维生素A酸对小鼠囊胚TGF-β1蛋白表达的影响.pdf

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1、J o u r n a l o f Ma t h e m a t i c a l Me d i c i n e Vo l . 1 9 NO. 52 0 0 6 文章编号: 1 0 0 4 - 4 3 3 7 ( 2 0 0 6 ) 0 5 - 0 4 7 0 - 0 3中圈分类号: R -3 3文献标识码: A 基拙医学研究 维生素A酸对小鼠囊胚T G F - 肛蛋白表达的影响 谭新提黎 艳张端莲 ( 武汉大学医学院人体解剖与组织胚胎学系武汉4 3 0 0 7 1 ) 摘要: 目的: 探讨T G F - 肛细胞因子对着床前胚胎发育的作用， 从而探讨A T R A对着床前期胚胎发育毒性作用， 为

2、其致崎机 理提供实验依据. 方法: 通过促超排卵， 获取妊娠3 . 5 d 小鼠囊胚， 随机分成三组， 即对照组( 空白) 、 实验1 组( 含i lA m o l / L的A T R A ) 和 实验2 组( 含1 0 p m o 1 / L的A T R A ) ， 分别培养在含。 , 1 K m o 1 / L和l O K m o l / L的A T R A的M1 9 9 培养基中， 培养2 4 h ， 然后再吸出囊胚。 用 免疫组织化学S - P法， 分别检测不同剂量组A T R A对小鼠囊胚T G F -肛蛋白表达的状况， 利用H P I A S - 2 0 0 0 图像分析系统测定T

3、 G F - 斑蛋白在以上三组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。 结果: T G F - 斑蛋白在囊胚细胞中的表达， 实验1 组与对照组囊胚T G F - 斑 蛋白表达的阳性面积率及平均光密度有显著性差异( P 0 . 0 1 ) ; 实验2 组与空白组和实验1 组相比均存在显著性差异( P 0 . 0 1 ) . 结 论: 细胞因子 T G F - 肛在胚胎发育的调节中发挥了重要作用. 关挂词: 全反式维生素 A酸; 转化生长因子书1 ( T G F - 9 1 ) : 囊胚; 小鼠 维生素A酸( R e t i n o i c a c i d , R A) 即视黄酸， 是维生素A即 视黄

4、醇( r e t i n a l , R O L ) 在体内氧化代谢的一类具有生物活性的 产物。 此外， 维生素A酸在临床上也是用来治疗座疮和其他许 多皮肤病的重要药物。 同时它也是用于一些恶性肿瘤联合治 疗的药物之一， 如卵巢癌、 乳腺癌、 白血病及肺癌等. 但维生素 A酸也是公认的致畸因子， 许多动物实验已经证实在妊娠期 间服用维生素A酸对胎儿的发育可产生重要的影响。 R A对 囊胚的这种致畸效应可能由于其诱导l C M和T E细胞过渡凋 亡所致. 而R A诱导囊胚细胞凋亡目前尚未见报道. 本研究通 过免疫组织化学方法研究 T G F - 斑蛋白在囊胚细胞中的表达。 1 材料与方法 1 .

5、 1 材料 1 . 1 . 1 试验动物一级健康昆明种小白鼠( S P F级) ， 由武汉 大学医学院动物试验中心提供。 1 . 1 . 2 主要试剂和仪器孕马血清( P MS G ) 和人绒毛膜促性 腺激素( H C G) 为天津生物制品厂产品; A T R A购自上海第六 制 药 厂; p r o p o d i u m i o d i d e ( P I )和 b i s b e n z i m i d e ( H o e c h s t 3 3 2 5 8 ) 以及T r i t o n - 1 0 0 均系美国S i g m a 公司产品; M1 9 9 培养 基为美国H y c l

