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1、型 慧笠丝氢复氢盟垩遄皿细胞增蕉兰塑圭笪墅喧丛塑垂啦王亟苤! 魍 缺氧复氧对平滑肌细胞增殖与凋亡的影响及蝎毒的干预 刘慧郑杨1( 川北医学院附属医院心血管内科，四川南充6 3 7 0 0 0 ) 2 9 1 摘要】 目的观察缺氧复氧及在此基础上给予蝎毒后血管平滑肌细胞( V S M C ) 增殖和凋亡的改变及凋亡相关基因b c l - 2 、b a x 的变化，探讨 缺氧复氧对V S M C 的损伤和蝎毒对缺氧复氧V S M C 的保护作用及机制。方法组织贴块法培养V S M C 后随机分为6 组：对照组、缺氧复氧模型组、 模型+ 蝎毒组，其中蝎毒又分为5 、1 0 、2 0 、4 0m g
2、L 不同浓度组。M 1 r 测定细胞增殖变化，T U N E L 法检测细胞凋亡，免疫组化法测定b e l - 2 、b a x 表达。 结果( 1 ) M 1 1 1 法测定对照组、模型组A 值分别为1 7 0s 0 2 4 、2 2 3s 0 2 7 二者存在显著性差异( P 9 8 的细胞染色呈阳性，即细胞浆内呈现棕黄色 反应，胞核不着色，表明细胞含有肌动蛋白，证实为平滑肌细胞。 2 2 缺氧复氧后V S M C 增殖能力的变化及蝎毒对细胞增殖的 影响对照组、模型组A 值分别为1 7 0 0 2 4 、2 2 3 0 2 7 。二 者存在显著性差异( P O 0 5 ) ，提示缺氧复氧促
3、进V S M C 增殖； 模型+ 蝎毒5 、2 0m g L 组A 值分别为1 9 9 0 2 8 、2 1 3 0 2 4 ，与对照组比较有统计学意义( P 0 0 5 ) 。模型+ 蝎毒 1 0 、4 0m s l 组A 值分别为1 9 2 0 1 6 、1 8 9 0 7 4 ，比模型组 A 值显著降低，有统计学意义( P 0 0 5 ) ，提示蝎毒有抑制缺氧 复氧后V S M C 增殖的作用。 2 3 缺氧复氧后V S M C 凋亡的变化及蝎毒的影响实验中各 组均可见凋亡阳性细胞。对照组细胞凋亡率为( 2 6 4 1 4 ) ，与模型组 ( 1 7 4 0 9 ) 之间存在显著性差异(
4、 P 0 0 5 ) 。模型组凋亡率最低，模型+ 蝎毒5 、1 0 、4 0m s L 组的凋 主幽量堡堂苤圭! 塑! 生! 旦箜垫鲞 亡率分别为( 2 5 6 2 8 ) 、( 3 3 5 3 5 ) 、( 3 4 5 5 2 ) ， 比模型组凋亡率显著升高( P 0 0 5 ) ，提示蝎毒有促进缺氧复 氧后V S M C 凋亡的作用。模型+ 蝎毒2 0m g L 组凋亡率 ( 2 0 1 2 4 ) ，与对照组比较有统计学意义( P 0 0 5 ) 。 2 4 凋亡基因b c l - 2 、b a x 蛋白表达及其比值的变化 b c l - 2 、 b a x 蛋白均在细胞浆内表达，用免疫
5、组织化学方法检测，镜下可 见凋亡细胞胞核染成蓝紫色，胞浆染成棕黄色。模型组b c l 一2 蛋白阳性率比对照组显著升高，b a x 蛋白阳性率则显著降低， b c l - 2 b a x 比值显著升高( 均P 0 0 5 ) 。模型+ 蝎毒5 、1 0 、 4 0m g L 组的b c l 2 蛋白阳性率比模型组均降低( 均P 0 0 5 ) ， b a x 蛋白阳性率比模型组增高( 均P 0 0 5 ) 。蝎毒各浓度组 b c l - 2 b a x 比值较模型组均显著降低( 均P 0 0 5 ) ，见表1 。 表lV S M Cb c l - 2 、b a x 蛋白阳性率及 b c l -
6、 2 b a x 比值的变化( i4 - S 。n = 8 ) 删。翁产1 嚣严6 譬黔叫挑“雌 对照组 一l O 8 3 1 2 9 ”1 2 4 9 0 6 6 ”0 8 7 0 0 8 l 】 模型组 一1 2 5 3 士1 0 41 0 1 8 0 4 21 2 3 0 1 0 模型+ 蝎毒1 组5 1 0 8 5 0 8 3 ”1 2 0 6 0 1 2 ”0 9 0 0 0 7 ” 模型+ 蝎毒2 组1 09 7 4 0 5 6 1 ) 扪1 1 4 8 士0 5 3 1 ) 扪0 9 2 0 0 5 1 ) 模型+ 蝎毒3 组2 01 1 9 14 - 0 5 6 “ 1 0 5
