GB-4789.10-1994.pdf

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1、中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 金 黄 色 葡 萄 球 菌 检 验 Mi c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f f o o d h y g i e n e E x a mi n a t i o n o f S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s G B 4 7 8 9 . 1 0 一 9 4 代替 G B 4 7 8 9 . 1 0 -8 4 1 主皿内容与适用范圈 本标准规定了食品中金黄色葡萄球菌的检验方法。 本标准适用于食品和食物中毒

2、样品中金黄色葡萄球菌的检验。 2 引用标准 G B 4 7 8 9 . 2 8 食品卫生微生物学检验 染色法、 培养基和试剂 3 设备和材料 3 . 1 显微镜。 3 . 2 温箱: 3 6 士1 0C . 3 . 3 离心机。 3 . 4 灭菌吸管: 1 m L , 1 0 m L . 3 . 5 灭菌试管。 36 灭菌平皿。 3 . 了 均质器。 3 . 8 载玻片。 3 . 9 L 型涂布棒。 3 . 1 0 酒精灯。 3 . 1 ， 接种环。 4 培养羞和试荆 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 胰酪膝大豆肉汤: 按G B 4 7 8 9

3、 . 2 8 中4 . 5 9 规定。 7 . 5 % 抓化钠肉汤: 按G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 6 1 规定。 血琼脂平板: 按G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 6 规定。 B a i r d - P a r k e r 琼脂平板: 按G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 6 0 规定。 肉浸液肉汤: 按G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 1 规定。 灭菌盐水。 兔血浆: 按G B 4 7 8 9 . 2 8中4 . 6 3 规定。 中华人民共和国卫生部1 9 9 4 一 0 3 一 1 8 批准 1 9 9 4 一 0 9 一 0 1 实施

4、 G B 4 7 8 9 . 1 0 一 9 4 5 检验程序 金黄色葡萄球菌检验程序如下: 6 操作步骏 6 . 1 增菌培养法 6 . 1 . 1 检样处理 称取2 5 g 固 体样品; 吸取2 5 m L液体样品， 加人2 2 5 m l 灭菌生理盐水， 固 体样品 研磨或置均质器 中制成混悬液。 6 . 1 . 2 增菌及分离培养 吸取5 m L上述混悬液， 接种于7 . 5 %氯化钠肉汤或胰酪陈大豆肉汤 5 0 m L培养基内， 置 3 6 士I C 温箱培养2 4 h ， 转种血平板和B a i r d - P a r k e r 平板， 3 6 士1 培养2 4 h ， 挑取金黄

5、色葡萄球菌菌落进行革兰 氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 6 . 1 . 3 形态 本菌为革兰氏阳性球菌， 排列是葡萄球状， 无芽胞， 无英膜， 致病性葡萄球菌菌体较小， 直径约为0 . 5 -1 / A M. 6 . 1 . 4 在肉汤中呈混浊生长， 在胰酪脉大豆肉汤内有时液体橙清， 菌量多时呈混浊生长， 血平板上菌落 呈金黄色， 也有时为白色， 大而突起、 回 形、 不透明、 表面光滑， 周围有溶血圈。 在B a i r d - P a r k e : 平板上为 圆形、 光滑凸起、 湿润、 直径为2 -3 m m, 颜色呈灰色到黑色， 边缘为淡色， 周围为一混浊带， 在其外层有 一透明圈。用接

6、种针接触菌落似有奶油树胶的硬度， 偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落， 但无混浊带及 透明圈。 长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比 典型菌落所产生的黑色较淡些， 外观可能粗糙并 6 . 1 . 5 血浆凝固酶试验 G B 4 7 8 9 . 1 0 一 4 吸取1 - 4 新鲜兔血浆0 . 5 m L ， 放人小试管中， 再加入培养2 4 h 的金黄色葡萄球菌肉 浸液肉 汤培 养物0 . 5 m L ， 振荡摇匀， 放3 6 士1 0C 温箱或水浴内， 每半小时观察一次， 观察6 h ， 如呈现凝固， 即将试管 倾斜或倒置时， 呈现凝块者， 被认为阳 性结果。同时以已 知阳性和阴 性葡萄球菌