6、 o n e 公司的产品; 浓缩型兔抗人T G F - 队多克隆 抗体D A B显色试剂盒及多聚赖氨酸均购自北京中山技术公 司; 超敏即用型S - P通用型免疫组织化学试剂盒系福州迈新 公司产品。 12 方法 1 . 2 . 1 小鼠囊胚的获取 选用本校动物中心提供的一级健康昆明种小白鼠， 雌雄 各4 0 只， 体重( 3 。 士5 ) g ， 光照、 黑暗各1 2 h ， 自由摄食、 饮水。 于 雌鼠腹腔注射1 0 U P MS G, 4 8 h 后再腹腔注射l O U H C G促超排 卵， 当晚与雄鼠1 : 1 合笼. 次日晨检查阴栓， 见阴栓者记妊娠0 天。 于妊娠3 . 5 d 时，

7、 将孕鼠脱臼处死， 放人7 5 %酒精中浸泡消 毒约5 m i n ， 于超净工作台上取出子宫， 由阴道端擂人7 号针头 注人M1 ”培养基， 冲出囊胚， 一侧子宫可获取约1 0 - 2 0 个。 将 一十 州卜琦 +曰 卜，月卜卜 冲一. 叫 卜冲 一一+一 卜. 弓一卜. 刊 卜译一 卜 十-+ -卜十一卜. 叫 卜一+一州 卜冲 定和治疗有重要作用， 测定P 1 6 , n m 2 3 可作为判定食管鳞状细3 胞癌患者预后的重要指标。 K a n b A, G r u i s N A, We a v e r F J , e t a l . p o t e n t i a l l y i

8、n v o l v e d i n g e n e s i s o f m a n y A c e l l t um or c y c l e r e g u l a t o r t y p e s . S c i e n c e , 1 9 9 4 , 2 6 4 : 4 3 6 - 4 4 0 . T a k e u c h i H, Oz a wa S , An d o N, e t a l . Al t e r e d a n d c y c l i n D I / P R A D - 1 g e n e p r o g n o s is o f s q u a m o u s c e

9、 l l p 1 6 / MT S 1 / C D K N 2 a s s o c i a t e d wi t h t h e c a r c i n o m a o f t h e e s o p h a g u s . C l i n C o m p l e x s t r u c t u r e a n d al. .考文 S t o n e S , B a n g P , D a y a n a n t h P , e t r e g u l a t i o n o f t h e p 1 6 ( MT S 1 ) l o c u s . 2 9 8 8 2 9 9 4 . L e

10、o n e A, F l o t o w U, K i n g C R, e t a l . C a n c e r R e s , 1 9 9 5 , 5 5 ( 1 4 ) : C a n c e r Re s , 1 9 9 7 , 3 ( 1 2 P t1 ) : 2 2 2 9 - 2 2 3 6 . 王永康， 陈景寒， 杜德利， 等. 食管麟癌p 5 3 和n m 2 3 蛋白联合表达的 预后价值. 中华病理学杂志， 1 9 9 9 , 5 : 3 7 5 - 3 7 6 . Re d u c e d t u mo r m e t a s t ic p o t e n t ia l

11、 , a n d c y t o k i n g r e s p o n s iv e n e s s o f t r a n s f e c t e d m e l a n o m a c e l l s . C e l l , 1 9 9 1 , 6 5 a 2 5 -3 5 . i n c i d e n c e , n m2 3 一 收稿日期: 2 0 0 6 - 0 4 - 0 7 武昌杨因铁四院医院内 二科 4 7 0. 数理医药学杂志2 0 0 6 年第1 9 卷第5 期 所有的囊胚冲人凹皿中， 并用P B S 洗涤囊胚5 m i n X 3 次。 所有 操作均在解剖显微镜下进行

12、. 1 . 2 . 2 胚胎培养 将所有囊胚随机的分为3 组， 即对照组( 空白) 、 实验1 组 ( 含1 IL m o l / L的A T R A ) 和实验2 组( 含1 0 1i m o 1 / L的A T R A ) , 将囊胚培养在3 5 m m F a l c o n 塑料培养皿中， 每皿加人l m l 培养 基， 含有2 0 个囊胚， 实验1 组中加人1 K m o l / L的A T R A, 实验2 组中加人l O t c m o l / L的A T R A， 所有 A T R A均溶于0 . 0 2 %的 D MS O。 对照组只加等童的0 . 0 2 %的D MS O。