7、 6 0 2 8 ”1 1 3 0 0 5 1 ) 2 ) 模型+ 蝎毒4 组4 09 6 1 0 4 5 1 ) 引1 1 5 2 0 3 8 1 ) 扪0 8 3 0 0 2 1 ) 与模型组比较：1 ) P 0 0 5 ；与对照组比较：2 ) P O 0 5 3 讨论 V S M C 的异常增殖迁移和表型改变是动脉粥样硬化和血 管成形术后再狭窄的关键环节，也是高血压等心脑血管疾病的 主要病理学基础。细胞凋亡调节人体生理和病理的细胞数目 平衡，V S M C 凋亡在动脉粥样硬化和血管狭窄的发生发展过程 中也起到重要作用。 3 1 缺氧复氧对V S M C 增殖与凋亡的影响及可能机制缺血 再
8、灌注损伤是发生在许多器官和组织的较常见的病理现象，有 学者报道在大鼠提睾肌缺血再灌注模型中观察到V S M C 增殖 增多，说明缺血再灌注可刺激V S M C 增殖。本实验以培养的 V S M C 为研究对象，发现缺氧复氧后V S M C 增殖增多，说明缺氧 复氧有诱导V S M C 增殖的作用。 尽管在血管重构中很强调细胞增殖的作用，但细胞增殖与 凋亡的失衡可能是决定性因素。受损的平滑肌细胞内胰岛素 样生长因子- I ( I G F I ) 及其结合蛋白表达水平大大提高，这些局 部高表达的I G F I 能够促进平滑肌细胞增生B 。另有研究表 明，I G F I 能有效抑制V S M C 的
9、凋亡o 。在鼠的心肌缺血再灌 注损伤模型中发现I G F I 能够通过影响b c l x l 和b a x 的表达发 挥抗细胞凋亡的作用H 。有学者研究表明缺血0 5h 进行再 灌注后平滑肌b c l - 2 阳性细胞明显高于b a x 阳性细胞。基因 家族成员调节的促凋亡和抑凋亡信号之间的失衡影响了细胞 的变化，最突出的就是b c l 2 家族。研究表明，b c l 2 与b a x 同为 b c l - 2 家族的基因调控系统，b a x 基因与b c l 一2 基因有4 0 同 源”，b c l - 2 具有抑制细胞凋亡作用、b a x 具有促进细胞凋亡作 用；b c l - 2 家族成
10、员自身或相互结成二聚体多聚体，以蛋白一蛋 万方数据 趔慧笠煞氢塞氢l ：f 垩退皿绁塑增堕皇塑圭鲤暨喧垦堡麦丝王亟筮2 坦 白相互作用的方式调节细胞存活或凋亡，b e l 2 b a x 的比率决定 在凋亡信号刺激后细胞是存活还是死亡哺1 ，b c l - 2 蛋白过量表 达致b a x b c l - 2 蛋白比值下降则抑制凋亡使细胞存活，反之b a x 蛋白过量表达最终使细胞死亡。本实验检测了凋亡相关基因 b c l - 2 与b a x 蛋白的表达，结果显示模型组较对照组比较b c l - 2 蛋白阳性率明显升高，b a x 的蛋白阳性率则显著降低，b c l - 2 b a x 比值比
11、对照组显著升高，这与实验中V S M C 凋亡的测定结果一 致。说明缺氧复氧可以通过b c l - 2 b a x 途径影响V S M C 凋亡， 但缺氧复氧影响该途径的确切机制还需进一步研究。 3 2 蝎毒对缺氧复氧V S M C 增殖的影响影响V S M C 增殖的 因素，包括生长刺激性因素如内皮素( E T ) 、血小板衍生生长 子( P D G F ) 和生长抑制因子如一氧化氮( N O ) 、降钙素基因棚关 肽( C G R P ) 等。其中P D G F 是促V S M C 增殖的生长因子中最重 要的、最有力的促有丝分裂原，具有明显趋化性，可促进V S M C 增殖及向内膜下迁移等
12、。 V S M C 包含对许多配体有高度亲和力的特殊受体，这些配 体包括L D L 、胰岛素以及生长刺激因子如P D G F 和生长抑制因 子如T G F l 3 “ J 。当血流动力学发生变化、血管活性物质改变，血 管损伤部位的细胞释放过多的炎性介质和细胞因子等，这些因 素都可促使V S M C 从收缩表型转化为合成表型，合成型平滑肌 细胞可以从血管中膜迁移到内膜，在内膜进行大量增殖，同时 还可以合成和分泌各种细胞因子，产生和分泌大量细胞外基 质，造成血管重构。 有报道【8 1 较低浓度的蝎毒即可使血小板聚集曲线明显下 降，表明了对血小板聚集的抑制作用。血小板是机体凝血过程 中不可缺少的血细
