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1、论著 纳洛酮对急性缺血 再灌注心肌细胞 B c l 2蛋白 和肿瘤坏死因子 表达的影响 汤晓琴赵建洪张正义张煦宋少莉 【摘要】 目的从分子水平探讨纳洛酮对急性心肌缺血 再灌注细胞凋亡和凋亡相关基因b c l 2产物 B c l 2蛋白表达的影响,及其对心肌的保护作用。方法 S D大鼠3 0只, 随机分成3组,单纯缺血 再灌注组, 纳洛酮干预组(缺血前1 0mi n及再灌注2h后腹腔注射纳洛酮0 . 5 1 7mg / k g )和正常对照组,每组1 0只。实验 动物采用戊巴比妥钠( 4 0mg / k g )腹腔注射麻醉,开胸,打开心包,穿线结扎左冠状动脉前降支再恢复灌注制 备大鼠心肌缺血 再
2、灌注模型。用免疫组化法检测心肌组织B c l 2蛋白表达;用放射免疫法测定血清中肿瘤 坏死因子 ( T NF )的含量。结果 正常对照组无B c l 2蛋白表达, T NF 含量为( 0 . 3 9 0 . 0 6 ) g / L ;单 纯缺血 再灌注组B c l 2蛋白表达及T NF 含量均增加。与单纯缺血 再灌注组比较,纳洛酮干预组B c l 2 蛋白表达明显增加( + + + v s .+) ; T NF 含量明显降低 ( 0 . 5 5 0 . 1 2 ) g / L比( 0 . 8 6 0 . 1 1 ) g / L , P? A)i n B = 9 8 ,5 n :3 7 ; l
3、2 9 34 h 3 m3 c h 5 n i s m 2 6 ; 9 2 4 3 c 4 i v 33 6 6 3 c 4 2 6 n 5 l 2 7 2 n 32 nm8 2 c 5 9 : i = m.Ce t h o d s T h i 9 4 8S D9 5 4 sD) 2 69 5 4c 2 9 2 n 5 9 8 5 9 4 3 9 8 ? A m2 : 3 l i n9 5 4 s .T h 3 5 n i m5 l s)? Ai n B = 9 8b 8i n h i b i 4 i n g4 h 35 ; 2 ; 4 2 s i s2 6 c 5 9 : i 2 m8 2
4、c 8 4 3 si n : = c 3 :b 8T NF5 n := ; 9 3 g = l 5 4 i n g; 9 2 4 3 i n 3 7 ; 9 3 s s i 2 n2 6 b c l 2g 3 n 3 . 【 Ke yw o r d s 】i s c h 3 mi 5 / 9 3 ; 3 9 6 = s i 2 ni n B = 9 8 ;m8 2 c 5 9 : i = m; 9 2 4 3 i n3 7 ; 9 3 s s i 2 n ;4 = m2 9n 3 c 9 2 s i s 6 5 c 4 2 9 ; B c l 2 ; n 5 l 2 7 2 n 3 基金项目E
5、甘肃省自然科学基金资助项目( LS 0 2 2 2 3 2 6 ) 作者单位E 7 3 0 0 0 0甘肃,兰州医学院(汤晓琴,张煦) ;兰州医学 院第二附属医院(赵建洪,张正义) ;第一附属医院(宋少莉) 作者简介E汤晓琴( 1 9 6 1 ) ,女(汉族) ,甘肃省民乐县人,医学硕 士,副教授( M m5 i l E 4 5 n g 7 F Nl O = . 3 : . c n ) 。 纳洛酮为阿片受体拮抗剂,能拮抗因应激反应 导致体内骤然产生大量阿片肽所引起的各种病理过 程,如抑制呼吸系统P神经系统和心血管系统,因此, 纳洛酮在临床被广泛用于吸食海洛因过量P酒精中 毒等急症 14 I,且
6、用药安全,疗效可靠。自1 9 8 2年 F 5 g b 3 mi等 5 I首次报道纳洛酮对缺血 再灌注心肌 有防治作用后,相继有研究证明纳洛酮对急性心肌 梗死( ? )合并心律失常有较好疗效,可缩小心肌 缺血范围P改善血液循环P减轻心脏负担等,国内杨 天德等在此方面作了大量工作 6 , 7 I。但从分子水平研 究纳洛酮对心肌缺血 再灌注后心肌细胞凋亡和凋 亡相关基因b c l 2产物B c l 2蛋白表达及肿瘤坏 死因子 ( T NF )含量有何影响,至今尚未见中P 外文文献报道,为此,本研究拟对此作初步探讨。 Q 材料与方法 Q . Q 材料E盐酸纳洛酮( 1ml , 0 . 4mg , 0
