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1、维生素E 对体外培养 鸡脾淋巴细胞D N A 合成的影响 胡崇伟1 ，王众1 ，封家旺2 ，李静1 ，李艳飞 ( 1 东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨1 5 0 0 3 0 ； 2 西藏牧业技术学院农牧系，西藏拉萨8 5 0 0 3 0 ) 维生素E ( v E ) 是动物体内所必需的营养物 质。V 。对免疫功能的影响倍受国内外研究者关 注。研究表明，V 。对人及各种动物体都具有免疫 调节作用，对淋巴细胞D N A 合成的测定是间接 反映免疫功能的重要指标。V 。对鸡淋巴细胞 D N A 合成的影响未见有文献报道。本研究将不同 浓度的V 。添加到淋巴细胞培养液中，对淋巴细胞 进行原代培养，
2、通过3 H T d R 掺入法观测不同浓 度的V 。对淋巴细胞D N A 合成的影响，为揭示v E 的免疫调解作用提供理论依据。 1 材料与方法 1 1 脾脏淋巴细胞的提取与处理 1 月龄健康海兰蛋鸡，心脏采血处死，无菌条件 下取其脾脏，分离淋巴细胞，以每孔1 x 1 0 6 个m L 淋 巴细胞接种于2 4 孔细胞培养板中，V t ( Q 一生育 酚，i n v i t r o g e n 公司) 用无水乙醇溶解添加到培养液 中，使其终浓度分别为5 0 、1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 m m o l L ，对 照组加入相同体积的无水乙醇和培养液。试验组 与对照组均设8 个复孔，处理
3、后的细胞置于C O ： 培养箱中，常规培养2 4h 。 1 2D N A 合成检测 1 2 1T 细胞D N A 合成的检测采用3 H T d k 掺 入法1 调整细胞浓度为每孔I 1 0 6 个m L ，各组分 别加入刀豆蛋白A ( C o n A ，S i g m a 公司) 至终浓度 为5 m g L ，细胞处理同上，置3 7 、5 C O ：培养 箱培养2 4h 后加3 H T d R ( 北京原子能研究所) 收稿E l 期：2 0 0 8 - 1 2 - 1 2 修回日期：2 0 0 9 - 0 3 - 0 4 基金项目：国蒙自然基金项目( 3 0 4 7 1 2 7 9 ) ；黑龙
4、江省博士 后科研启动全( L B H Q 0 5 0 2 4 ) 通讯作者，E m a i l ：y a n f e i l L 2 0 0 y a h o o c o m c n 0 5i 上c i 每孔，经6 h 后收获细胞，离心10 0 0r r a i n ， 吸弃上层培养液以除去游离的3 H T d R 。用 0 0 7 5m m o l L 的K C l 溶液低渗处理沉淀的细胞 以破坏红血细胞，减轻颜色猝灭对测量的影响，经 离心吸除上清液后，将沉淀部分再用5 的三氯乙 酸洗3 次，酒精乙醚( 1 ：4 ) 1 次，乙醚1 次。最后将 千沉淀物用1m L0 3N 的K O H 溶液溶
5、解，温育 消化，准确取出上述处理消化液2 0 “L 放于预先 加有5m L 闪烁液的玻璃测量杯中，液体闪烁计 数仪( 美国B a c k y a r d 公司) 测定其放射性。结果以 “c p m 值”表示。 1 2 2 B 淋巴细胞D N A 合成的检测 方法同前，将终浓度5m g LC o n A 改成终浓 度为1 0m g L 的脂多糖( L P S ，S i g m a 公司) 。 1 3 试验数据的分析与统计 应用S P S S1 1 5 软件对试验数据进行统计分 析，数据均以平均值标准差表示。 2 结果 由表1 可以看出，与对照组相比，随着V 。浓 度的增加，脾淋巴细胞对3 H T
6、 d R 掺人能力增 强，v E 为2 0 0m m o l L 时，T 、B 淋巴细胞D N A 合成能力最强，V 。为3 0 0m m o l L 时，淋巴细胞 对3 H T d R 掺人能力反而下降，但仍然高于对 照组，当V 。的浓度达到4 0 0m r n o l L 时，淋巴细 胞对啊一T d R 掺人能力明显降低，各V e 处理 组与对照组相比，差异显著或极显著( P O 0 5 ； P O 0 1 ) 。 3 讨论 V 。是一种天然的抗氧化剂和免疫调节剂，是 维持动物良好营养状态和生产性能所必需的营养 物质，因此，探讨动物体V 。营养与免疫功能内在关 一4 5 万方数据 表1V
7、。对鸡脾T 、B 淋巴细胞D N A 合成的影响 注：同列数据 表示与对照组差异显著( P 00 5 ) 表示与对照组 差异极显著( P 0 0 1 ) 。 系或规律是当前动物营养学研究中的一个热点 2 】。 研究表明，V 。能通过提高辅助T 细胞活性而有效 刺激B 淋巴细胞反应，E r f 等口1 认为，V 。是C D 4 + 、 C D 8 + T 细胞的免疫调节剂。M o r i g u c h i 等H 还发 现，大剂量摄人V E ( 1 0 25 0 0m g k g ) 1 0d ，大鼠脾 淋巴细胞数量显著增加，脾细胞对丝裂原C o n A 的反应也显著增强，N K 细胞活性随着饲
8、料中V e 含量的增加而增强。S a k a i 等凸 研究表明，对P H A 、 C o n A 诱导的增殖反应，常规饲料组老龄大鼠脾 淋巴细胞增殖反应水平显著降低，而在1 0 倍常规 剂量补充v E1 2 个月后，老龄鼠I L 一2 产生增加， 增殖反应也恢复至成年鼠水平。 维生素E 是一种脂溶性物质，难溶于培养 液，本试验借助于无水乙醇溶于培养液，微量的 无水乙醇对淋巴细胞生长几乎没有影响 6 。对体 外淋巴细胞D N A 合成的测定是间接反映免疫 功能的一项很有说服力的指标。3 H T d R 掺入法 是检测D N A 合成的经典方法。C o n A 可以诱导 T 淋巴细胞活化，表达I