7、株及肉 汤作为对照。 6 . 2 直接计数方法 6 . 2 . ， 吸取上述1 : 1 0 混悬液， 进行十倍递次稀释， 根据样品污染情况， 选择不同浓度的稀释液1 m L , 分别加入三块B a i r d - P a r k e r 平板， 每个平板接种量分别为。 . 3 m L , O . 3 m L , O . 4 m L , 然后用灭菌L棒涂 布整个平板。 如水分不多吸收， 可将平板放在3 6 士1 C 温箱1 h , 等水分蒸发后反转平皿置3 6 士I C 温箱 培养。 6 . 2 . 2 在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落， 并从中任选5 个菌落， 分别接种血平板， 3 6

8、士1 0C 2 4 h 培养后进行染色镜检、 血浆握固醉试验， 步骤同增菌培养法。 6 . 2 . 3 菌落计数: 将三个平板中 疑似金黄色有萄球菌黑色菌落数相加， 乘以血浆凝固酶阳性数， 除以 5 ， 再乘以稀释倍数， 即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。 G B 4 7 8 9 . 1 0 一 9 4 附录A 翻萄球，肠弃索检验 ( 参考件) A 1 设备和材科 A l . 1 均质器. A 1 . 2 冰箱。 A 1 . 3 离心机。 A 1 . 4 分液诵斗。 A 1 . 5 透析袋。 A 1 . 6 振荡培养箱或普通温箱: 3 6 士1 0C , A 1 . 7 灭菌吸管: 1 m

9、L , 1 0 m L . A 1 . 8 电 线。 A l . 9 载玻片。 A l . 1 0 三角瓶: 2 5 0 m L , A l . 1 1 直径 1 5 0 m m大平皿( 或带盖搪瓷盘) 。 A l . 1 2 玻璃纸。 A l . 1 3 镊子。 A l . 1 4 三角棒。 A l . 1 5 直径 2 . 5 mm打孔器。 A l . 1 6 有机玻璃模板。 A l . 1 7 橡皮圈。 A l . 1 8 细滴管。 A l . 1 9 层析柱: 4 0 m m X 2 0 -2 5 m m, A 1 . 2 0 酶标测定器。 A 1 . 2 1 洗瓶。 A 1 . 2

10、2 微量加样器: 2 0 0 m L , 5 0 m L , A 2 培养基和试荆 A 2， 肠毒素产毒培养基: 按G B 4 7 8 9 . 2 8 中4 . 8 7 规定。 A 2 . 2 营养琼脂。 A 2 . 3 1 %琼脂箱( 0 . 9 %生理盐水配制) 溶液。 A 2 . 4 0 . 2 m o l / L p H 7 . 5 碑酸盐缓冲液。 A 2 . 5 三氯甲烷。 A 2 . 6 6 m o l / L 盐酸溶液。 A 2 . 7 5 m o l / L氢氧化钠。 A 2 . 8 生理盐水。 A 2 . 9 1 %乙酸溶液。 A 2 . 1 0 0 . 1 %唾04红R或氨

11、基黑B , A 2 . ” 硅胶或凡士林。 A 2 . 1 2 A , B , C , D型葡萄球菌肠毒素和抗血清。 4 82 G B 4 7 8 9 . 1 0 一 9 4 A 2 . 1 3 竣甲 基纤维素( C M2 2 或C M1 1 Wh a t m a n ) , A 2 . 1 4 0 . 0 0 8 m o l / L p H 5 . 6 磷酸盐缓冲液。 A 2 . 1 5 0 . 0 0 8 m o l / L p H 6 . 8 磷酸盐缓冲液。 A 2 . 1 6 酶标记A , B , C , D肠毒素抗血清或酶联免疫试剂盒。 A 2 . 1 7 0 . 1 m o l /