7、 2 0 7 1 5 2 )由 034 中国危重病急救医学2 0 0 5年7月第1 7卷第7期 R h i nR 9 i 4 R 5 9 3?3 : , S = l 82 0 0 5 , T2 l . 1 7 , N2 . 7 军事医学科学院研制,北京四环医药科技股份有限 公司惠赠。B c l 2免疫组化试剂盒购自武汉博士德 生物工程有限公司。T NF 放射免疫试剂盒由北 京东雅生物技术研究所生产( 5 0 T) 。主要仪器有石 蜡切片机( AO 8 2 0 ,美国) ,心电图机( S B6 1 3 D , 日本) ,人工呼吸机( D H 1 ,浙江大学医学仪器厂) 。 1 . 2 动物分组及
8、心肌缺血 再灌注模型制备: 3 0只 S D大鼠体重( 2 5 0 3 0 ) g , 雌雄不拘,由兰州医学院 实验动物中心提供。随机分成3组( n =1 0 ) 。 A组为 单纯缺血 再灌注组, B组为纳洛酮干预组, C组为 正常对照组。B组于缺血前1 0mi n及再灌注2h后 腹腔注射纳洛酮0 . 5 1 7mg / k g , A组和C组于缺血 前1 0mi n及再灌注2h后各注射与B组同体积的 生理盐水。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠4 0mg / 1 0 0ml ( 4 0mg / k g )麻醉,仰卧固定于鼠台上,胸骨左侧去 毛切开皮肤,切断第3 5肋骨暴露心脏,剪开心包, 用0 4号丝线
9、结扎左冠状动脉前降支,术中用呼吸 机维持人工呼吸。心肌缺血3 0mi n后,剪断结扎线 恢复心肌再灌注4 . 5h ,术前、结扎后和再灌注后各 描记心电图1次,以结扎后S T段升高为心肌缺血 成功。正常对照组仅穿线而未结扎。 1 . 3 B c l 2蛋白表达检测:实验结束后,向大鼠腹 腔注射戊巴比妥钠( 4 0mg / k g )麻醉,开胸,活体取 出心脏,用冰生理盐水( 4)将心脏清洗干净,放入 4g / L多聚甲醛中固定2 4h ( 4) 后,常规石蜡包 埋,于心肌梗死区中部沿左室轴线每隔1mm连续 切取数张5 m厚的切片,进行B c l 2蛋白表达检 测,其步骤严格按试剂盒提供的生物素
10、卵白素过氧 化物酶( S AB C )法进行免疫组化反应。结果判断:胞 浆中有棕黄色颗粒者为阳性表达细胞;无棕黄色颗 粒者为阴性表达细胞。镜下无阳性表达细胞者为阴 性( -) ;阳性表达细胞数2 / 3视 野者为强阳性( + + +) 。 1 . 4 T NF 测定: 在缺血后1 0mi n 、再灌注4 . 5h 后各采血2ml , 4下30 0 0r / mi n离心,取上清,统 一时间测定T NF 含量。 1 . 5 统计学处理:用S P S S 8 . 0软件对实验数据进 行统计学处理,结果以均数标准差( x s )表示。 3组组内比较用配对样本t验验,各组间比较采用 单因素方差分析。
11、2 结果 2 . 1 B c l 2蛋白表达: B c l 2蛋白阳性表达细胞主 要位于心肌梗死区与非梗死区交界处。A组有少量 阳性表达细胞( +,彩色插页图1 ) ;B组有大量阳性 表达细胞( + + +,彩色插页图2 ) ; C组无阳性表达细 胞( -) ,彩色插页图3 ) 。 2 . 2 T NF 含量变化( 表1 ) :组内比较, A组差异 有显著性( P0 . 0 5 ) ;再灌注4 . 5h时, A组 与B 、 C组比较差异有显著性( P均0 . 0 5 ) 。表明血清中 T NF 含量在B组和C组中含量较低, 而在A组 中高。 表1血清中T N F 含量的变化( x s , n
12、=1 0 ) T a b l e1 T N F c o n c e n t r a t i o ni ns e r u m i nt h r e eg r o u p s ( x s , n =1 0 ) g / L 组别缺血1 0mi n再灌注4 . 5h A组0 . 4 3 0 . 0 50 . 8 6 0 . 1 1 B组0 . 4 7 0 . 0 30 . 5 5 0 . 1 2 * C组0 . 4 0 0 . 0 80 . 3 9 0 . 0 6 * 注:与A组比较: *P 0 . 0 1 ;与本组缺血 1 0mi n比较: P 0 . 0 1 3 讨论 传统观念认为急性心肌缺血所致
