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1、第4 2 卷第3 期 2 0 0 8 年6 月 哈尔滨医科大学学报 J O U R N A LO FH A R B I NM E D I C A LU N I V E R S I T Y V d 4 2 ，N o 3 J u n ，2 0 0 8 2 3 1 维生素E 对老年雌性大鼠卵巢颗粒 细胞形态及凋亡的影响 卢长柱1 ，焦润生1 ，孔亚坤2 ，王月鹏1 ，姚兰眷H ( 1 哈尔滨医科大学生理学教研室，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 8 1 ；2 新乡市中心医院内分泌科，河南新乡4 5 3 8 0 0 ) 摘要 目的 观察维生素E 对老年雌性大鼠卵巢颗粒细胞结构及凋亡的影响。方法采用自然衰老雌
2、性大鼠， 实验组分别给予不同剂量维生素E ，用电镜观察卵巢颗粒细胞超微结构的变化，T U N E L 法检测颗粒细胞的凋亡。 结幂给予外源维生素E 组卵巢颗粒细胞形态和线粒体的结构趋于正常，老年对照组则发生明显异常改变，维生 素E 组卵巢颗粒细胞凋亡百分率降低，中、大剂量维生素E 组尤为明显。结论一定剂量的维生素E 可抑制卵巢 颗粒细胞超微结构的异常改变，减少颗粒细胞的凋亡，改善老年大鼠卵巢的功能。 关键词 维生素E ；卵巢；凋亡；颗粒细胞 中图分类号 R 一3 3 2 ；R 7 1 1 7 5 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 0 1 9 0 5 ( 2 0 0 8 ) 0 3 0 2
3、3 1 0 4 E f f e c to fv i t a m i nEo na p o p t o s i sa n dm o r p h o u so fo v a r i a l ng r a n u l a rc e l l s i nt h es e n i l ef e m a l er a t s L UC h a n g - z h u ，J I A OR u n s h e n g ，K O N GY a - k u n ，e ta l ( D e p a r t m e n to fP h y s i o l o g y ，H a r b i nM e d i c a lU
4、 n i v e r s i t y ，H a r b i n1 5 0 0 8 1 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：O b j e c t i v e T oo b s e r v et h ee f f e c to fv i t a m i nEs u p p l e m e n t a t i o no na p o p t o s i sa n dm o r p h o u so fo v a r i a ng r a n u l a rc e l l si nt h es e n i l ef e m a l er a t s M e t h o d s
5、D i f f e r e n td o s e so fv i t a m i nEw e r eg i v e nt on a t u r a la g e d f e m a l er a t s T h eu l t r a s t r u c t u r eo ft h eo v a r i a ng r a n u l a rc e l l sw a so b s e r v e db yu s i n gt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p e A p o p t o s i si no v a r i a
6、 ng r a n u l a rc e l lw a sd e t e c t e db yT U N E La s s a y R e m i t s C e l l u l a rm o r p h o u sa n dm i t o c h o n d r i as t r u c t u r eo fo v a r i a ng r a n u l a rc e l l sb e c a m en o r m a li nv i t a m i nEg r o u p s ，w h i l em a n ya b n o r m a lc h a n g e s w e r eo b
7、 s e r v e di ns e n i l ec o n t r o lg r o u p A p o p t o s i sr a t e so fo v a r i a ng r a n u l a rc e i l sb o t hs i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e di n m i d d l e d o s ea n dl a r g e d o s ev i t a m i nEg r o u p s C o n c l u s i o nAc e r t a i nd o s eo fv i t a m i nEc a nr e
