GB-T 4789.34-2003.pdf

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1、GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 前言 本标准的附录A、 附录 B是规范性附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位: 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、 北京市卫生防疫站。 本标准主要起草人: 杨宝兰、 冉陆、 李志刚、 王淑真、 杨大进、 贾珍珍。 GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 双 歧 杆 菌 检 验 范围 本标准规定了双歧杆菌的检验方法。 本标准适用于食品中双歧杆菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，

2、 随后所有的 修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 食品卫牛微生物学检验染色法、 培养基和试剂 术 语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3 . 1 双歧杆菌B i f i d o b a c t e r i u m 一群能分解葡萄糖， 产生大量乙酸和乳酸， 厌氧， 不耐酸， 不形成芽胞， 不运动， 细胞呈现多样形态的 革兰氏阳性杆菌。 3 . 2 双歧杆菌菌落计数 e n u m e r

3、 a t io n o f B i f i d o b a c t e r i u m 在一定条件培养后， 所得1 m 以g ) 检样中所含双歧杆菌菌落数。 4 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 4 . 设备和材料 1 恒温培养箱: 3 6 士1 0 C。 2 恒温水浴锅: 4 6 士1 C。 3 显微镜: l o x一1 0 0 X o 4 厌氧培养装置: 厌氧罐、 厌氧箱。 5 离心机: 3 0 0 0 r / mi n , 6 气相色谱仪: ( 具有氢火焰检测器 F I D ) . 7 架盘药物天平: 。g -5 0 0 g ， 精度。 . 5 g

4、, 8 灭菌吸管: 1 ML ( 具 0 . 0 1 刻度) , 1 0 mL ( 具 0 . 1 刻度) 。 9 灭菌平皿 : 直径 9 0 m m. 1 0 广口瓶或锥形瓶: 3 0 0 mL , 5 0 0 mL . 5 培养基和试剂 5 . 1 0 . 8 5 %灭菌生理盐水。 5 . 2 T P Y琼脂培养基 : 见第 A. 3 章。 5 . 3 B I琼脂培养基: 见第 A. 2章。 GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 5 . 4 B B L琼脂培养基: 见第 A . 1 章 5 . 5 双歧杆菌生化用基础培养基: 见第 A . 4 章。 5 . 6 P Y

5、 G液体培养基: 见第 A. 5 章。 5 . 7 革兰氏染色液: 按GB / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中2 . 2 规定。 5 . 8 灭菌液体石蜡 5 ， 9 甲醇: 分析纯 5 . 1 0 三氯甲烷: 分析纯。 5 . 1 1 硫酸: 分析纯。 5 . 1 2 冰乙酸: 分析纯。 5 . 1 3 乳酸: 分析纯。 5 . 1 4 乙酸标准溶液: 吸取分析纯冰乙酸 5 . 7 mL ， 移人 1 0 0 m l 一 容量瓶中. 加水至刻度， 标定， 标定方法 见附录 B ， 此溶液浓度约为 1 m o t / L . 5 . 1 5 乙酸标准使用液: 将经标定的乙酸

6、标准溶液用水稀释至 。 . 0 1 -0 1 / 1 - 5 . 1 6 乳酸标准溶液: 吸取分析纯乳酸 8 . 4 m工 ， 移人 1 0 0 m l ， 容量瓶中， 加水至刻度， 标定， 标定方法见 附录B， 此溶液浓度约为 1 m o l / L 5 . 1 7 乳酸标准使用液: 将经标定的乳酸标准溶液用水稀释至 0 . 0 1 mo t/ l _ 6检验程序 检验程序见图 分 纯革兰氏染色， 过氧化氢阵试验 菌 落 计 数 报 告 接 种 w e庆 氧 培 养 A7 C 7 2h 测 定 乙酸 、乳 酸 菌 种 鉴 定 报 告 图1 操作步骤 7 . 1 以无菌操作将充分棍匀的检样 2

7、 5 g ( mL ) 放人含有 2 2 5 m L灭菌生理盐水的灭菌锥形瓶内作成 GB/ T4 7 8 9 34 一2 0 0 3 1， 1 。 的均匀稀释液 7 . 2 用 lm L灭菌吸管吸取 1， 10稀释液 lm 工， 沿管壁徐徐注人含有 gm l灭菌生理盐水的试管内， 振摇混匀， 做成 1 10。的稀释液。 7 . 3 另取l m l 一 灭菌吸管， 按上述操作顺序， 作 10倍递增稀释液， 如此每递增一次， 即换用 1 支l m L 灭菌 吸管。 7 . 4 选择 2 个一3个以上适宜稀释度， 分别在作 10 倍递增稀释的同时， 各取 。 . 1，试 分别加人计数培 养基平皿，

8、均匀涂布， 每个稀释度作两个平皿。最好同时选用 2种一3种培养基( B 工 、 B I3I 、 r P Y培养 基)， 同时作灭菌生理盐水空白对照。 7 . 5 待琼脂表面干后， 翻转平皿 ， 放至厌氧罐内. 操作全过程须在2 Omln内完成 7 . 6 将厌养罐置 36士1 温箱内培养 72 h 士3h ， 观察双歧杆菌菌落特征见表 1 。选取菌落数在3 。 30。 之间的平板对可疑菌落进行计数， 随机挑取五个可疑菌落进行革兰氏染色、 显微镜检查和过氧化氢 酶试验过氧化氢酶阴性， 革兰氏染色阳性、 无芽胞、 着色不均匀、 出现“ Y， 或“ V” 型的分叉状、 或棒状 等多形态的杆菌可定为双