13、 每组培养基均加 人0 . 3 % B S A, 1 m m o l / L谷氛酞胺， 并置人3 7 C, 5 % C O z 培养 箱内培养2 4 h 。 所有操作均在解剖显微镜下进行. 1 . 3 免疫组织化学S - P 法检测T G F - 印相关抗原 在解剖显微镜下， 用毛细管吸出囊胚， 并用P B S 洗涤5 m i n X3 次， 随后立即固定于4 %多聚甲醛3 0 m i n ， 再用 P B S洗涤 5 m i n X 3 次， 最后转到涂有多聚赖氮酸的玻片上， 干燥2 4 h 待 用。 免疫组化S - P法主要步骤: 将载有囊胚的玻片用蒸馏水洗涤5 m i n X 3 次;

14、2 结果 (2 ) l y o t r ir o n X - 1 0 0 作用1 0 m i n ， 增加抗体的穿透性， 燕馏 水洗涤5 m i n X 3 次， 3 %过氧化氢， 3 7 1C 孵育1 0 m i n以抑制内源性过氧化 物酶活性， 蒸馏水和P B S 各洗4 X 5 m i n ; 正常羊血清3 7 C 孵育3 5 m i n以减少非特异性反应， 甩 、 匆， 干， 一抗( T G F - p 1 , 1 : 1 0 0 ; ) 3 7 C 孵育1 h , 4 C 过夜。 第二天 于3 7 下复温1 h , P B S洗4 X 5 m i n ; 生物素标记的二抗， 3 7

15、1C 孵育4 0 m i n , P B S 洗4 X 5 m in ; 链每菌抗生物素蛋白 一 过载化物醉复合物3 7 C 孵育4 0 m i n , P B S洗4 X 5 mi n ; 8Q D A B 一 双权水显色1 0 m i n ， 自来水冲洗终止反应; 苏木精复染， 脱水， 透明， 封片。 阴性对照用P B S 代替一抗， 其余同上。 1 . 4 结果判断 1 . 4 . 1 T G F - 队相关抗原以胞膜或胞浆出现棕黄色颗粒为阳 性反应， 阴性对照组除细胞核染成蓝色外， 胞核和胞浆内无棕 黄色反应物. 1 . 4 . 2 利用H P I A S - 2 0 0 0 高清晰度

16、彩色病理图文报告管理系 统对T G F - 肛的表达进行定盆分析， 每张标本随机选取5 个完 整而不重盈的高倍镜视野( X4 0 0 ) , 测定每个视野下阳性反应 的平均光密度、 阳性反应面积和所有细胞总面积， 计算阳性面 积率。 以每例5 个视野的平均光密度、 阳性面积率的平均值作 为该例的测童值. ( 阳性面积率=单位面积中阳性反应的总面积/ 单位面积 中细胞的总面积X1 0 0 %) 1 . 5 统计学处理 对各组结果作单因素方差分析和S N K - q 检验， 检验水准 a 为0 . 0 5 . 2 . 1 T G F - 班蛋白 表达结果 T G F - 爪蛋白免疫反应阳性细胞呈棕

17、黄色， 阳性物质分布 囊胚所有细胞的细胞浆， 细胞核呈蓝色， 并根据棕黄色顺粒分 布的密度和着色深浅分为阴性、 弱阳性、 阳性和强阳性4 级。 本 实验发现在对照组， 囊胚细胞胞浆中可见少量浅棕黄色颗粒， 呈弱阳性着色， T G F - 肛蛋白表达呈弱阳性; 在实验1 组中， 囊胚 细胞胞浆中可见较多棕黄色颗粒， 且均匀分布， T G F - 班蛋白 在实验1 组囊胚细胞中表达呈阳性; 实验2 组中囊胚细胞胞浆 中可见很多均匀分布的棕黄色颗粒， T G F - 肛蛋白呈强阳性表 达。 图像分析结果显示， 试验1 组囊胚细胞T G F - 母蛋白表达的 平均光密度为。 . 1 2 0 3 ， 试

