组织工程化神经修复周围神经缺损的实验研究.pdf

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1、第1 6 卷第 1 5 期 2 0 0 6 年 8 月 中国现代医学杂志 C h i n a J o u r n a l o f Mo d e r n Me d i c i n e V o l . 1 6 N o . 1 5 A u g . 2 0 0 6 文章编号: 1 0 0 5 - 8 9 8 2 ( 2 0 0 6 ) 1 5 - 2 3 0 8 - 0 3 论著 组织工程化神经修复周围神经缺损的实验研究 利春叶 ， 廖全全 ， 张 洪“ ， 彭爱军 ， 李文萍3 ( 1 . 南方医 科大学附属深圳宝安医院 骨I I 科， 广东 深圳 5 1 8 1 0 1 ; 2 . 深圳市第二人民

2、医院 骨科， 广东 深 ) 1 5 1 8 0 3 5 ; 3 . 广州医学院附属广东省妇儿医院， 广东 广州 5 1 0 0 1 0 ) 摘要: 目的 通过人工神经修复神经缺损的实 验研究， 为神经组织工程的进一步研究和临床应用提供实验 依据。方法 分3 组修复大鼠1 c m长坐骨神经缺损: ( A组) 含许旺细胞的移植体; ( B组) 无许旺细胞的移植 体; ( C对照组) 自 体神经移植。 术后 拍周内， 进行肌肉湿重、 电生理等测定以及组织学 观察、 图 像分析。 结果 许旺细胞能与P L G A纤维构成活性细胞一材料复合物; 神经修复术后1 0 周， A , C两组电生理特性、 组织

3、学变 化以及肌肉湿重等测定均明显优于B组， A组与C组之间无显著差别。结论许旺细胞能与P L G A纤维在体 外构建具有活性的神经移植体并能够促进神经再生， 其修复效果接近于自 体神经移植。 关键词: 组织工程; 许旺细胞; 神经移植体; 周围 神经再生; 大鼠 中图分类号 : R- 3 3 2立献株i l? 1 R - A E x p e r i me n t o f t i s s u e e n g i n e e r i n g b i o a r t i f i c i a l n e r v e g r a f t i n r e p a i r o f p e r i p h e

4、 r a l n e r v e L I C h u n - y e , L I A O Q u a n - q u a n t , Z H A N G H o n g z , P E N G A i - j u n t , L I We n - p i n g ( 1 . D e p a r t m e n t o f O r t h o p a e d i c s ， t h e A ff i l i a t e d S h e n z h e n B a o a n H o s p i t a l of S o u t h M e d i c a l U n iv e r s i ty

5、, S h e n z h e n , G u a n g d o n g 5 1 0 1 8 1 , P . R . C h i n a ; 2 . D e p a r t m e n t o f O r t h o p a e d i c s , t h e S e c o n d P e o p l e s H o s p i t a l o f S h e n z h e n , S h e n z h e n , 5 1 0 1 8 1 , P . R . C h i n a ; 3 . T h e A f f i l i a t e d G u a n g d o n g P r

6、o v i n c i a l W o m e n a n d C h i l d H o s p i t a l o f G u a n g z h o u M e d i c a l C o l l e g e , G u a n g z h o u , G u a n g d o n g 5 1 0 0 1 0 , P . R . C h i n a ) A b s t r a c t : ( O b j e c t i v e T h r o u g h t h e e x p e r i m e n t o f u s i n g b i o a r ti f i c i a l n

7、 e r v e s u b s t it u t e f o r n e r v e a u t o g r a f t t o r e p a i r t h e n e r v e d e f e c t , w e e x p e c t t o p r o v i d e f o r f u r th e r s t u d y o f t i s s u e e n g i n e e r i n g io a r t if i c i a l n e r v e a n d i t s c l in i c a l p r a c t i c e . Me t h o d s R

8、 a t s s c i a ti c n e r v e d e f e c t b e i n g re p a i r e d a c c o r d i n g t o t h e f o ll o w i n g t h r e e w a y s : c o n d u i ts w i t h S c h w a n n c e ll s (g r o u p A ) ; c o n d u i ts w i t h o u t S c h w a n n c e l l s ( g r o u p B ) a n d s u t o l o g o u s n e r v e

