《缺氧缺糖可导致培养的乳鼠心肌细胞凋亡.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《缺氧缺糖可导致培养的乳鼠心肌细胞凋亡.pdf（3页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、第6 卷第4 期 2 0 0 4年 8月 申曲右代儿科奋杏 C h i n J C o n t e mp P e d ia t r Vo l . 6 No . 4 A u g . 2 0 0 4 实 验 研 究 报 道 缺氧缺搪可导致培养的乳鼠心肌细胞凋亡 张晓敏， 李昌荣， 陈铭珍， 谭建新， 陆羡 ( 广东医学院附 属医院儿科， 广东 湛江 5 2 4 0 0 1 ) ( 摘要 目 的 心肌细胞凋亡是许多心血管疾病发生与演变的细胞学基础， 成为心血管疾病研究中的一个 热点问题。国内外研究表明心肌缺血后再灌注可导致心肌细胞凋亡， 但缺血是否引起心肌细胞凋亡尚有争议。该 研究旨在探讨心肌缺氧损
2、伤时是否发生心肌细胞凋亡。方法取2 - - 4 d 的新生S D乳鼠心室肌进行心肌细胞培 养， 采用模拟“ 缺血模型” ， 分不同时间段缺氧缺糖组和正常对照组观察， 用A n n e x i n V - F I T C / P I 双染色流式细胞术 ( F lo w c y to m e u t ry, F C M) , H o e c h s t / P I 荧光染色 镜检判断细胞凋亡。 用原子吸收法测定细胞内 钙、 镁含量。结果 F I T G A n n e x i n V / P I 双染色法 F C W 检测， 缺氧1 1 . 5 , 1 2 . 5 , 1 3 . 5 和1 4 .
3、 5 h 早期凋亡细胞比例分别为( 1 0 . 7 士 0 . 4 5 ) %, ( 1 3 . 7 士 0 . 7 1 ) %, ( 1 5 土 0 . 5 4 ) %和( 1 7 . 2 士 0 - 6 7 ) %， 比正常对照组( 3 . 5 7 士 0 . 2 6 ) %明显增高， 差异有显著 性( 尸 0 . 0 5 ) .结论在缺氧 缺糖模拟“ 缺血模型” 上发现缺氧缺糖可引起心肌细胞凋亡， 细胞内 钙超负荷和镁含量下降与凋亡发生有关。 中国当代儿科杂志， 2 0 0 4 , 6 ( 4 ) : 3 3 1 一 3 3 3 关 键 词 培养心肌细胞; 缺氧; 缺糖; 细胞凋亡 中圈
4、分类号 R - 3 3 文献标识码 B 文章编号1 1 0 0 8 - 8 8 3 0 ( 2 0 0 4 ) 0 4 - 0 3 3 1 - 0 3 缺血缺氧是许多疾病常见的基础病理生理改变 和临床常见的急性事件， 易引起心肌损伤。过去认 为， 心肌细胞对凋亡有特殊的抵抗性， 不发生细胞凋 亡。近年研究证实， 病毒性心肌炎等许多心脏疾病 都 有心肌细胞凋亡现象 。但心肌缺血缺氧是否 引 起心肌细胞凋亡尚 有争议2 ,3 1 。由 于受神经体液 等因素的影响， 在体心肌不能确切地反映某些因子 或因素在心肌损伤中的作用， 而培养心肌细胞可避 免这些因素的影响， 成为研究心肌损伤的有用模 型闭。
5、因 此， 我们采用纯化的 原代心肌细胞进行缺 氧缺糖培养模拟“ 缺血模型” ， 观察其对心肌细胞凋 亡的影响。 1 材料与方法 1 . 1 材料 实验用新生2 - 4 d 的S p r a g u e D a w l e y 乳鼠， 雌 雄不拘， 由本院动物中心提供。培养基 R P MI 一 1 6 4 0 ( G i b c o 产品) ， 新生牛血清( 杭州四季青公司) ， A p o A L e r t A n n e x i n V 一 F I T C A p o p t o s i s K i t . K 2 0 2 5 一 1 ( C L O N T E C H产品) ; 胰蛋白酶
6、( 12 5 0 ) , P r o p i d i u m I o d i d e ( P I ) 和H o e c h s t 3 3 3 4 2 购自 于S i g - m a 公司， 其他试剂为国产分析纯级。X L w 3 1 2 4 0 流 式细胞仪( C o u l t l y e r E l e t ro n i e s C o r p ) , O l y m p u s B X 一 6 0 荧光显微镜( J a p a n ) . 1 . 2 乳鼠心肌细胞培养 无菌条件下取出心脏， 立即在无菌D一H a n k s 液中洗去残血， 将心室肌剪成 1 m m 3 大小碎块， 用
7、0 . 1 9 6 胰蛋白 酶( t r y p s i n 1 : 2 5 0 ) 溶液消化， 分离心肌 细胞， 用差速贴壁法纯化， 制备成心肌细胞悬液， 用 5 %二氧化碳培养箱( 3 7 r - ) 培养， 实验用原代培养 9 6 h 的心肌细胞。 L3 实验分组 分正常对照组和缺氧组。本实验参照 T a n a - k a 5 l 等研 究， 并经预实验将缺氧组分为( 缺氧1 1 . 5 , 1 2 . 5 , 1 3 . 5 和1 4 . 5 h ) 4 个不同时间段观察心肌细胞 凋亡情况。“ 缺氧损伤” 实验模型的复制: 参照文 献6 ， 用经高 纯氮气( 1 L / m in )