18、验2 组囊胚细胞 T G F - 队蛋白表达的 平均光密度为0 . 1 9 2 4 ， 对照组囊胚 T G F - 斑蛋白表达的平均光 密度为0 . 0 7 9 6 ; 试验1 组囊胚细胞T G F - 似蛋白表达的阳性面 积率为。 . 1 4 5 3 ， 试验2 组囊胚细胞T G F - 肛蛋白表达的阳性面 积率为0 . 2 1 6 7 ， 对照组囊胚T G F - 邵蛋白表达的阳性面积率为 0 . 0 7 5 2 。 经单因素方差分析， 组间有显著性差异( P 0 . 0 1 ) 。 经 4 检验， 对照组与实验1 组囊胚T G F - 队蛋白表达的阳性面积率 及平均光密度有显著性差异(

19、P 0 . 0 1 ) ， 实验2 组与对照组和 实验1 组相比均存在显著性差异( P 0 . 0 1 ) . 见表1 , 表1 不同浓度A T R A对小最班胚 T G F - 队蛋白 表达的影晌( z 士s ) 组 ， 繁 鬓平 均 光 密 度 阳性面积率 对照组( 空白 )1 2 试验组1 ( l li m o l / L ) 2 6 试验 组2 ( 1 0 u m o l / L ) 2 4 0 . 0 7 9 6 士0 . 0 8 5 1 0 . 1 2 0 3 士0 . 0 0 3 8 0 . 1 9 2 4 士0 . 0 3 4 2 0 . 0 7 5 2 土0 . 0 1 5

20、4 0 . 1 4 5 3 士0 . 0 2 2 4 0 . 2 1 6 7 士0 . 0 1 4 2 3 讨论 许多动物实验已经证实在妊娠期服用维生素 A酸对胎儿 的发育可产生重要的影响。 如在小鼠怀孕后7 或8 天服用维生 素A酸( 1 2 m g / k g ) 可导致胚胎发育延迟， 颅神经盘异常分化 及后脑发育异常。 在小鼠 怀孕第9 天服用维生素A酸( 2 0 / k g ) 会导致小鼠胚胎内耳形态崎形. 在小鼠怀孕第1 0 天到第1 6 天 服用维生素A酸( 1 2 0 m g / k g ) 可导致胚胎肢体崎形和神经发 育异常C I - 3 1 。 国外学者研究发现， 体外培养的

21、小鼠囊胚用过童 的R A出理后， 会导致胚胎生长发育迟缓而着床失败或着床 后胚胎死亡。 R A对囊胚的这种致崎效应可能由于能诱导 I C M和T E细胞过渡凋亡。 近年来， 随着妊娠早期流产率增加 及已知流产儿中染色体畸变率增高， 有关着床期和着床前期 发育毒性也越来越受到重视， 已成为当前发育毒理学研究的 一个热点. 而维生素A酸 ( R A ) 是近年来研究的比较广泛的 一种凋亡诱导剂和致畸因子， 用 R A处理的发育胚胎可出现 面部、 神经管和四肢等部位的多种畸形。 这些畸形的发生取决 于R A的给药时间和剂量， 相对低剂量的R A在不同的处理时 .4 7 1. J o u r n a

22、l o f Ma t h e ma t i c a l Me d i c i n eVo l . 1 9 NO. 5 2 0 0 6 间对不同的组织类型具有不同的作用， 高剂量的R A会引起 胚胎死亡 4 ,5 1 . R A的水平被不同的蛋白 质所调控。 这些蛋白质 和R A结合， 并将其运到相应的组织细胞。 早期胚胎中由于缺 乏这些蛋白质或者这些蛋白质不足以处理过高水平的R A 时， R A较易通过胎盘。 崎形发生可能是由于R N A水平过高 而直接作用于细胞迁移、 增殖、 分化和死亡这些重要过程所 致。 胚胎发育过程中的胚胎细胞总是在增殖和凋亡之间保持 平衡。 已经证实维生素A酸诱导细胞