9、s ( g r o u p C ) . E v a l u a t io n o f i ts f e a s i b i l i t y f o r p r o m o t i n g n e r v e r e g e n e r a t i o n i n c l u d e d g e n e r a l o b s e r v a t i o n , m u s c l e m e a s u r e m e n t , e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n , h i s to m o r p h

10、 o l o g ic a ll y a n a l y s i s w a s d o n e a f t e r 1 0 w e e k s o f o p e r a t i o n . R e s ul t s S c h w a n n c e ll s a n d t h e P L G A f i l a m e n t c o u l d f o r m c e ll - b i o m a te r i a l s c o m p l e x b o d y . A t t h e e n d o f 1 0 w e e k s a f t e r o p e r a t i

11、o n , t h e r e l a t i v e w e i g h t o f t h e t r i c e p s s u r a e m u s c l e , m y e li n a t e d f i b e r s , th e A M P , A R E A , N C V o f re g e n e r a t e d n e r v e o f g r o u p A a n d C w e r e s i g n i f i c a n 街b e t t e r t h a n g r o u p B , a n d th e r e w a s n o s i

12、 g n if i c a n t d i ff e r e n c e c o m p a r e d t o g r o u p C . ( C o n c l u s i o n I t w a s s h o w e d t h a t P L G A w a s c o m p a t ib l e w i th S c h w a n n c e ll s a n d s u i t a b l e to c o n s t r u c t t i s s u e - e n g i n e e r e d b i o a r tif i c i a l n e r v e .a

13、n d i t s e ff e c t o f r e p a ir i n g t h e n e r v e d e f e c t w a s s i m il a r t o a u t o l o g o u s n e r v e s . K e y w o r d s : t i s s u e e n g i n e e r i n g ; s c h w a n n c e ll ; n e r v e g r a f t ; n e r v e r e g e n e r a t i o n ; r a t 周围神经缺损的修复是临床治疗的难题之一。 近几年， 随着组织工程

14、的发展， 利用组织工程方法构 建人体组织以 修复缺损组织的研究日 益受到重视。 组织工程化人工神经， 即种植许旺细胞， 具有特定三 维支架结构神经导管， 它的出现为我们寻找理想的 神经移植替代品提供了新方向。 本实验将近交系乳鼠许旺氏细胞与经 E C M ( E x t r a c e l l u l a r M a t r ix 细胞外基质)凝胶修饰过的 收稿日 期: 2 0 0 6 -07 - 3 0 2 3 0 8 万方数据 第 1 5 期利春叶， 等: 组织工程化神经修复周围神经缺损的实验研究 P L G A( c o p o ly m e r o f l a c t i c a n

15、d g ly c o l i c a c i d s 聚经 基乙酸和聚乳酸的共聚物)细丝体外复合培养后， 用胶原膜包裹， 制成具有许旺氏细胞活性的组织工 程化人工神经移植体， 桥接近交系大鼠1 c m坐骨神 经缺损， 研究这种人工神经的修复效果， 为神经组织 工程的 进一步研究和临床应用提供实验依据。 1 材料与方法 1 . 1 动物分组 取雄性F 3 4 4 大鼠 ( 由中山医科大学实验动物 中 心 提供) 6 0 只， 体重1 2 01 7 0 g ， 随 机分为3 组， 每 组2 0 只。 取长 1 2 m m ， 宽6 m m胶原膜做成管状， 分 别用下述3 种不同的神经移植体修复。

16、A组: 胶原膜 管内放置约4 8 0 根赫附有许旺细胞的P L G A纤维。 B 组: 胶原膜管内放置约4 8 0 根未粘附许旺细胞的 P L G A 纤维。C 组: 自 体坐骨神经移植组。 1 . 2 实验方法 将许旺细胞悬液种植在经过E C M凝胶溶液修 饰的P L G A纤维上， 5 %C 0 2 , 3 7 培养箱内孵育 2 4 h 后， 加人含5 ji g / m L 阿 糖胞昔的D M E M培养液孵 育4 8 h ， 再换成普通培养液孵育3 , 4 d o 1 0 % 水合氯 醛( 3 m U k g ) 腹腔麻醉后， 无菌条件下， 取鼠 双侧大 腿纵形切口， 暴露坐骨神经全长，