13、的心肌损伤主 要是心肌坏死。目前的研究证明,心肌细胞在长时间 缺血或缺血 再灌注后,同时还存在心肌细胞凋亡。 凋亡基因和抗凋亡基因的相互作用决定了凋亡的启 动或抑制。在与细胞凋亡有关的基因中, b c l 2是目 前公认的促进细胞生存、抑制细胞凋亡的长寿基因, 正常情况下, B c l 2蛋白在心肌中不表达。本实验中 发现,左室梗死与非梗死交界处B c l 2蛋白表达增 加。其机制可能为心肌细胞受到缺血损伤时, b c l 2 基因立即启动,诱导b c l 2基因产物B c l 2蛋白表 达,从而抑制或逆转了细胞凋亡的发生。 B c l 2蛋白 抑制细胞凋亡的机制尚不清楚,可能与抗氧化途径、
14、阻止细胞内钙重新分布、直接或间接影响其他死亡 信号对细胞的作用以及加速D NA修复作用有关。 因此,对心肌细胞凋亡机制的研究与干预有可能为 缺血性心脏提供一条新的防治途径。纳洛酮对心肌 缺血 再灌注损伤有保护作用,可以减轻细胞内钙超 载,减少氧自由基的产生等,故推测纳洛酮可能通过 上述几种机制减轻或抑制缺血 再灌注心肌细胞的 死亡过程而达到保护心肌的作用。 T NF 在细胞凋亡发生机制中有非常重要的 意义,同时它也是一个强有力的促炎细胞因子。在 缺血 再灌注心肌中, T NF不仅直接损害心肌组织, 且T NF /跨 膜肿瘤坏死因子受体( t r a n s me mb r a n e t u
15、mo r n e c r o s i s f a c t o r r e c e p t o r , mT NF R 1 )作为细胞 因子网络中的一个重要环节,可以诱导产生其他多 134 中国危重病急救医学2 0 0 5年7月第1 7卷第7期 C h i nC r i t C a r eMe d , J u l y2 0 0 5 , Vo l . 1 7 , No . 7 种炎性介质,如磷脂酶A2( P L A2) 、血小板活化因子 ( P AF ) 、氧自由基等,进一步造成心肌微循环障碍、 缺血、缺氧和弥散性微血管渗漏,致使大量炎性细胞 浸润和聚集,并出现心肌细胞的水肿和炎性坏死 8 。 本
16、实验结果显示,纳洛酮预处理后, T NF 明显降 低,说明纳洛酮可以通过降低T NF 的含量,导致 炎性介质释放减少,从而减轻心肌细胞的水肿和坏 死,同时也可促进心肌细胞B c l 2蛋白表达,延长 心肌细胞的存活,有效抑制缺血 再灌注所致心肌损 伤。同时纳洛酮干预还可使凋亡抑制基因b c l 2产 物B c l 2蛋白表达明显增强。推测纳洛酮的保护作 用可能与以下因素有关: 通过改善心肌血流量,抑 制细胞内钙超载和T NF 的产生,清除氧自由基, 减少中性粒细胞浸入等途径,从而上调B c l 2蛋白 并与之发生协同的抗凋亡作用 91 0 ; 可能通过上 调c f o s 、 c j u n等
17、基因的表达,间接上调b c l 2基 因等晚期基因的表达,从而发挥抗凋亡作用。 纳洛 酮还可通过抑制T NF 的产生,减轻T NF 激 活心肌细胞表面T NF R 1 ,与其结合后诱导T NF R 1 胞浆段的受体反应蛋白,引起一系列反应,最终激活 c a s p a s e 而引起的心肌细胞凋亡 1 1 。这从另一个角度 说明纳洛酮通过抑制T NF 的产生,从而阻止心 肌细胞的凋亡。 综上所述:本实验结果说明,纳洛酮可以抑制 T NF 的产生, 促进心肌细胞B c l 2蛋白表达,抑 制心肌细胞的坏死与凋亡,最终达到保护缺血 再灌 注损伤心肌的目的。 参考文献: 1 姜志民,查舜.以纳洛酮为
18、主综合抢救急性海洛因中毒3 7例 J . 中国危重病急救医学, 2 0 0 0 , 1 2 : 4 3 1 . 2 周裔培,秦放军,石志斌.纳洛酮抢救肺性脑病并多器官功能失常 9例疗效观察 J .中国危重病急救医学, 1 9 9 9 , 1 1 : 7 6 4 . 3 L i a oSL , C h e nW Y, R a u n gSL , e t a l . Ne u r o p r o t e c t i o no f n a l o x - o n ea g a i n s ti s c h e mi ci n j u r yi nr a t s :r o l eo fmur e c