8、 d u c et h ea p o p t o s i so fo v a r i a ng r a n u l a rc e l l 。d e c r e a s ea b n o n n i t i e so fg r a n u l a rc e i l si ns e n i l ef e m a l er a t sa n di m p r o v eo v a r i a n f u n c t i o n K e yw o r d s ：v i t a m i nE ：o v a r y ；a p o p t o s i s ；g r a n u l a rc e l l 女性
9、进入更年期，随着卵巢功能的减退，雌激素 分泌减少，导致多系统多器官的功能改变，这一改变 的基础源于卵巢内部的变化，其中最引人注目的是 卵泡闭锁，卵泡数量的急剧减少J 。目前认为细胞 凋亡是卵泡闭锁的主要机制之一，所累及的主要是 颗粒细胞凋亡b 。激素替代疗法虽然临床疗效确 切，但可引起许多不良反应和并发症，如子宫内膜 癌、乳腺癌等，使其应用受到一定的限制【3J ，故改善 收稿日期 2 0 0 7 0 7 1 6 基金项目 黑龙江省自然科学基金资助项目( m 0 0 6 4 2 ) 作者简介 卢长柱( 1 9 7 8 一) ，男，黑龙江海伦人，硕士研究生。* 通 讯作者 卵巢功能和延缓卵巢衰老，
10、减缓更年期综合征发生 是目前急待解决的问题。近年对维生素E 的相关 研究已有报道，但其对卵巢作用及机制尚未完全阐 明，尤其对卵巢颗粒细胞的影响也鲜见报道，本实验 拟通过观察维生素E ( V E ) 对老年雌性大鼠卵巢颗粒 细胞的影响，探讨防治女性更年期综合征的有效途 径。 1 材料与方法 1 1 实验动物及分组 实验选用W i s t a r 雌性大鼠，由哈尔滨医科大学 第二临床医学院实验动物中心提供。实验分组如 万方数据 2 3 2哈尔滨医科大学学报 第4 2 卷 下：实验组，筛选1 8 月龄的自然衰老大鼠，体重 ( 4 1 5 2 0 ) g ，随机分为4 组( 几= 8 ) ，分别为老年
11、对照 组和小、中、大剂量维生素E 组，每天分别腹腔注射 0m g k g 、5m g k g 、1 5 m g k g 、6 0n v , k g 维生素E ( 植物 油溶解，注射等体积) ，连续9 周。大鼠自然衰老的 判定：作阴道细胞涂片，连续检查2 个动情周期，无 规律性周期变化的为自然衰老大鼠。正常对照 组，选用4 月龄W i s t a r 成年雌性大鼠，体重( 2 0 0 2 0 ) g ，每天腹腔注射等体积溶剂。 1 2 实验药品 主要实验药品：维生素E 注射液( 上海通用药 业股份有限公司) 、T U N E L 试剂盒( R o c h e 公司) 和 D A B 试剂盒( 武
12、汉博士德生物工程有限公司) 。 1 3 实验方法 1 3 1 标本采集与制备：在末次给药2 4h 后，采用 断头法处死大鼠，迅速摘取双侧卵巢，一侧卵巢，置 于2 5 戊二醛溶液固定后，送电镜检测；另一侧卵 巢放人1 0 甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋切片。 1 3 2 卵巢颗粒细胞凋亡的测定：卵巢石蜡切片采 用T U N E L 法检测颗粒细胞的凋亡，按试剂盒实验步 骤进行，D A B 显色，苏木素轻度复染。细胞核中有 黄褐色颗粒者，为T U N E L 阳性细胞，即凋亡细胞。 在高倍镜下( X4 0 0 ) 统计凋亡颗粒细胞数，计算阳性 细胞百分率。 1 3 3 电镜观察：卵巢标本超薄切片电镜
13、的观察使 用J E M 1 2 2 0 型透射电镜( F t 本电子公司) 。 1 4 统计学分析 实验数据用元s 表示，采用S P S S1 3 0 统计软 件包，首先进行方差齐性检验，采用单变量方差分 析，最后再进一步两两比较，使用S N K 检验。 2 结果 2 1 大鼠卵巢颗粒细胞凋亡的检测 正常对照组颗粒细胞凋亡的数目少，核变化不 明显；老年对照组可见较多呈棕褐色染色的凋亡细 胞；小剂量维生素E 组颗粒细胞凋亡数目未见明显 减少( P O 0 5 ，图l ，附表) ，中、大剂量维生素E 组， 颗粒细胞核染色变浅，凋亡数目减少( P 0 0 1 ，图 l ，附表) 。 附表大鼠卵巢颗粒
14、细胞凋亡百分率( t , = 8 。牙士s ) 分组凋亡百分率( ) 正常对照组 老年对照组 小剂量V E 组 中剂量V E 组 大剂量v E 组 与正常对照组比较P 0 0 1 ，与老年对照组比较P O 0 1 图1 大鼠卵巢颗粒细胞凋亡检测D A B 染色4 0 0 加 田叭船 豇 3 4 5 4 5 士 9 3 8 6 8 7 3 5 1 3 ，盼盯弘 万方数据 第3 期卢长柱，等维生索E 对老年雌性大鼠卵巢颗粒细胞形态及凋亡的影响 2 3 3 2 2 电镜形态学观察 正常对照组卵巢颗粒细胞排列紧密，线粒体丰 富，游离核糖体发达。老年组颗粒细胞层次明显减 少，相邻细胞间隙增宽，胞浆内大量
