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1、第2 6 卷第3 期 2 0 0 9 年6 月 实验动物科学 L A B O R A T O R YA N I M A LS C I E N C E V 0 1 2 6N o 3 J u n e2 0 0 9 结合高脂饲料建立酒精性肝损伤大鼠模型的研究* 谢超敏谭巧燕饶子亮夏冠玲钟志勇 王 刚 ( 广东省医学实验动物中心，广州5 t 0 0 5 5 ) 摘要：目的研究酒精性肝损伤大鼠模型建立的理想方式。方法取健康雄性s D 大鼠3 0 只，随机分为对照组、模 型组各1 5 只，模型组给予高脂饲料并灌服白酒，持续四周。实验结束时从大鼠眼眶静脉丛采血，测定血清中谷氨 酸氨基转移酶( A L T )
2、 、天门冬氨酸转移酶( A S T ) 、总胆固醇( T c ) 、甘油三脂( m ) 、高密度脂蛋白( H D L - C ) 、肝脏中超氧 化物岐化酶( S O D ) 、丙二醛( M D A ) 、肝内糖原含量、肝细胞凋亡情况、肝脏系数。结果模型组动物的肝脏指数、血 清中的T C 、T G 和H D L - C 、肝糖原、肝脏中M D A 的含量、S O D 的含量与对照组比较，显著性升高( P 0 0 5 ) ；模型组动 物血清中的A L T 和A S T 与对照组比较，显著性升高( P 0 0 1 ) ；模型组动物肝脏的脂肪化、炎症和坏死的评分均明 显高于对照组( P 0 0 5 )
3、 。结论灌服酒精加以饲喂高脂饲料能成功建立酒精性肝损伤大鼠模型。 关键词：高脂饲料；酒精性肝损伤；大鼠模型 中图分类号：R - 3 3 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 6 6 1 7 9 ( 2 0 0 9 ) 0 3 0 0 1 1 - 0 3 酒精性肝病( A L D ) 在现今人类疾病学上被列为 多发性疾病，严重危害人类生命健康。酒精性肝损 伤常有连续性损害的发生即酒精性脂肪肝、酒精性 肝炎、酒精性肝纤维化和肝硬化。西方国家根据不 完全统计，该病的病死率甚至比某些癌症的病死率 还要高。酒精性脂肪肝( A F L D ) 是现在临床上最为 常见的肝病之一，其发病及肝损伤机制相当复杂，
4、至 今尚未完全阐明。随着生活水平提高，我国酒精性 肝病有迅速增多的趋势。因此，建立酒精性肝损伤 动物模型有较大的现实意义。 1 材料和方法 1 1 动物来源 S P F 级雄性S D 大鼠，体重2 8 0 3 2 0g ，由广东省 医学实验动物中心提供( 合格证号S C X K ( 粤) 2 0 0 6 A 0 1 5 ) 。 1 2 饲养环境 屏障系统。温度2 0 一2 5 ，相对湿度4 0 一 7 0 ，光照周期为1 2h ：1 2h ( 光照起止时间为：6 点一 1 8 点) ，换气次数1 5 。2 0 次，h 。所用饮水、垫料均经 1 2 1 ，3 0m i n 高压蒸汽灭菌，高脂颗粒
5、饲料( 0 2 丙 基硫氧嘧啶、4 胆固醇、8 猪油、5 蛋黄粉、1 猪 胆酸钠、基础饲料：8 1 8 ) 由本中心提供，并经 1 2 1 ，3 0m i r l 高压蒸汽灭菌。水和饲料自由饮食。 1 3 主要实验仪器及试剂 1 3 1 主要实验仪器：全自动生化检测仪：意大利 L O G O T E C H 公司产品，型号：E C H O 。紫外可见分光 光度计：尤尼卡仪器有限公司，型号：U V 一2 8 0 0 。组织 匀浆仪：上海金达生化仪器有限公司，型号：X H F - 1 。 数显恒温水浴锅：金坛市富华仪器有限公司，型号： H H 4 。 1 3 2 主要试剂：A L T 测定试剂盒、
6、A S T 测定试剂 盒、T C 测定试剂盒、T G 测定试剂盒：上海复旦张江 生物医药股份有限公司，批号：0 6 0 9 0 1 ；0 6 0 7 0 1 ； 0 6 0 8 0 1 ；0 6 0 1 1 0 1 ；H D L - C 测定试剂盒：浙江东瓯生物 工程有限公司，批号：2 0 0 6 0 4 0 1 4 5 ；S O D 测定试剂盒、 M D A 测定试剂盒、糖原测定试剂盒、蛋白质测定试 剂盒：南京建成生物工程研究所，批号：2 0 0 7 0 1 0 8 ； 2 0 0 7 0 1 0 8 ；2 0 0 7 0 1 0 8 ；2 0 0 7 0 1 0 5o 1 4 实验方法 雄