12、 L p H 9 . 5 碳酸盐缓冲液。 A 2 . 1 8 0 . 0 5 %0 . 0 2 m o l / L p H7 . 2吐温- 2 0 缓冲液。 A 2 . 1 9 邻苯二胺酶底物。 A 2 . 2 0 2 m o l / L硫酸。 A 3 检验程序 A 3 . 1 从菌株中检测肠毒素 从菌株中检测肠毒素程序见图A1 : 菌株 营养琼脂斜面3 6 士1 C. 1 8 -2 4 h 用盐水洗下菌苔， 放入产奄培养基 团体培养法 3 6 士1 C 温箱4 8 h 液体培养法 3 6 士1 C 振荡培养4 8 h 8 0 0 0 r /m i n 离心2 0 m i n 取上清液， 加热

13、 1 0 0 C 1 0 m i n 8 0 0 0 r /min 离心l o - , 浓缩 双相琼脂扩敬: 徽玻片法或玻片法检侧肠毒素 报么 图 A1 A 3 . 2 从食物检样中提取和检测肠毒素 A l 2 . 1 微玻片法检测肠毒素( 浓缩法层析法) 程序见图A 2 : G B 4 7 8 9 . 1 0 一9 4 固体位样1 0 0 g 加入0 . 2 m o l /L p H 7 . 5 礴酸盆级冲液1 0 0 . L , 4 C 浸泡1 8 - - 2 4 h , 液体梭样直接吸取1 0 0 m L 固体检样用纱布过诊 滚体检样 离心B O O O r /m i n 2 0 n u

14、 n 取上清液 固 体 检样: 离心 8 0 0 0 r / m i n 2 0 m i n 取 上清 液 加入三抓甲烷1 0 -1 5 m L , 振荡l o . , . , 静里， 弃去三扳甲烷 加入6 m o l /L 盆酸溶液调p H 至4 . 5 , 8 0 0 0 r /m i n 2 0 m in , 取上清液 加入5 m o l /L 氢级化钠溶液， 调p H 至7 . 5 . 8 0 0 0 r /min 2 0 m i n 取上清液， 放入透析带内， 放多获乙二醉 或用电风扇吹干， 浓绪到1 -2 .L 用徽玻片法检洲肠琢盆 用燕翻水洗下浓编物 报告 浓 绪 法 装入透析带

15、， 以。 . 0 0 8 . . 1 /L P H 5 . 6 碑酸盐毅冲液平衡 过C M层析柱( 流速1 -2 m L /m i n ) 用。 . 0 0 8 . . 1 /L P H 5 . 6 礴酸盐级冲液约1 0 0 m L 洗脱 用。 . 2 m o l /L P H 6 . 8 礴酸盐级冲液洗脱出肠奋众 用徽玻片法检侧肠毒素 报告 图 A2 层析法 A 3 . 2 . 2 酶联免疫法检测肠毒素程序见图A 3 4 8 4 G B 4 7 8 9 . 1 0 一 9 4 用。 . l m o l /L p H 9 . 5 碳酸盐缓冲液稀释血清， 加入苯乙始凹孔板。 . 2 . L ,

16、3 6 士1 C 3 0 m i n 弃去上液， 用。 . 0 5 %0 . 0 2 m o l /L p H7 . 2 吐温一2 0 级冲液洗涤5 次 液体 位样直 接加入板 孔。 . 2 m L ; 固 体检 样1 0 0 g + 1 0 0 . L 0 . 2 m o l /L p H7 . 5 碑酸盐缓冲液， 均质后取连液0 . 2 mL , 3 6 士1 C 3 0 mi n 弃去上液， 用0 . 0 5 %0 . 0 2 m o l /L p H 7 . 2 吐温一2 0 缓冲液洗涤5 次 加入醉抗体0 . 2 m L , 3 6 士1 C 3 0 m i n 弃去上液， 用。 .