9、 L 一2 受体；L P S 是B 细胞 的丝裂原，直接刺激B 细胞发生有丝分裂，为B 细胞的多克隆激活剂 9 】。所以，本试验用C o n A 和L P S 分别刺激T 、B 细胞增殖，以此分化T 、B 细胞。 v 。在一定范围内能促进免疫器官的发育和免 疫细胞的分化 7 1 ，高宁【8 用含0 、5 0 、1 5 0 、10 0 0m g k g V 。饲料喂饲初断奶小鼠8 周后，1 5 0n a g k g 饲 料组改善免疫反应作用最强，而大剂量补充V z ( 10 0 0m g k g 饲料) 未能进一步提高反应，且有下 降趋势，但未观察到低于正常需要量组的反应，本 试验与上述结论一致
10、，5 0 、1 0 0 、2 0 0m m o l LV E 可 显著促进体外培养鸡脾脏淋巴细胞D N A 的合成 能力，3 0 0m m o l LV E 对D N A 合成的促进作用减 弱，但明显高于对照组，4 0 0m m o l LV E 抑制D N A 合成。这种作用可能是V z 作为免疫刺激剂有选择 地影响细胞D N A 合成；也可能由于其抗氧化性 质通过调节P G E 2 的合成所致，其作用机制有待于 进一步研究。最近有文献报道高剂量的V e 具有毒 性作用，认为过量V 。会使鸡腿畸形吲。高宁等 1 哪实 验结果表明，小鼠大剂量补充V E ( 2 0 倍需要量时) ， 提高免疫反
11、应的作用低于3 倍需要量组。L i m 等“1 也曾报道，高剂量补充V 。1 周后，小鼠A D C C 活性 显著提高，而延长至2 2 周后反应降低，出现抑制 P H A 诱导的丝裂原反应。过量补充V 。可能对免 疫功能造成的不良影响及其它毒性反应尚需进一 步研究。 参考文献： 1 陈忠明，冯乐平，王英丽，等B 一胡萝h 素对人淋巴细胞D N A 合成的影响 I 实用肿瘤学杂志，1 9 9 7 ，1 1 ( 2 ) ：8 5 8 6 2 高宁，叶建峰维生索E 的免疫调节剂作用U 国外医学卫生 学分册，2 0 0 0 2 7 ( 1 ) ：4 6 5 0 3E r rGF ，S m y t hJ
12、R A l t e r a t i o mi nb l o o dl e u k o c y t ep o p u h - t i o mi ns r 啪l i n ec h i c k e n sw i t ha u t o i m m u ev i t i l i g o 【I P o u l t r y S c i e n c e 1 9 9 6 7 5 ：3 5 1 - 3 5 6 4 M o r i g u c h iS H i g I ld i e t a r yi n t a k e so fv i t a m i nEa n dc e l u l a r i m l n u l
13、 l ef u n c t i o mi nn t s U JN u t r ，1 9 9 0 ，1 2 0 ：1 0 9 6 5S a k a iS L o n g t e r mf e e d i n go fh i g hv i t a m i n Ed i e ti m p r o v e s t h ed e c r e a s e dm i t o g e nr e s p o n s eo fr a t s p l e n i cl y m p h o c y t e sw i t h a g i n g U JN u t rS c iV i t a m i n 0 1 1 9
14、9 7 ，4 3 ：11 3 6M a s a k iH ，O k a n oY ，O c h i a iY 却h a t o c o p h e r o li n c r e a s e st h e i n t r a c e l l u l a rg l u t a t h i o n el e v e li nH a c a Tk e r a f i n o c y t e sU F r e e R a d i cR e s 2 0 0 2 ，3 6 ( 6 ) ：7 0 5 7 0 9 7 M o r i g u c h iS V i t a m i nE a n di m m u
15、n i t y U N u 口，1 9 9 2 。1 2 0 ( 3 ) ： 1 0 9 6 - 11 0 2 8 高宁叶建峰维生素E 对胸腺T 细胞C D 抗原分化及其作用 机理的研究U 中国公共卫生，1 9 9 9 。1 5 ( 4 ) ：2 8 9 2 9 1 9F r a n c h i n iAs ，B e r t u z z iSM T h ei n f l u e n c eo fh i g I ld o s e so f v i t a m i nEo ni l l l r n u n er e s p o n s eo fc h i c k e n st oi n a c t
16、 i v a t e d0 丑a d - j u y a n tv a c c i n e J C l i n i cV e t ，1 9 9 6 ，1 0 9 ：1 1 7 1 2 4 1 0 高宁，叶建锋大剂量维生紊E 对脾脏T 淋巴细胞亚类及 M P 诱生I L - 1 的影响U 中国公共卫生1 9 9 9 ，1 8 ( 2 ) ：1 0 1 - 1 0 3 1 1L i r aTS E f f e c to fv i t a m i nEo nc e l l m e d i a t e di n l l n u n e 睁 s p o n s ea n ds e r u mc o r t i c o s t e r o n ey o u n ga n dm a t I l r ：m gm i c e I m m u n o l o g y ，1 9 9 7 ，4 4 ：2 8 9 口 4 6 万方数据