7、性S D 大鼠3 0 只，随机分为对照组1 5 只、模 收穑日期：2 0 一0 8 2 1 基金项目：广东省科技计划项目( 7 J ) 0 8 A 0 6 0 2 ( O ( X Y 2 ) 作者简介：谢超敏( 1 9 8 4 一) ，女，助理实验师。研究方向：实验动物学。 通讯作者：王刚( 1 9 6 6 一) ，男，高级兽医师。联系方式：g d m l a e g n u t i l m 万方数据 1 2 实验动物科学 2 6 卷 型组1 5 只。适应性饲养一周( 模型组喂饲高脂饲 料) 后，每天灌胃一次，对照组灌服生理盐水，模型动 物灌服5 5 度红星二锅头白酒2m I J l 0 0g
8、 。对照组喂 饲普通全价饲料( 基础饲料) 。模型组除灌酒精外， 每日以高脂颗粒饲料喂饲一普通全价饲料( 1 0 0g ) 中 添加0 2 丙基硫氧嘧啶、4 胆固醇、8 猪油、5 蛋黄粉、1 猪胆酸钠实验起、始即实验过程中按常 规每周称体重一次。实验第2 8d ，动物禁食不禁水 1 6h ，眼眶静脉采血，测定血清中的A L T 、A S T 、T C 、 T G 、H D L - C ；采肝脏，测定肝脏中肝内糖原、S O D 、 M D A 及肝细胞凋亡情况，甲醛固定，病理送检。 1 5 统计方法 实验所得数据采用S P S S l l 0 统计软件进行f 检验分析。 2结果 2 1 日常观察
9、结果 正常组大鼠毛发亮泽，动作灵活，食欲和大便正 常，无溏便，无死亡；模型组大鼠在初期灌服酒精后 均有流涎，体态呆板，嗜睡，精神萎靡，食欲减退，稀 便，行动迟缓等现象，一般需要经过6h 后才开始苏 醒，1 6h 时后完全清醒，并表现为毛发光泽度差，体 重增长缓慢，多数大鼠的大便较为稀烂。 2 2 酒精性肝损伤大鼠肝脏指数、肝中蛋白含量、 肝脏中肝糖元的含量和死亡率变化情况 从表1 可知，模型组大鼠的肝脏指数、肝糖元与 对照组比较，具有显著性差异( P 0 0 1 ) ，说明模型 组动物肝脏具有肿大现象。 表1 酒精性肝损伤大鼠的肝脏指数、蛋白含量、 肝糖元和死亡率的变化( j F ) 2 往：
10、与对照组比较，”* ”P 0 0 5 ；与对照组比较，“* * ”P 0 0 1 2 3 酒精性肝损伤大鼠肝血清A L T 和A S T 含量， 血清中T C 、T G 和H D L C 的含量 从表2 可知，模型组血清中的A L T 和A S T 与对 照组比较，具有显著性差异( P 0 0 1 ) ，模型组动物 血清中的T C 、H D L - C 与对照组比较，具有显著性差 异( P 0 0 5 ) ，说明造模成功。 表2 酒精性肝损伤大鼠血清中A L T 、A S T 、T C 、T G 和H D L - C 的含量( j4 - j ) 注：与对照组比较，“* ”P 0 0 5 ；与对
11、照组比较，“* * ”P 0 0 1 2 4 酒精性肝损伤大鼠肝组织中M D A 含量及 S o D 的活力 从表3 可知，模型动物肝脏中M D A 的含量与对 照组比较，具有显著性差异( P 0 0 5 ) ；模型组大鼠 肝脏中S O D 含量与对照组比较，具有显著性差异( P 0 0 5 ) 。 表3 酒精性肝损伤大鼠肝组织中M D A 含量 及对S O D 的影响( 霉s ) 注：与对照组比较。P 0 0 5 ；与对照组比较，“* * ”P 0 0 1 2 5 肝组织光镜下观察结果 模型组大鼠肝组织内可见弥漫性的肝细胞脂肪 变性，以肝小叶中央静脉周围为重，大多数肝细胞胞 质可见大小不等的
12、由脂肪滴形成的圆形透明空泡。 胞质疏松、淡染；脂肪化严重的肝细胞明显增大变 圆，胞质内可见大而圆的空泡将胞核挤向细胞边缘， 肝窦受压，肝细胞索排列紊乱；可见广泛的K u p f f e r 细胞增生；小叶内可见点状或碎片状坏死病灶，病灶 多位于中央静脉周围或偏侧，病灶内可见淋巴细胞 为主的炎性细胞浸润及坏死的肝细胞碎片，一些坏 死区可见纤维结缔组织增生；此外，汇管区也常见以 淋巴细胞为主的炎性细胞浸润；组织内有的肝细胞 核固缩，并可见少量深伊红染的双核肝细胞，提示有 肝细胞的再生。根据N a n j i 等的方法进行病理评 分分析，模型组动物的脂肪化、炎症和坏死的评分均 明显高于对照组( P