23、凋亡涉及到整个胚胎发 育过程中， 例如， 维生素A酸由于增加凋亡细胞的死亡， 而对 指( 趾) 分开起重要作用， 这在四肢发育中可以观察到. 国外有 资料显示在接受维生素A酸处理的滋养层干细胞其生长增殖 能力是下降的 6 。 用人的滋养层细胞进行的体外试验证实， 类 维生素A酸能刺激H C G的分泌和滋养层细胞的分化。 维生素 A酸诱导胚胎发育过程中细胞凋亡的机制， 越来越被人们所 认识。 死亡是生命的自然规律。 这适用于整个机体， 也适用于单 个细胞。 细胞死亡是生命现象中不可逆转的终止， 是一个普遍 的现象。 既发生于正常的胚胎发育中， 也发生于成体组织. 根 据细胞死亡的形态学、 生物化

24、学和生理学特征的不同， 可将细 胞死 亡 分 为 两 大 类: 细胞 坏 死 ( n e c r o s i s ) 和 细 胞 凋 亡 ( a p o p t o s i s ) 或程序性细胞死亡 ( p r o g r a m m e d c e l l d e a t h P C D 户. 9 . 尽管P C D对是否与细胞凋亡等同仍有不同的看法， 但由于大多数 P C D呈现细胞凋亡的形态特征， 而且在致畸物 诱发胚胎异常发育中通常表现为细胞凋亡的形态特征， 故本 研究均用细胞凋亡表示。 近几年研究表明， 细胞凋亡这种死亡 的新模式既是胚胎正常发育中的重要事件， 又是致畸因素导 致胚胎

25、异常发育的重要形式。 因此， 细胞凋亡的研究有助于胚 胎正常和异常发育机制的阐明。 转化生长因子队 ( T G F - 9 1 ) 是转化生长因子家族中的一 个重要成员， 其分子t为2 5 K D 。 它具有多种生物学功能， 特别 是调节细胞的生长和分化， 参与细胞外基质蛋白的合成与降 解， 对细胞乃至整个机体的生命活动具有广泛而重要的生理 意义。 T G F - 队在正常或肿瘤细胞中都普遍表达C 9 .i o 。 通常情况 下， T G F - 似对间质来源的细胞生长有促进作用， 而对上皮细胞 主要是一种负性生长调控作用。 T G F - 肛作为一重要的细胞生 长、 分化调节因子， 它能够干

26、扰多种以酪氨酸激酶为受体的致 分裂剂的作用， 其中包括P D G F , E G F , I G F - I 等， 而这些因 子均是早期胚胎发育与植人的重要调节因子. 因此， T G F - 肛可 能对胚胎发育以及胚胎一 母体相互作用起到广泛性的调节作 用。 本实验研究发现， 在对照组， 囊胚细胞胞浆中可见少量浅 棕黄色颖粒， 呈弱阳性着色， T G F - 印蛋白表达呈弱阳性， 在实 验1 组中， 囊胚细胞胞浆中可见较多棕黄色顺粒， 且均匀分布， T G F - 印蛋白在实验1 组囊胚细胞中表达呈阳性; 实验2 组中囊 胚细胞胞浆中可见很多均匀分布的棕黄色颗粒， T G F - 斑蛋白 也呈

27、强阳性表达。 并且对于囊胚T G F - 班蛋白表达的平均光密 度及阳性面积率， 对照组与实验1 组相比具有显著性差异( P 0 . 0 1 ) ; 实验2 组与空白 组和实验1 组相比均存在显著性差异( P 0 . 0 1 ) 。 且A T R A剂盆越大T G F - 邵蛋白表达越强。 同时还 发现实验组囊胚内细胞团发生皱缩， 细胞数目减少。 证实了 T G F - 印参与了早胚生长发育过程中， 细胞发生增殖或死亡的 调节。 但A T R A导致早期胚胎死亡和着床失败的原因和机制 还不完全清楚， 对小鼠胚胎致畸作用的具体机制以及T G F - 班 对小鼠胚胎生长发育作用机理还有待进一步探讨

28、. 参考文献 Ma d e m M e m b r y o n e c 2 0 0 0 . 6 5 - . T h e r o l e o f r e t i n o i c a c i d i n e m b r y o n i c: a n d p o s t - d e v e l o p m e n t . P o c e e d i n g s o f t h e Mu t r i t i o n S o c ie t y , 2 H u J e n h u a n g , MD; Y a L in g , B S . E f f e c t s o f R e t i n o i