8、 饱和3 0 m in 的6 % 新 生牛血清无糖H a n k s 置换正常培养液， 用氮气置换 培养瓶内空气， 闭瓶培养即缺氧模型。正常对照: 用 收稿日 期2 0 0 3 - 0 6 - 1 9 ; 修回日 期2 0 0 3 - 1 2 - 2 1 t 作者简介 张晓敏( 1 9 6 3 一 ) ， 男， 硕士研究生， 副主任医师。主攻方向: 小儿心血管， 现工作单位: 广东中山市博爱医院儿科( 5 2 8 4 0 2 ) , 3 3 1 万方数据 第 6 卷第 4 期 2 0 0 4 年 8 月 申田右代儿科奋杏 C h in J C o n t e m p P e d i a t r
9、 Vo l . 6 No . 4 A u g . 2 0 0 4 6 %新生牛血清含糖、 含氧平衡盐溶液， 闭瓶培养。平 衡盐溶液成分( m m o l / L ) ; N a C l 1 3 6 , C a Q 1 . 2 6 , M g 9 0 4 0 . 4 , M g C 2 0 . 5 , K H 2 P 0 4 0 . 4 4 , N a 2 H P 0 4 0 . 3 4 , N a H O 0 3 4 , K C 5 . 3 7 , 酚红0 . 0 3 , H e p e s 4 ( p H 7 . 4 ) 0 L4 观察指标 1 . 4 . 1 细胞存活率计数采用台盼蓝染色检
10、测。 各组取少许细胞混悬液， 0 . 5 %台盼蓝混匀 1 m i n , 用血细胞计数板按白细胞计数法在光镜下计数蓝染 细胞。细胞存活率=未蓝染细胞/(蓝染细胞十 未蓝 染细胞) X 1 0 0 %. 1 . 4 . 2 A n n e x i n V - F I T C / P I 双染色法F C M检测 凋亡用 0 . 1 2 5 %胰蛋白酶、 0 . 0 2 % E D T A混合液 1 . 2 m l 使细胞脱壁， 用等量培养液中止消化， 离心 ( 1 2 8 r / m i n , 5 m i n ， 室温) ， 收集各组贴壁和培养上 清 液中 漂浮的细胞， 按试剂说明染色 7 l
11、 。设置阴 性 对照( 不加A n n e x i n V一F I T C ) 做为本底， 计数 3 . 5 X 1 0 4 个细胞， 微机根据细胞荧光标记特征进行细 胞分类， F I T C 十 / P l 一 的细胞为早期凋亡细胞。 1 . 4 . 3 H o e c h s t 3 3 3 4 2 / ? 1 双染色荧光镜检为检 测细胞形态变化收集缺氧 1 1 . 5 , 1 4 . 5 h两个时间段 和正常对照组的细胞， 方法同上， 取3 X 1 0 5 个细胞 荧光染色( H o 3 3 3 4 2 终浓度1 0 m g / L , P I 终浓度为 5 0 m g / L ) ，
12、取细胞悬液1 5 - - 2 5 川点在载玻片上， 加 盖玻片。紫外光激发， 荧光显微镜下观察细胞形态 及颜色改变。凋亡细胞为亮蓝色弱红光， 有的细胞 体 积 小， 核 呈 块 状荧 光 8 1 。 数 至 少5 个高 倍视 野， 至 少2 0 0 个细胞， 计数各组细胞凋亡指数: 凋亡指数二 ( 阳性细胞数/ 细胞总数) X 1 0 0 0 1 . 4 . 4 细胞钙、 镁测定采用原子吸收法收集5 X 1 0 “ 细胞， 用硝酸消化， 分别测定钙标准液( 1 0 p g / m l ) 、 镁标准液( 1 p g / m l ) 的吸光度A s 、 样品吸光度 A x 和本底吸光度A o 。
13、 计算5 x 1 0 6 个细胞钙、 镁含 量( g ) =( A . 一 A o ) / A s x 标准液浓度x 样品体积 ( m l ) x 1 0 一 6 0 1 . 5 统计方法 所 有 结 果 用:士 表 示， 采 用 用x 2 检 验， 随 机 设计的方差分析加4 检验。 P 0 . 0 5 ) , A n n e x i n V一 F I T C / P I 双染色: 正常对照组A n - n e x i n V + / P I 一 的早期凋亡细胞( J . 5 7 1 0 . 2 6 ) %， 缺 氧组( 缺氧1 1 . 5 , 1 2 . 5 , 1 3 . 5 和1 4
14、. 5 h ) 分别为( 1 0 . 7 士 0 . 4 5 ) %， ( 1 3 . 7士0 . 7 1 ) %， ( 1 5 . 0 土0 . 5 4 ) %和 ( 1 7 . 2 士 0 . 6 7 ) %， 均明显高于对照组( 尸 0 . 0 5 ) 。缺氧1 1 . 5 , 1 4 . 5 h 两个时间段比较， 心肌细 胞凋亡指数差异无显著性( P 0 . 0 5 ) 。表明缺氧 可引起心肌细胞凋亡， 不同缺氧时间对凋亡的影响 没有差别。见表 t o 表 1 缺氧对心肌细胞凋亡的影响 A r m e x in V + / P I 一 凋亡细 胞( %) 例数x士s 细胞凋亡指数 例数