15、脂褐素颗粒和大 量脂滴，线粒体空泡变。小剂量维生素E 组颗粒细 3 讨论 胞相邻细胞间隙相对增宽，线粒体呈管状，游离核糖 体发达，粗面内质网也较发达。中、大剂量维生素E 组卵泡细胞排列较致密，相邻细胞间可见桥粒或中 间连接，细胞内部细胞器结构清晰，未见脂褐素颗粒 ( 图2 ) 。 图2 大鼠卵巢颗粒细胞亚显微结构 x80 1 3 0 N ：细胞核；D ：脂褐素颗粒；一：中间连接 女性更年期综合征在各个种族、世界的各个地 区和各种经济状况的人群中都有发生H J ，近年来有 年龄提早、发生率上升的趋势，所以是一个较为广泛 的问题。绝经期女性由于卵泡闭锁加速，卵巢内卵 泡数目减少、卵巢功能的逐渐衰退
16、，合成和分泌雌激 素不足，使神经系统、循环系统、生殖系统、心血管系 统等靶系统、靶器官某种程度的功能低下，出现情绪 改变、免疫力低下和植物神经功能紊乱等表现。卵 泡合成分泌的性激素不足是更年期综合征的主要原 因，而颗粒细胞凋亡又是卵泡闭锁的主要机制。我 们在实验中也发现，在自然衰老大鼠的卵泡中，颗粒 细胞中的棕褐色颗粒明显增多，凋亡加速。实验还 发现，老年组大鼠卵巢颗粒细超微结构和正常对照 组相比发生明显异常改变，表现为相邻细胞间隙增 宽，相邻细胞间的连接结构如桥粒和中间连接等的 减少、细胞内有较多脂褐素颗粒和脂滴、核糖体减 少、线粒体有空泡变。 维生素E ，又称生育酚，具有广泛生理功能，最
17、重要的生理功能是作为有效的抗氧化剂，可阻止自 由基对组织的不饱和脂质的攻击，维持生物膜结构 的稳定1 5J 。同时，维生素E 还具有一定的非抗氧化 作用，可以调节相关酶的活性，如：天然a 生育酚可 以抑制蛋白激酶C 的活性 ，也可因调节相关基因 的表达门J 。本实验观察了维生素E 对卵巢颗粒细胞 的结构和凋亡的影响。研究发现，无动情周期的自 然衰老大鼠，补充维生素E 后，大鼠卵巢颗粒细胞 形态结构异常改变的程度较老年组轻，说明补充维 生素E 对细胞形态有保护作用，这种作用在中( 1 5 m g k g ) 、大( 6 0m g k g ) 剂量组更为明显。同时，随着 补充维生素E ，卵巢颗粒细
18、胞凋亡百分率明显降低， 中、大剂量组尤为明显，也表现出一定的剂量依赖 性。维生素E 能剂量依赖性地抑制颗粒细胞凋亡， 维持其正常形态结构，使卵泡内有功能的颗粒细胞 数相对增多，维护了卵泡的内分泌功能。这可能与 维生素E 的广泛作用有关。 维生素E 使卵巢颗粒细胞凋亡减少，可能来自 两方面的原因，一方面可能是维生素E 本身的强大 广泛的抗氧化作用和非抗氧化作用对细胞的保护； 另一方面也可能是维生素E 使卵泡颗粒细胞数目 相对增多后，提高了性激素的浓度，性激素对颗粒细 万方数据 2 3 4 哈尔滨医科大学学报第4 2 卷 ( 上接2 3 0 页) 1 2 方法 泪囊区常规消毒。包头，铺无菌孔巾。局
19、部表 面麻醉。从泪小点进针，按泪小管走行方向，将套管 针刺人泪囊，再将针送入鼻泪管。然后将金属针取 出，庆大霉素盐水冲洗通畅，即确定塑料套管留置在 泪道中，泪小管上皮沿套管壁爬行愈合，3 个月后取 出套管。拔管后1 月内每周冲洗泪道2 次，并给予 抗生素滴眼液治疗。 2 结果 所有手术患者均在数分钟内顺利完成。随访时 间通常为手术后4 6 月。2 1 只眼完全再通，功能 良好。3 只眼自我感觉少量流泪，加压冲洗通畅。2 只眼流泪较明显，冲洗不通。 3 讨论 内眦部上、下眼睑组织，即泪小管走行部无睑板 组织，此处组织相对脆弱，因此，泪小管断裂是常见 的眼附属器外伤【3 。临床上下泪小管损伤较上泪
20、小 管多见，且下泪小管在功能上起主要作用，下泪小管 断裂若不治疗则造成患者终身泪溢，手术是唯一的 治疗方法 4 。 创口较为整齐的新鲜外伤性泪小管断裂治疗并 不困难，在手术显微镜下大部分都能找到离断的泪 小管远端，行I 期泪小管断裂吻合术，术后效果良 好。由于条件限制，一些基层医院不能行泪小管断 裂I 期吻合，只做创口的清创缝合术，需期到上级 医院行泪小管断裂吻合术。临床上也有一些病例实 施泪小管I 期吻合较为困难，如眼睑组织严重挫裂 伤。即使I 期吻合成功，由于术后组织反应重，泪小 管极易因瘢痕组织形成堵塞，仍需行期吻合。利 用套管针行泪道探通术代替以往的期泪小管断裂 吻合术，同样可以达到其
21、治疗效果。虽然无法避免 期泪小管断裂吻合术的术后并发症，但其操作方 法简单方便，实用性强，成功率高，临床上值得推广。 参考文献 1 申长新，沈玲自制探针行泪小管断裂吻合术6 8 例体会 J 郑州大学学报( 医学版) ，2 0 0 7 。4 2 ( 1 ) ：1 2 2 邓灵锟外伤性下泪小管断裂的治疗 J 华夏医学，2 0 0 3 ，4 ( 1 6 ) ：2 0 - 2 1 3 乔玉春，钟启明，杜文娟，等治疗陈旧性泪小管断裂3 0 例体会 J 眼外伤职业眼病杂志，2 0 0 5 ，2 7 ( 1 0 ) ：3 1 3 2 4 孔巧，周奇鸣，姚东伟，等泪小管断裂吻合术5 l 例报告 J 现 代实用医学，2 0 0 2 ，1 4 ( 2 ) ：1 8 - 1 9 万方数据