17、 0 5 %0 . 0 2 m o 1 /L p H 7 . 2 吐温一2 0 级冲液洗涤5 次 加入邻苯二胺醉底物0 . 2 . 1 - , 登室温3 0 m m 加入Z m o l /L 硫酸。 . 0 5 m L ， 立即比色 报告 图 A3 A 4 肠弃素检测 A 4 . 1 从菌株中提取肠毒素方法 A 4 . 1 . 1 液体透析培养法: 用宽2 . 5 c m 、 长8 0 c m的透析袋装入6 0 m L产毒培养基， 两端扎紧， 将透析 袋装入2 5 0 m L三角瓶内， 加入1 5 m L灭菌生理盐水， 透析袋两端留在瓶口， 用棉塞塞好， 1 2 1 C 高压灭 菌3 0 m

18、i n ， 待测的菌株接种营养琼脂斜面( 试管1 8 m mX1 8 0 m m) , 3 7 0C 培养2 4 h ， 用生理盐水5 m L洗 下菌落， 倾入上述培养瓶中， 每个菌种种一瓶， 3 7 振荡培养4 8 h ， 振速为1 0 。 次/ m i n 。吸出菌液离心， 8 0 0 0 r / m i n 3 0 m i n ， 取上清液做双相琼脂扩散， 如为阴 性， 再装人透析袋内， 用电风扇吹， 或用多聚乙二 醉， 浓缩至1 - 2 m L ， 再做琼脂扩散。 A 4 . 1 . 2 固体透析培养法: 向直径 1 5 0 m m的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾入灭菌产毒培养基约1 0 0

19、 - 1 2 0 m L , 凝固后表面铺一灭菌玻璃纸， 待测菌株接种在营养琼脂上， 3 7 培养2 4 h ， 用约3 m L灭菌盐水 洗下菌苔， 倾在玻璃纸上， 用灭菌三角棒涂满平皿， 3 7 培养4 8 h ， 加入1 0 2 0 m L 灭菌生理盐水， 用灭 菌三角棒刮取菌苔， 吸取菌液离心， 以下步骤同液体透析培养法。 A 4 . 2 从食品中提取肠毒素方法 A 4 . 2 . 1 直接浓缩法: 取食品样品1 0 0 s ， 加入无菌。 . 2 m o l / L p H 7 . 5 磷酸盐缓冲液， 均质成匀浆， 置 4 C 浸泡1 8 2 4 h ， 用纱布过滤将滤液离心8 0 0

20、 0 r / m i n 2 0 m i n ， 取上清液， 放入分液漏斗中， 加人1 0 m L 三氯甲烷， 振摇 1 0 m i n , 静置， 将底层三氯甲烷弃去( 如不分层， 可8 0 0 0 r / m i n离心2 0 m i n ) 。加入 6 m o l / L 盐酸溶液调p H至4 . 5 , 8 0 0 0 r / m i n 离心2 0 m i n ， 取上液， 加5 m o l / L氢氧化钠溶液， 调p H至 7 . 5 ， 离心取上清液， 装入透析袋或玻瑞纸， 用电扇吹干， 或放多聚乙二醉上浓缩至1 - 2 m L ， 做微玻片双 G B 4 7 8 9 . 1 0

21、 一 9 4 向琼脂扩散。 A 4 . 2 . 2 层析法: 如需提取较纯肠毒素， 可将上述浓缩液用蒸馏水洗下， 装入透析袋， 以0 . 0 0 8 m o l / L p H 5 . 6 磷酸盐缓冲液平衡， 加入C M层析柱内， 流速 1 - 2 m L / m i n ， 用。 . 0 0 8 m o l / L p H 5 . 6 磷酸盐缓冲 液洗脱， 再用0 . 2 m o l / L p H 6 . 8 磷酸盐缓冲液洗脱出 肠毒素。 洗脱液装入透析袋内， 用电扇或多聚乙二 醇浓缩至1 m L ， 做微玻片双向琼脂扩散， 检测肠毒素。 A 4 . 3 双向琼脂扩散检测肠毒素 A 4 .