15、x 士 : 正常对照组 缺氧 1 1 . 5 h 缺氧 1 2 . 5 h 缺氧 1 3 . 5 h 缺氧 1 4 . 5 h 5 3 . 5 7 士0 . 2 6 5 3 . 7 5士0 . 9 6 5 1 0 . 7 士0 . 4 5 5 1 8 . 0土2 . 4 0 5 1 3 . 7士0 . 7 1 。一一 5 1 5 . 0土0 . 5 4 1 5 1 7 . 2士0 . 6 7 1 5 2 5 . 0士3 . 8 1 注:a与正常对照组比较 P 0 . 0 5 ) ， 见表2 0 表1 各组间 5 x 1 0 6 个细胞内 钙、 镁含量( 1 0 - 1 9 ) 细胞内钙细胞内镁
16、 例数x士:例数厉 士 5 6 . 0 ( ) 士1 . 3 47 . 2 9士1 . 8 1 7 . 9 8士1 . 2 5 1 1 0 1 05 . 5 2士1 . 5 8 1 8 . 4 6士1 . 5 3 1 8 . 8 6士1 . 4 3 1 1 0 5 . 7 0士0 . 9 7 1 1 0 5 . 8 0士0 . 7 8 1 2 结果 正常对照组 缺氧 1 1 . 5 h 缺氧 1 1 . 5 h 缺氧 1 3 . 5 h 缺氧 1 4 . 5 h9 9 . 1 3 士1 . 5 2 1 0 4 . 4 1 士0 . 9 6 注: a与正常对照组比 较P 0 . 0 5 ) ，
17、表明上述不 同 缺氧 时间 对凋亡的 影响差别 不大， 与T a n a k a 等 5 l 研究缺氧 1 2 h诱导心肌细胞凋亡相接近。已有研 究表明 9 l 凋亡的 早期改变之一是质膜上磷脂分布 的不对称性被破坏， 使正常位于细胞膜内面的磷脂 酞丝氨酸( p h o s p h a t i d y l s e r i n e , P S ) 暴露在细胞膜外 表面， 但早期细胞膜保持完整。随后细胞出现特异 性的形态学和生化改变。所以， 用 A n n e x i n V一 F I T C / P I 双染色法 F C M 可检测出早期的凋亡细 胞， 即A n n e x i n V - F
18、I T C + / P 1 一 的细胞。并与P I 染 色阳性的细胞进行区别。P I 染色阳性的细胞代表 坏死的心肌细胞和细胞膜不完整的晚期凋亡的心肌 细胞， 反映了心肌细胞凋亡检测的可靠性。 已明确， 细胞内钙超负荷是导致心肌缺血损伤 发病的另一重要机制。D N A有控降解时核酸内切 酶的 激活需C a t 十 、 M 犷 十 ， 细 胞内C a t + 的 升高还可以 增加氧自由基的合成， 激活细胞凋亡调控基因。所 以认为C a t 十 与凋亡发生有关。本实验证实， 缺氧使 细胞内钙含量比正常对照增加了近3 0 %-5 0 %， 镁 含量下降了 2 4 %一3 9 %， 差异有显著性( P
19、 0 . 0 5 ) 。表明细胞内钙超负荷与镁含量降低与凋亡 发生有关。但心肌细胞凋亡启动是否确实由细胞内 C a t + 超载引起还需进一步深人研究。 参考文献 I l l 王述均， 马沛然， 牟道玉. 病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡和 坏死的研究 【 J l . 中国当 代儿科杂志， 2 0 0 2 , 4 ( 1 ) : 5 - 7 . 2 l C h a k r a b a r t i S , H o q u e A N , K a m =y n M. A r a p id is c h er n ia - in - d u c e d a p o p t o s is i n i s
20、o l a t e d r a t h e a r t s a n d i t s a t t e n u a t io n场 t h e s o d iu m - h y d r o g e n e x c h a n g e in h ib i t o r H O E 6 4 2 ( c a r ip o r i d e ) J . J Mo l C e l l C a r d io l , 1 9 9 7 , 2 9 ( 1 1 ) : 3 1 6 9 一 3 1 7 4 . 3 Ma u l ik N, Y o s h id a T , D a s D K . R e g u l a
21、t io n o f c a r d io m y o c y t , a p o p t o s i s in i s c h e m ic re p e r f u s e d m o u s e h e a rt访g l u t a t h io n e p e r - o x id a s e J . M a l C e l l B i o c h e m , 1 9 9 9 , 1 9 6 0一 2 ) : 1 3 一 2 1 . 4 T h a n d r o y e n F T , B e ll o t t o D , K a t a y a m a A , H a g l e