29、c A c i d o n P r e - i m p l a n t a t i o n E m b r y o D e v e l o p m e n t i n Mic e . H u m a n R e p r o d u c t i o n , 2 0 0 1 , 6 8 1 -6 8 7 . 3 H u J e n h u a n g， T s u n g - c h i e h J. E f f e c t s o f r e t i n o i c a c i d o n i m p l a n t a t i o n a n d p o s t - i m p l a n t

30、 a t i o n d e v e l o p m e n t o f m o u s e e m b r y o s i n v i t r o . H u m a n R e p r o d u c t i o n , 2 0 0 1 , 2 1 7 1 - 2 1 7 6 . 4 H u J e n h u a n g , C h u n k C h a n g s h e n , e t a l . R e t i n o ic a c id d e c r e a s e s t h e v i a b i l i t y o f m o u s e b l a s t o c y

31、 s t s i n v it r o . H u m a n R e p r o d u c t io n , 2 0 0 3 , 1 3 0 - 1 3 6 . 5 付立杰， 主编.畸胎学. 第1 版. 上海: 上海科技教育出版社， 1 9 9 6 , 1 6 7 - 1 6 9 . 5 G . A . T h o u a s , N . A . K o r f i a t i s , A . J . F r e n c h . S i m p l i f ie d t e c h n i q u e f o r d i f f e r e n t i a l s t a i n i n

32、g o f i n n e r c e l l m a s s a n d t r o p h e c t o d e r m c e l l s o f m o u s e a n d b o v i n e b o a s t o c y s t s R e p r o d u c t i v e B i o Me d i c i n e O n l i n e , 2 0 0 1 , 2 5 -2 9 . 6 O k u n o M, Mo r i w a k i H, I m a i S , e t a l . R e t i n o i d s e x a c e r b a t e

33、 r a t l i v e r f i b r o s e s b y i n d u c i n g t h e a c t i v a t io n o f l a t e n t T G F - p 1 i n l ib e r s t e l l a t e c e l l . H e p a t o l o g y , 1 9 9 7 , 2 6 , 9 1 4 - 9 1 8 . 7 C h o w J F , L e e K F , C h a n S T , e t a l . Q u a n t i f ic a t i o n o f t r a n s f o r m

34、i n g g r o w t h f a c t o r b e t a l ( T G F b e t a l ) m R N A e x p r e s s i o n i n m o u s e p r e im p l a n t a t io n e r fi b r y o s a n d d e t e r m i n - a t i o n o f T G F b e t a l r e c e p t o r ( t y p e I a n d t y p e ，) e x p r e s s i o n i n m o u s e e m b ry o s a n d r

35、 e p r o d u c t i v e t r a c t . Mo l e c u l a r h u m a n r e p r o d u c t i o n , 2 0 0 1 , 7 ( 1 1 ) : 1 0 4 7 - 1 0 5 6 . 8 Mo a l l e m S A , H a l e s B F. I n d u c t i o n o f a p o p t o s i s a n d c a t h e p s i n D i n l im b s e x p o s e d I n V i t r o t o a n a c t i v a t e d a

36、 n a l o g o f c y c l o p h o s p h a m i d e . T e r o t o l o g y , 1 9 9 5 , 5 2 , 3 - 1 4 . 9 A r k a r y T , S h o s h a n a S , Ma r a t G , e t a l . C y c l o p h o s p h a m id e i n d u c e d in C R m i c e , t h e r o l e o f a p o p t o s i s t e r a t o g e n e s i s . T e r a t o g e

37、n C a r c i n o g e n Mu t a g e n , 1 9 9 5 , 1 5 , 1 7 9 , 1 9 0 . 1 0 G i u d i c e L C . G e n e s a s s o c ia t e d w i t h e m b ryo n ic a t t a c h m e n t a n d i m p l a n t a t io n a n d t h e r o l e o f p r o g e s t e r o n e . J . R e p r o d u c t i v e Me d , 1 9 9 9 , 4 4 , 1 6 5 - 1 7 1 . .4 7 2.