采用辅助生育技术， 可能会将动物体内的病毒 传播给人类胚胎细胞和组织。 4. 2 遗传性问题 将从动物睾丸中产生的人类精 子用于 ICSI， 可能会通过 ICSI 使人类获得遗传性疾 病。Zech 等 23采用 ICSI 的方法来辅助生育， 在所 出生的儿童中， 发现有合并脑积水的 9 号染色体三 体型， 以及合并开放性腰骶脊髓膜膨出的型 Ar- nold-Chiari 综合征的先天性畸形患儿。另外， 在从 动物睾丸内收集人类精子和进行 ICSI 的过程中， 可 能会感染一些未知危险因素， 这与

31、精子细胞的异基 因来源有关， 也是辅助生育技术所带来的后果。 4. 3 后生性问题 将从动物睾丸中产生的人类精 162第 3 期 马良宏 等 精原细胞异基因移植研究进展及其面临的困惑 子用于辅助生育技术， 也有后生性危险因素的存在。 辅助生育技术可能通过后生性机制改变胚胎细胞的 生理， 如在受精卵植入前的早期阶段， 在整个再甲基 化的过程中， 甲基化的状态发生了改变。这种在基 因表达上的影响， 可直接影响胚胎的培养条件或配 子的生理调控， 这样的影响力可通过应激通路激发 机制 （如： 细胞凋亡等） 引出 24。 4. 4 伦理问题 尽管在动物睾丸内可诱导人类精 原细胞减数分裂， 并诱导精子发生

32、过程， 为缺乏单倍 体细胞的不育患者提供了一种令人振奋的可选治疗 方法， 但在应用该方法的过程中不仅要考虑安全性 问题， 还要考虑伦理问题。对那些无法治疗的非梗 阻性无精子症患者， 不适合应用人工授精或 IVF 的 方法来生育， 将他们的精原细胞异基因移植入动物 睾丸内几周， 随后从动物睾丸内获取由他们的精原 细胞增殖分化所产生的单倍体细胞， 进行 ICSI。让 患者对这种治疗方法做出选择， 他们常常考虑到自 己的生殖细胞要在动物睾丸内 “培养” 几周， 难以接 受。但对那些具有强烈生育愿望的不育夫妇， 尽管 考虑到要用动物睾丸来产生他们的单倍体细胞， 他 们也会从这种不愉快的情感中解脱出来，

33、 接受这种 治疗方法。 在这种情形下， 医生也陷入了困惑之中。一些 医生认为： 选择治疗不育的方法是患者一项最基本 的人权， 假如这种治疗方法是安全的， 他们可以选择 将自己的生殖细胞移植入动物生精小管中。另一些 医生则认为： 将人类生殖细胞与动物生殖细胞体内 共培养不符合伦理要求， 拒绝使用该项技术。因此， 要在伦理上完全接受该项移植技术， 也许还有很长 的路要走。 总之， 精原干细胞以其独有的特性吸引着精原 细胞异基因移植研究不断向前发展， 结合体外培养、 冷冻保存、 辅助生育等方法， 必将在基础医学、 临床 研究、 动物繁殖等领域有广阔的应用前景。虽然， 目 前将此技术应用于临床尚有许多

34、困惑， 相信随医学 和社会科学的发展， 这些问题终会得到解决。 参考文献 1 Matzuk MM. Germ-line immortality J . Proc Natl Acad Sci USA， 2004， 101 （47） ： 16395-16396. 2 Clouthier DE，Avarbock MR，Maika SD，et al. Rat spermatogen- esis in mouse testis J . Nature， 1996， 381 （6581） ： 418-421. 3 Russell LD，Brinster RL. Ultrastructural observa

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