22、r H K , W i lle r s o n J T , B u j a L M. S u b c e ll u la r e l e c t ro l y t e a lt e r a t io n s d u r in g p r o g r e s - s iv e h y p o x ia a n d f o ll o w in g r e o x y g e n a t io n in i s o la t e d n e o n a t a l r a t v e n t r i c u la r m y o cy t e s J - C ir c R e s , 1 9 9 2
23、 , 7 1 ( l ) : 1 0 6 一 1 1 9 . 5 T a n a k a M, I t o H , A d a c h i S , A k im o t o H , N i s h i k a w a T , K a s a j i - m a T , e t a l . H y p o x ia in d u c e s s p o p t o s i s w it h e n h a n c e d e x p r e s s io n o f F a s a n t ig e n m e s s e n g e r R N A in c u lt u r e d n e
24、o n a t a l r a t c a r d io m y - o c y t e s J . C ir c R e s , 1 9 9 4 , 7 5 ( 3 ) ; 4 . ,d 一 4 3 3 . 6 V a n D e r L e a r s e A , H o l la a r L , V a n D e r V a l k L J . R e le a s e o f a lp h a h y d ro x y b u t y r a t e f ro m n e o n a t a l r a t h e a rt c e l l c u l t u re s e x p
25、o s e d t o a n o x ia a n d r e o x y g e n a t io n . c o m p a r is o n w i t h im p a ir m e n t o f s t r u c - t u r e a n d f u n c t io n o f d a m a g e d c a r d i a c c e l ls J . C a r d io v a s c R e s , 1 9 7 9 , 1 3 ( 6 ) : 3 4 5 一 3 5 3 . 7 V e r m e s I , H a a n e n C S t e f f e
26、n s - N a k k e n H , R e u t e l in g s p e r g e r C . A n o v e l a s s a y f o r a p o p t o s is . F lo w c y t o m e t r ic d e t e c t io n o f p h o s - p h a t id y l s e ri n e e x p r e s s io n o n e a r ly a p o p t o t ic c e ll s u s in g fl u o r e s c e in la b e ll e d A n n e x in
27、 V J . J I m m u n o l M e t h o d s , 1 9 9 5 , 1 8 4 ( l ) : 3 9 一5 1 . 8 元放， 张宝泉， 徐炎 . 顺铂诱导的喉痛细胞凋亡及其对细胞周 期的 影响 J . 中 华医 学杂志， 1 9 9 9 , 7 9 ( 4 ) ; 2 9 8 一 3 0 1 . 9 F a d o k V A , V o e lk e r D R , C a m p b e l l P A , C o h e n J J , B r a t t o n D L , H e n s o n P M. E x p o s u r e o f p h o s p h a t id v l s e r in e o n t h e s u r f a c e o f a p o p t o t i c l y m p h o c y t e s t r ig g e r s s p e c t if ic r e c o g n i t io n a n d r e m o v a l b y m a c r o p h a g e s J . J I m m u n o l , 1 9 9 2 , 1 4 8 ( 7 ) : 2 2 0 7 一 2 2 1 6 . ( 本文编辑: 吉耕中) 3 3 3 万方数据