19、e p t o ra n t a g o - n i s m J . Ne u r o s c i L e t t , 2 0 0 3 , 3 4 5 : 1 6 9 1 7 2 . 4 We b e rT P , S t y p ma n nJ , Me i s s n e rA, e ta l . Na l o x o n ei mp r o v e s f u n c t i o n a lr e c o v e r yo fmy o c a r d i a ls t u n n i n gi n c o n s c i o u sd o g s t h r o u g h i t sa
20、 c t i o n o n t h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m J .B rJ An a e s t h , 2 0 0 1 , 8 6 : 5 4 5 5 4 9 . 5 F a g b e mi D , L e p r aH, P a r r t t JR . Na l o x o n ei n h i b i t e a r l ya r r h y mi c r e s u l t i n gf r o m a c u t ec o r o n a r yl i g a t i o n J . B rJP h a r ma c o l
21、 , 1 9 8 2 , 7 5 : 5 0 4 . 6 杨天德,刘桥义,王舟琪.纳洛酮对缺血再灌注心肌局部血流量的 变化的影响 J .中华麻醉学杂志, 1 9 9 5 , 1 5 : 4 3 9 4 4 1 . 7 杨天德,刘桥义,王舟琪.纳洛酮对缺血 再灌注心肌腺苷酸环化 酶活性和环磷酸腺 苷含 量的 影响 J .中国 危重 病急 救医 学, 1 9 9 6 , 8 : 5 2 1 5 2 2 . 8 杜成辉,方国恩,陈战,等.跨膜肿瘤坏死因子受体在大鼠多器官 功能障碍中的表达及其意义 J .第二军医大学学报, 2 0 0 3 , 2 4 : 7 3 7 6 . 9 杨天德.刘桥义.王舟琪
22、.纳洛酮对缺血再灌注心肌脂质过氧化物 和钙含量的影响 J .现代应用药学, 1 9 9 6 , 1 3 : 3 5 . 1 0杨天德,刘桥义,王舟琪.纳洛酮对缺血再灌注心肌微循环血流 量极其超微结构变化的影响 J .微循环技术杂志, 1 9 9 7 , 1 : 6 8 . 1 1胡野,凌志强,单小云.细胞凋亡的分子医学 M .北京:军事医学 科学出版社, 2 0 0 2 . 2 3 0 2 3 1 . (收稿日期: 2 0 0 5 0 3 0 8 修回日期: 2 0 0 5 0 6 2 8 ) (本文编辑:李银平 = = = = b b b b ) c读者c作者c编者c 欢迎订阅d e e f
23、年g中国中西医结合急救杂志h g中国中西医结合急救杂志h系中国中西医结合学会主办、天津市天和医院承办的全国性科技期刊 (为中国中西医结合学会系列杂志之一,由g中西医结合实用临床急救h杂志更名) ,是我国中西医结合急 救医学界权威性学术期刊,已进入国内外多家权威性检索系统。本刊为双月刊, 6 4页,国际通用1 6开大 版本, 8 0克双胶纸印刷。欢迎广大读者到当地邮局办理2 0 0 5年的订阅手续,邮发代号: 6 9 3 ,定价:每 期6 . 9元,全年4 1 . 4元。 g 中国中西医结合急救杂志h已经进入俄罗斯g文摘杂志h ( AJ ) 、 i中国期刊网j 、 i中国学术期刊 (光盘版) j
24、 、 i万方数据网络系统( C h i n ak n f o ) j 、 i中文科技期刊数据库j 、 i e m1 2 0 . c o m危重病急救在线j 以及国家中医药管理局i中国传统医药信息网j ( h t t p : l l mmm. Me d i c i n eC h i n a . c o m) 。投本刊论文作者 需对本刊以上述方式使用论文无异议,并由全部作者或由第一作者全权代表其他作者在版权转让协议 和校稿上签字同意。稿酬已在本刊付酬时一次付清,不同意者论文可不投本刊。 (期刊编辑部) c234c 中国危重病急救医学2 0 0 5年7月第1 7卷第7期 C h i nC r i t C a r eMe d , J u l y2 0 0 5 , no l . 1 7 , No . 7