22、 3 . 1 微玻片法: 将在9 5 %乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦干， 吸取溶化的。 . 2 % 琼脂糖( 蒸馏水配 制) 滴在载玻片上， 使剩余的琼脂糖流下， 放无尘的环境中干燥， 先将一层薄塑料板放在载玻片上， 然后 将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林， 放在塑料板上， 两边用橡皮圈系紧固定， 吸取 1 % 琼脂糖， 立即从模板中间孔加入载玻片和模板之间， 直至充满琼脂糖， 凝固后再将孔中 琼脂糖用注射 器针头挑去， 在中间孔滴加抗血清， 四周滴加菌株产毒液或食品提取液， 放入加有湿棉球的容器内， 放 2 5 3 0 “C l 8 -2 4 h 观察结果。 可在灯光上， 并对

23、着暗的背景观察， 在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀 线。如沉淀线只能微弱可见时， 可进行染色。 A 4 . 3 . 2 玻片法: 吸取溶化的1 %琼脂糖2 . 5 m L , 铺在洁净载玻片上， 凝固后用直径2 . 5 m m的金属打 孔器打成幅射型， 孔距为2 . 5 m m， 中心孔加入肠毒素抗血清， 周围六个孔加入菌株或食品的肠毒素提 取液， 放入有滴加2 八0 0 0 0 三氮化钠湿棉球的容器内， 以保持湿度。 置2 5 3 0 “C 1 8 2 0 h ， 观察结果， 在 抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。 A 4 . 3 . 3 染色法: 用徽玻片法取下胶带和有机玻璃模板，

24、玻片法可直接将玻片放入蒸馏水中浸泡4 - 8 h ， 中间换2 -3 次水， 在下述各液中浸1 0 m i n , 1 0 %乙酸中含1 %唾啼红R ( 或氨基黑) ; 1 %乙酸八%乙 酸含1 %甘油， 如脱色不净， 可继续浸泡。取出后盖一滤纸， 吸去多余液体， 在室温或3 5 C 烘干。阳性者 沉淀被染料颜色， 可长期保存。 对照肠毒萦 对照肠毒欢 被 霍 样 抗 血清 被 检 样 被 役 样 厂 抗血清 、 被检样 被检祥 被 检 样 图 A4 A 一被检样无肠毒素， 为阴性; B 一被检样3 . 5 含肠毒素， 为阳性; 4 无肠毒素， 为阴性 A 4 . 4 酶联免疫法检测肠毒素(

25、双抗体法) A 4 . 4 . 1 包被抗体: 用。 . 1 m o l / L p H 9 . 5 碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5 p g / m L ， 加人洗净的 苯乙烯凹孔板内， 每孔。 . 2 m L ， 置3 6 土1 0C 3 0 m i n ， 弃去上液。 A 4 . 4 . 2 洗涤: 用0 . 0 5 % 0 . 0 2 m o l / L p H 7 . 2 吐温- 2 0 缓冲液洗涤5 次。 A 4 . 4 - 3 加入检样: 如为液体， 可直接加入0 . 2 m L , 固体样品取 1 0 0 g ， 加入0 . 2 m o l / L P H 7 . 5 磷酸盐

26、 缓冲液1 0 0 m L ， 均质后取过滤液。 . 2 m L , A 4 - 4 - 4 洗涤: 同A4 . 4 . 2 . A 4 . 4 . 5 每孔内 加人酶抗体。 . 2 m L , 置3 6 士1 0C 3 0 m i n ， 同时做阳 性和阴 性对照。弃去上液。 A 4 . 4 . 6 洗涤: 同A 4 . 4 . 2 , A 4 - 4 - 7 每孔内加人邻苯二胺酶底物溶液0 . 2 m L , 室温放置3 0 m i n . G B 4 7 8 9 . 1 0 一 9 4 4 . 8 每孔内加人 2 m o l / L硫酸。 . 0 5 m L ， 立即放酶标仪比色。 4

27、. 9 结果判定: 样品O D值比阴性对照， 比值大于 2 为阳性， 小于 2为阴性。 A4A4 附加说明: 本标准由卫生部卫生监督司提出。 本标准由北京市卫生防疫站负责起草。 本标准主要起草人刘以贤。 本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/