13、0 0 5 ) 。 3 讨论 酒精性肝病包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒 精性肝纤维化及酒精性肝硬变，四者是渐进性的过 程，亦可不同类型同时存在，严重危害患者健康。目 万方数据 第3 期谢超敏等：结合高脂饲料建立酒精性肝损伤大鼠模型的研究 1 3 前认为，K u f f e r 细胞、氧化应激、细胞因子等介导了 A F L D 的肝损伤过程啦! 。要探讨酒精性肝病的发病 机制及病理过程，需良好的实验动物模型。有关建 立酒精性肝损伤动物模型，国内外多用灌服酒精、胃 插管灌注含酒精液体饲料、喂食酒精液体饲料、液体 食料加辅剂等方法。本实验采用灌服5 5 度二锅 头并饲喂高脂饲料，4 周后测定的各项
14、指标值都证 明了模型的建立成功，而且实验造模时间提前了8 周H o ，本研究统计学数据跟单纯灌以酒精造模b o 和 单纯喂养高脂饲料成模拍。的测定指标数据比较，更 为确切地表明建立了稳定的酒精性肝损伤大鼠模 型。实验中，高脂饲料能导致大鼠高血脂，形成脂肪 肝，在肝纤维化的基础上灌以酒精能使肝内皮细胞 严重损伤，肝脏指数及肝糖元值的升高说明肝脏有 肿大现象，血清中A L T 、A S T 、T C 升高，肝组织中M D A 含量升高及S O D 活性降低，说明造模成功；镜下观 察结果显示，肝细胞变性程度提示形成肝损伤，酒精 性肝损伤模型成立。 实验过程中总共有3 只大鼠死亡，其中模型组 死亡大鼠
15、是灌酒后第2d 发现死亡，解剖时未发现 胸腔有瘀血或胃穿孔，死因不明，死前均表现为步履 蹒跚、烦躁不安、流涎及阵发性抽搐等现象。实验中 模型组动物肝组织中S O D 水平明显低于对照组，说 明模型组动物的抗氧化能力显著降低，致使自由基 清除不力，发生过氧化损伤，脂质过氧化产物在体内 蓄积，脂质过氧化损伤肝细胞，激活星状细胞，引起 细胞结构和功能改变，发生脂肪变性，以致引起腹泻 等消化道不良反应。这些改变都类似人类酒精肝损 伤的病理变化n ，针对性地复制了酒精性肝损伤动 物模型。但由于染毒途径、剂量及动物种属的差异， 动物肝损伤模型建立仍不十分理想，同时目前国内 外尚未建立统一、完善的酒精性肝损
16、伤的动物模型。 本实验取材方便，易于操作，在4 周内成功建立酒精 性肝损伤大鼠模型，为酒精性肝病研究提供了一种 较好的造模方法。 参考文献 1 N a n j l i 。AA ，J o k e l a i n e nK ，T i p o eGL ，甜耐D i e t a r ys a t u r a t e df a t t y a c i d Br e v e r s ei r d a m m a t o r ya n df i b m i cc h a n g e si nr a tl i v e rd e 叩沁 c o n t i n u e de t h a n o la d m i
17、n i s t r a t i o n 【JJ JP h a n n a c o lE 印T h e r ，2 0 0 1 ， 2 9 9 ( 2 ) ：6 3 8 6 4 4 2 】周淑琴贾从义，高殿生，等实验性慢性酒精中毒对大鼠肝 脏损伤的病理形态学观察 J 中华病理学杂志，1 9 8 6 ，1 5 ( 2 ) ： 1 3 6 1 3 9 3 T s a k a m o t oH ，R e i d e l b e r g e rRD ，F r e n c hSW ，I a g n mc L o n g - t e r m c a n n u l a t i o nm o d e lf o
18、rb l o o ds a m p l i n ga n di n t r s g t r i ci n f u s i o ni nt h e m t E J A mJP h y s i o l 。1 9 8 4 ，2 4 7 ( 1 6 ) ：5 9 5 5 9 9 4 张健，王炳元，鞠晓华，等复方中药对酒精性肝病大鼠核因 子B 的影响 J 中国医科大学学报，2 0 0 6 ，1 ( 3 5 ) ：3 8 3 9 5 李舒丹，厉有名，虞朝辉大鼠慢性酒精性肝损伤模型的建立 J 浙江医学，2 0 0 2 ，2 4 ( 9 ) ：5 2 4 5 2 5 6 】樊希承，黄颖，黄亦琦，等非酒精性脂肪