13、胞成分，在其颗粒中含有或摄取着P D G F 、 F G F 、E G F 以及T G F l 3 “ J ，当血小板暴露于某些基质后可诱发血 小板黏附、聚集和脱颗粒，释放的各种生长因子可引起血管壁 内细胞增生反应。蝎毒可以促进内皮细胞分泌N O 、前列环素 I ：( P G I ：) 增加一，P G I ：由血管内皮细胞和平滑肌细胞产生，不 仅具有扩张血管，而且具有抑制平滑肌细胞增殖的作用D O 。 本实验给予蝎毒干预后，观察到细胞增殖受到一定程度的抑 制，考虑蝎毒可能通过对血小板聚集的抑制作用，影响血小板 对各种生长因子的释放从而影响V S M C 的增殖，另外还可能通 过影响V S M
14、CP G I ：的产生及分泌来抑制细胞增殖。 3 3 蝎毒对缺氧复氧后V S M C 凋亡的影响F u k u o 等o 发 现，气囊损伤和致动脉粥样硬化饮食可使大鼠V S M C 因释放高 水平的N O 导致自身凋亡。蝎毒含有多种生物活性，蝎毒活性 多肽有促进内皮细胞N O 分泌增加的作用。N O 是诱导细胞 凋亡的重要途径之一。N O 可以通过氧化应激反应与超氧化物 阴离子o f 生成过氧化亚硝酸阴离子( O N O O 一) 。O N 0 0 一能氧 化损伤蛋白质、脂类和核酸，也能氧化巯基，并可使蛋白质中的 酪氨酸残基硝基化，进而破坏线粒体膜完整性；还能诱导线粒 体膜上离子通道的开发，使
15、线粒体膜除极化和肿胀甚至破损而 释放内容物；O N O O 一还可使超氧化物歧化酶( S O D ) 的酪氨酸 残基亚硝酸化，从而引起细胞凋亡。通过b c l 家族成员的作用 以及c a s p a s e 通过级联放大作用而导致细胞内蛋白的裂解及 D N A 的断裂，也是N O 诱导凋亡的重要途径。本实验观察到蝎 毒可以诱导缺氧复氧后V S M C 凋亡，考虑蝎毒可能通过促进 2 9 3 V S M CN O 分泌增加，经N O 途径诱导细胞凋亡。 通过促进细胞凋亡作用可以达到对抗V S M C 病理性增殖 的目的。事实上，临床上一些用于抗血管重构的药物，至少部 分是通过促进V S M C
16、凋亡而起作用的，如L 型钙离子通道阻断 剂氨氯地平等”。体内一些促进V S M C 增殖的因素，如o x - L D L 、血管紧张素I I 、E T 等血管活性多肽也有明显促进V S M C 凋亡的作用，但介导机制不同。这提示在今后寻求药物作用靶 点时，在阻断某因素促进细胞增殖作用时，力求避免阻断其促 凋亡作用。本实验发现蝎毒在抑制V S M C 增殖的同时，也有促 进细胞凋亡的作用，故此，研究蝎毒对细胞增殖和凋亡的影响 并进一步明确其中机制对治疗心血管系统疾病有着深远意义。 总之，本实验检测了蝎毒对V S M C 缺氧复氧后凋亡相关基 因b c l - 2 、b a x 的表达，从分子机制
17、研究提示，蝎毒通过下调凋亡 抑制基因b c l - 2 的表达，上调凋亡促进基因b a x 的表达，进而降 低b c l - 2 b a x 比率，促进细胞发生凋亡。蝎毒对b c l - 2 、b a x 表达 的调控可能是它发挥缺氧复氧损伤后对V S M C 保护作用的重 要机制，但蝎毒影响缺氧复氧时b c l - 2 家族蛋白表达的上游信 号转导途径目前还不清楚，仍有待研究。 4 参考文献 1 赵佐庆大鼠提睾肌缺血再灌注损伤时血管平滑肌细胞和内皮细 胞的增殖与凋亡 J 中国微循环，2 0 0 2 ；6 ( 1 ) ：2 9 - 3 1 2 B a y e s G e n i sA ，C o
18、 n o v e rC A ，S c h w a r t zR S T h ei n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r a x i s ：Ar e v i e wo fa t h e r o s c l e r a s i sa n dr e s t e n o s i s J C i r eR e s ，2 0 0 0 ；8 6 ( 2 ) ：1 2 5 3 0 3O k u r aY ，B r i n kM ，Z a h i dA A ，e ta 1 D e c r e a s e de x p r e s s i o no fi n s