17、 从梨状肌下缘起造 成 1 0 m m神经缺损。 用 1 0 / 0 无损伤线对端缝合A , B 两组神经移植体与神经断端， 神经移植体两端各缝 合1 m m ， 自 体神经组用对侧坐骨神经修复。 1 . 3 各项指标观察 各组在术后2 , 4 , 6 , 1 0 周切取神经移植体近段 1 m m和远段 1 m m ， 行光学显微镜、 透射电 镜观察。 术后 1 0 周行坐骨神经传导速度( N C V) 、 复合动作 电位幅度( A M P ) 、 动作电位面积分数( A R E A) 等 电生理检查。于术后 1 0 周检测各组大鼠 小腿胖肠 肌和比目鱼肌萎缩情况。并用分析天平测量小腿三 头肌

18、肌肉的湿重， 计算出肌肉占 体重的百分比。 1 .4 统计分析 全部数据采用 S P S S 软件包进行统计分析和处 理， 两组均数间的比较采用， 检验。 2 结果 体外培养的许旺细胞能在E C M凝胶修饰过的 P L G A 纤维支架上砧附及迁移， 形成具有三维立体 结构; 类似许旺细胞增殖所形成的B u n g n e i s 带; 许 旺细胞D N A无损伤。 术后全部动物存活， 伤口 无感染， 均未出现足底 部溃疡。取材时见各组大鼠神经桥接体与周围组织 有程度较轻的粘连。神经桥接体两端与坐骨神经两 端连接， 无折断和破损， 连续性良 好， 无神经瘤形成。 实验组神经桥接体外形与正常神经

19、接近，而空白 组 桥接体直径明显细于实验组。两组均未见神经瘤形 成。 术后 1 0 周， B 组神经移植体近段有髓神经纤维 数， 远段有髓神经纤维数、 有髓神经纤维密度均明显 小于A , C 两组， 而A组与C 两组无显著差别。 大鼠坐骨神经修复术后 1 0 周， B 组再生神经的 动作电位振幅、动作电位波峰和波谷内的电位面积 分数、 神经传导速度明显低于A , C 两组， 而A , C 两 组间无显著性差别。 术后 1 0 周， B组小腿三头肌相对重量明显小于 A , C 两组， 而A , C 两组间 无显著性差别。 3 讨论 资料表明， 许旺细胞在神经损伤修复过程中对 神经再生和功能恢复起

20、着重要作用川 ， 所以 人们大多 将其作为种子细胞。 笔者选择了3 一 8 天龄F 3 4 4 近 交系乳鼠为许旺细胞的来源。这样既保证了移植许 旺细胞有较好的活性， 又避免实验动物的 免疫排斥 反应。 结果证实， 异体F 3 4 4 乳鼠许旺细胞植人成年 F 3 4 4 大鼠 体内 后， 光、 电 镜观察， 神经移植体中没有 出现淋巴细胞侵润。近交系大鼠是一个较为理想的 用于神经组织工程研究的动物模型。 许旺细胞只有与材料牢固的赫附，才能进一步 迁移生长、 发挥生物学功能。有学者2 - 4 )观察到支架 表面经L N 、 胶原基质、 F N , E C M凝胶等裱衬修饰后， 可以促进许旺细胞

21、勃附、 迁移、 生长并合成分泌大量 细胞外基质。 笔者试验结果表明， 复合培养后许旺 细胞很快赫附于经E C M凝胶修饰的P L G A纤维上。 同时， 经M TT 法、 显微分光光度和显微图像分析技 术，以 及单细胞凝胶电泳法证实， 其细胞的活性及 D N A 、 蛋白 表达等未受影响， 表明P L G A材料的生物 相容性及细胞的亲和性良 好， 是无毒性生物材料。 复合支架不但与许旺细胞要能很好相容， 还应 具有特定的三维开放性结构， 才有利于营养物质的 渗透和细胞的正常代谢， 促进细胞砧附与生长m 0 T E R A D A Il 用硅胶管内 放置7 根可吸收聚酞胺、 聚二 氧六环酮和P