19、肝模型的建立与逆 转情况 J 中国临床康复，2 0 0 6 ，1 0 ( 2 4 ) ：1 0 3 1 0 6 7 】腺书玲，武希润，习玲一氧化氮和自由基对大鼠急性肝损 伤的作用 J 世界华人消化杂志，1 9 9 9 ，7 ( 3 ) ：2 2 2 2 2 3 A l c o h o l - i n d u c e dL i v e rI n j u r yC o m b i n e d 喇t h 碰g hF a tD i e ti nR a t s X I EC h a o - m i n ，T A NQ i a o y a h ，R A OZ i l i a n g ，X I AG u a
20、 n l i n g ，Z H O N GZ h i y o n g ，W A N GG a n g ( 白觑M e d c a L a b o r a t o r yA r d m 丘C e n t e r ，G u a n g z h o u5 1 0 0 5 5 ，) A b s t r a c t ： O b j e c t i v eT oe s t a b l i s ha l li d e a lm e t h o dt od e v e l o pa l c o h o l i n d u c e dl i v e ri n j u r yi nr a t s M e t h
21、o dT h i r t y h e a l t h ym a l eS p r a g n e D a w l e y ( S D ) r o t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t ot w og r o u p s ，c o n t r o lg r o u p ( s i v eN S ) a n dm o d e lg r o u p ( d r i n k i n gr e dS t a rf a l l sa n df e e d i n gh i s h f a td i e t ) ，a n d1 5p e rg r o u p
22、 址lt h er a t sw e r ek e p to nt h et r e a t m e n t sf o r4 w e e k s B l o o dW a Sc o l l e c t e df r o mt h eo r b i t a lv e n o u sp l e x u sa tt h ee n do fe x p e r i m e n t 。a n ds e r u ml e v e l so fA L T ，A S T ，T C ， T G ，H D L C ，S O D ，M D A ，a n dh e p a t i cg l y c o g e nc o
23、 n t e n t ，a sw e l l 嬲l i v e rc o e f f i c i e n tw e r ed e t e c t e d R e s u l t s T h el i v e r c o e f f i c i e n ta n d $ e r u ml e v e l s o fT C ，I a n d H D L 广C ，h e p a t i cg l y c o g e n ，M D A ，a n dS O D i nm o d e lg r o u pi n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l yt h a nt
24、 h o s ei nc o n t r o l ( P 0 0 5 ) ；S e r u ml e v e l so fA L Ta n dA S Ti nm o d e lg r o u pa l s oi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y t h a nt h o s ei nc o n t r o l ( P 0 0 1 ) C o n c l u s i o nI ti Sas u c c e s s f u lm e t h o dt od e v e l o pt h ea l c o h o l i n d u c e dl i v e ri n j u r yi n r a t s c o m b i n i n ga l c o h o l d r i n k i n gw i t hh i g h f a td i e tf e e d i n g K e yw o r d s ：H i g hf 乱d i e t ；L i v e rd a m a g e ；B a tm o d e l 万方数据