19、u l i n - l i k e g r o w t hf a c t o r - Ia n da p o p t o s i so fv a s c u l a rs m o o t hm u B c l ec e i l si nh u m a n a t h e r o s c l e r o t i ep l a q u e J JM o lC e l lC a r d ，2 0 0 1 ；3 3 ：1 7 7 7 - 8 9 4Y a m a m u r aT ，O t a n iH ，N a k a oY ，e ta LI G F - Id i f f e r e n t i a
20、 l l yr e g u l a t e sB c l x La n dB a xa n dc o n f e r $ m y o c a r d i a lp r o t e c t i o ni nt h er a th e a r t ( J A mJ P h y s i o lH e a r tC i r eP h y s i o l ，2 0 0 1 ；2 8 0 ( 3 ) ：H I1 9 1 - 2 0 0 s S o n gW L uX 。F e n gQ T u m o rn e c r o s i sf a c t o r ai n d u c e sa p o p t
21、o s i sv i ai n d u c i b l en i t r i t eo x i d es y n t h a s ei nn e o n a t a lm o u s ec a d i o m y o c y t e s J C a r - d i o v a s eR e s ，2 0 0 0 ；4 5 ( 3 ) ：5 9 5 6 C a m p b e l lJ H ，C a m p b e l lG R C u l t u r et e c h n i q u e sa n dt h e i ra p p l i c a t i o n st o s t u d i e
22、 s o fv a s c u l a rs m o o t hn l u s c l e J C l i nS C i ，1 9 9 3 ；8 5 ：5 0 1 - 3 7 陈灏珠心脏病学 M 第5 版北京：人民卫生出版社，2 0 0 0 ：1 0 0 1 - 6 8 杨嘉琳，董伟华，郑洁丽等蝎毒和蝎毒多肽对家兔血小板聚集的 影响( J 中华生物医学工程杂志，2 0 0 3 ；9 ( 3 ) ：2 8 3 - 4 9 宋益民，许兰芝，李学坤，等蝎毒活性肽对内皮细胞释放P G l 2 和 N O 的影响( J 中国临床药理学与治疗学，2 0 0 1 ；6 ( 4 ) ：3 5 0 - 2 1
23、0P a p a p e t r e p o u l o sA ，R u d i cR D ，S c s s aW C M o l e c u l a rc o n t r o lo fn i t r i co x i d es y n t h e s e s i n t h ec a r d i o v a s c u l a rs y s t e m ( J j C a r d i o v a s cR e s ，1 9 9 9 ；4 3 ( 3 ) ：5 0 9 - 2 0 1 1F u k u oK 。H a t sS 。S u h a r aT ，e ta LN i t r i co
24、 x i d ei n d u c e su p r e g u l a t i o no f F a sa n da p o p t o s i si nv a s c u l a rs m o o t hm u g d e J H y p e r t e n s i o n ，1 9 9 6 ； 2 7 ：8 2 3 - 6 1 2S t e a dS ，W e r s t r u kE S ，L e eK W N i f e d i p i n ei n d u c e sa p o p t o s i si nc u l t u r e d v a s c u l a rs m o o t hm u s c l ec e i l sf r o ms p o n t a n e o u s l yh y p e r t e n s i v er a t s J L i f eS c i 。2 0 0 0 ：6 7 ：8 9 5 - 9 0 6 2 0 0 8 - 0 2 1 7 收稿 ( 编辑 2 0 0 8 4 2 4 - 0 3 修回 胡国义) 万方数据