22、 L G A纤维、 肠线修复大鼠1 0 i n m坐骨 神经缺损， 各组动物神经纤维均成束再生。 A R A I 哑 2 3 0 9 万方数据 中国现代医学杂志第 1 6 卷 用类似的方法， 修复大鼠1 5 m m坐骨神经缺损， 证 实此管能促进神经再生， 突破了以 往硅胶管1 0 m m 的修复极限。通过以上资料可以看出，多管道神经 管和神经导管内 放置纤维支架，由于 增加了 许旺细 胞赫附的面积， 促进了 神经再生。 笔者用4 8 0 根直 径1 0 .x , m的P L G A 纤维构建成三维立体结构， 其面 积一 体积较以往的研究有了明显的 增加， 可以尽可 能多的赫附许旺细胞， 更好

23、地控制轴突再生方向。 光镜、电 镜证实许旺细胞能在这种P L G A纤维支架 上钻附及迁移， 形成具有纵向三维立体结构的细胞 一 纤维材料复合物， 类似神经损伤后许旺细胞增殖 所形成的B ii n g n e i s 带。 本实验观察到， 种植了 许旺细胞， 具有内部三维 立体支架结构的组织工程化人工神经移植体术后 1 0 周， 神经功能恢复指标非常接近自 体组水平， 较 无许旺细胞种植组再生神经功能恢复好， 可能是因 为外源性许旺细胞的营养特性， 以及其分泌的可溶 性表面蛋白增进了轴突的迁移， 加人外源性许旺细 胞促进了早期轴突再生。 以上结果表明，用4 8 0 根P L G A纤维构建的具

24、 有许旺细胞活性的神经移植体， 由于具备了仿真三 维立体结构， 大大增加了许旺细胞的戮附面积， 明显 地促进了 轴突再生。 这种组织工程化人工神经可以 促进再生神经长过 1 0 m m大鼠 坐骨神经缺损， 为将 来的临床应用提供了一个合适的人工神经模型。 ( 注: 以 上实 验在中山大学医学院完成， 得到医 学院动物中心、 电镜室、 中心实 验室等各位老师的指 导和帮助， 在此表示感谢。) 参考文献: 1 C O L A V I N C E N Z O J , L E V I N E R L . M y e li n d e b r i s c l e a r a n c e d u r i

25、n g W a ll e r i a n d e g e r a t i o n i n t h e g o l d f i s h v i s u a l s y s t e m 田. J N e u r o s c i R e s , 2 0 0 0 , 5 9 ( 1 ) : 4 7 - 6 2 . 2 H A D L O C K T , S U N D B A C K C , H U N T E R D , e t a l . A n e w a r t i fi - c i a l n e r v e g r a f t c o n t a i n i n g r o ll e d

26、S c h w a n n c e ll m o n o l a y e r s 田. m i - c r o s u r g e r y , 2 0 0 1 , 2 1 : 9 6 - 1 0 1 . 3 M A T S U M O T O K , O H N I S H I K , K I Y O T A N I T , e t a l . P e r i p h e r a l n e r v e r e g e n e r a t i o n a c r o s s a n 8 0 - m m g a p b r i d g e d b y a p o l y g l y - c o

27、l i c a c i d ( P G A ) - c o l l a g e n t u b e f i ll e d w i t h la m i n i n - c o a t e d c o ll a - g e n f i b e r s : a h i s t o l o g i c a l a n d e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l e v a l u a t io n o f r e g e n e r a t e d n e r v e s J . B r a i n - R e s , 2 0 0 0 , 8 6 8 ( 2

28、) : 3 1 5 - 3 2 8 . 4 T O B A T , N A K A M U R A T , S H I M I Z U Y , e t a l . R e g e n e r a t i o n o f c a n i n e p e r o n e a l n e r v e w i th t h e u s e o f a p o l y g l y c o li c a c i d - c o ll a - g e n t u b e fi ll e d w i t h la m i n i n - c o a t e d c o ll a g e n s p o n g

29、 e : a c o m p a r a - t i v e s t u d y o f c o ll a g e n s p o n g e a n d c o l l a g e n f i b e r s a s f i ll i n g m a t e - r i a l s f o r n e r v e c o n d u i t s 田.J B i o m e d M a t e r R e s , 2 0 0 1 , 5 8 间: 6 2 2 - 6 3 0 . 5 T E R A D A N , R J U R S T E N L M , D O H I D , e t a

30、l . B i o a rt i f r c i a l n e r v e g r a ft s b a s e d o n a b s o r b a b l e g u i d i n g f i l a m e n t s t r u c t u r e s - e a r l y o b - s e r v a t i o n s 团， S c a n d J P l a s t R e c o n s t r H a n d S u r g , 1 9 9 7 , 3 1 : 1 - 6 . 6 A R A I T , L U N D B O R G G , D A H L I N

31、 L B . B i o a r ti fi c i a l n e r v e g r a f t f o r b r i d g i n g e x t e n d e d n e r v e d e f e c t s i n r a t s c i a t i c n e r v e b a s e d o n r e s o r b a b l e g u i d i n g f i l a m e n t s田. S c a n d J P l a s t R e c o n s t r S u r g H a n d S u r g , 2 0 0 0 , 3 4 ( 2 ) :

32、 1 0 1 一 1 0 8 . 7 龚跃昆 ， 彭吾 训， 李世 和， 等工程骨对犬股骨头缺损坏死模型 再血 管化的 作用 3 l . 中国 现 代医 学杂志，,2 0 0 6 , 1 6 ( 7 ) : 1 0 2 2 - 1 0 3 1 . 7 G O N G Y K , P E N G W Y , L I S H , e t a l . R e v a s c u l a r i z a t i o n e ff e c t o f A A C B a d s o r b i n g B M P / b F G F i n f e m o r a l h e a d d e f e c

33、 t s a n d n e c r o - s i s o f c a n i n e s 阴. C h i n a J o u rn a l o f M o d e rn M e d ic i n e , 2 0 0 6 , 1 6 (7 ) : 1 0 2 2 - 1 0 3 1 . C h i n e s e ( 王渊碌 编辑) ( 上接第2 3 0 7 页) 意 义田 . 中 国 现 代医 学 杂志 ，,2 0 0 4 , 1 4 (5 ) :6 0 - 6 2 . 3 W U W , L I U Y D . S t u d y o n a c t i v i t y o f P H

34、 G P x i n e r y th r o c y t e o f p a t i e n t s w i th c o r o n a ry h e a r t d i s e a s e a n d h y p e r li p e m i a阴.C h i n a J o u r n a l o f M o d e m M e d i c i n e , 2 0 0 4 , 1 4 ( 5 ) : 6 0 - 6 2 . C h i n e s e 4 夏燕萍， 俞茂华. 茶多酚诱导人甲 状腺乳头状癌细胞凋亡作用的 研 究 田 . 中国 现 代医 学 杂志 ，,2 0 0 4 , 1

35、 4 (2 2 ) :4 3 - 4 4 . 4 X I A Y P , Y U M H . S t u d y o f p o l y p h e n o l s i n d u c i n g a p o p t o s i s i n h u m a n t h y r o i d p a p i ll a ry c a r c i n o m a c e ll 田. C h i n a J o u rn a l o f M o d - e m M e d i c i n e , 2 0 0 4 , 1 4 ( 2 2 ) : 4 3 - 4 4 . C h i n e s e 5 戴

36、军， 王洪新， 陈尚 卫， 等.茶叶 及茶多酚中 儿茶素的 高效液相色 谱分 析 方 法 研 究 J 色 谱 ，2 0 0 1 , 1 9 (5 ) :3 9 8 - 4 0 2 . 5 D A I J , WA N G H X , C H E N S W, e t a l . S t u d y o n t h e A n a l y ti c a l M e t h o d s o f C a t e c h i n s i n T e a a n d G r e e n T e a P l o y p h e n o l S a m p l e s b y H i g h P e r f o r m a n c e L iq u i d C h r o m a t o g r a p h y 阴.C h i n e s e J o u rna l o f C h r o m a t o g r a p h y , 2 0 0 1 , 1 9 ( 5 ) : 3 9 8 - 4 0 2 . C h i n e s e ( 曾文军 编辑) 2 3 1 0 万方数据