9、歧杆菌。 表 1 双歧杆菌在不同培养基上菌落生长形态特征 培 养 基 双歧杆菌特征 BI 培养基为黄色菌落中等大小， 表面光亮， 边缘整齐呈瓷白色、 奶油色， 质地柔软、 细腻 B B I， 培养基为黄色 菌落中等大小， 表面光滑、 凸起， 边缘整齐呈奶油色， 质地柔软、 细腻 TP Y培养基为黄色 菌落表面光滑， 凸起， 边缘整齐呈奶油色、 瓷白色， 质地柔软、 细腻 7 . 7 菌落计数: 根据证实为双歧杆菌的菌落数， 计算出平皿内的双歧杆菌数， 然后乘以样品的稀释倍 数， 得每毫升样品中双歧杆菌数。取三种培养基中计数最高的为最终结果例如， 检样 1 只104 倍的稀 释液在 B BI 琼

10、脂平板上， 生成的可疑菌落为 35 个， 取5 个鉴定， 证实为双歧杆菌的是 4个， 则 l ml样 品中双歧杆菌数为: 1 0义3 5义4 / sxl o 咭= 2 . SXI O 6 8双歧杆菌菌种鉴定 8 . 1 生化试验 8 . 1 门菌种制备: 自平板上挑取菌落， 接种于B L 、 B B L或 T P Y琼脂平板 匕， 放至厌氧罐内， 于 3 6 士 1 、 72 h 士3h 厌氧培养。刮取菌苔， 制备菌悬液， 浓度为 109 cfu / mL 一10， ， c f u/m L， 分别进行试验。 8 . 1 . 2 生化鉴定试验: 双歧杆菌一般不还原硝酸盐( 但当培养基有溶解的红细

11、胞时， 可以还原硝酸盐) ， 不产靛基质和硫化氢。常用双歧杆菌的碳水化合物反应见表2 。 表 2 双歧杆菌属内种的鉴别要点 常用双歧杆菌 D- 核 糖 L阿拉伯糖 乳 糖 一 纤 维 二 搪松 三 糖棉 子糖山 梨 醇淀粉葡 萄 糖 酸 盐 1 分叉双歧杆菌 ( B. b 7 ) 去 d u 功 )一+ 一 一 一 2长双歧杆菌 ( 万 . l o n g u 朋) 十净卜 一一 l一 l 卜 ! + 一一 ! 3 . 婴儿双歧杆菌 t B. z n 和 n t仁 ) 司 L十- 4 . 短双歧杆菌 ( Bb 理v e) + d l 二 5 . 青春双歧杆菌 ( B . a d o l e s

12、 e n t ， 5 ) -尸+ 一 + 一 ，J il 一 d一卜 注:d 表示有些菌株阳性， 有些菌株阴性 G B/ T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 8 . 2 气相色谱法分析双歧杆菌的有机酸代谢产物 自平板上挑取菌落， 接种于 P Y G液体培养基， 厌氧 3 6 士1 0C, 7 2 h 士3h 培养， 取除菌上清液分析 双歧杆菌的有机酸代谢产物。双歧杆菌分解葡萄糖， 生成乙酸和乳酸， 形成比约3: 2 。样品经酸化、 离 心后 ， 上清液直接进气相色谱仪测定其中的乙酸。样品经硫酸甲醇甲醋化， 以三氯甲烷提取， 取三氯甲 烷层进气相色谱仪测定其中的乳酸。 8 . 2

13、. 1 分析步骤 8 . 2 . 1 . 1 样品处理 8 . 2 . 1 . 1 . 1 乙酸测定: 取除菌上清液 2 m L - - 3 mL ， 加人体积分数为 5 0 %硫酸 0 . 1 mL , 混匀 4 0 0 0 r / m i n 离心 5 mi n ， 吸取上清液分析。 8 . 2 . 1 . 1 . 2 乳酸测定: 取除菌上清液2 mL -3 mL ， 放人 1 0 mL比色管中， 1 0 0 水浴 1 0 mi n ， 加人体积 分数为 5 0 写硫酸0 . 2 m L， 甲醇 1 mL , 5 8 水浴 3 0 mi n 后加水 1 mL ， 加三氯甲烷 0 . 5 M

14、I ， 振摇 3 m i n , 3 0 0 0 r / m i n 离心5 m i n ， 取三氯甲 烷层分析。 8 . 2 . 1 . 2测定 8 . 2 . 1 . 2 . 1 气相色谱仪参考条件 8 . 2 . 1 . 2 . 1 . 1 色谱柱: 内径 3 . 2 mm， 长 2 m的不锈钢柱， 内装涂以3 0 g / L磷酸的6 0目8 0目GD X - 4 0 1 . 8 . 2 . 1 . 2 . 1 . 2 氢火焰检测器( F I D ) : 气化室、 检测器温度: 2 0 0 0C ; 氮气流速: 6 0 mL / mi n ; 氢气流速: 5 5 mL / m i n ;

15、 空气流速: 6 0 0 mL / mi n ; 纸速: 0 . 5 m m/ mi n , 8 . 2 . 1 . 2 . 3 根据保留时间定性， 外标法定量。计算见式( 1 ) : A 曰 、 =: ， : v (1 ) 式 中 : X 样品中有机酸的含量， 单位为微摩尔每毫升( p m o l / mL ) ; A 被测定样液中有机酸的含量， 单位为微摩尔( p m o l ) ; V 样品体积 ， 单位为毫升( mL ) , 结果的表述: 报告平行测定的算术平均值的两位有效数。 8 . 2 . 1 . 2 . 4色谱 图见图 2 . 乙艘乳酸 图2 8 . 2 . 1 . 2 . 5

16、允许差: 相对相差(1 5 %e 8 . 2 . 2 最低检出浓度 乙酸为0 . 6 p m o l / m L ; 乳酸为0 . 8 p m o l / m L , 2 6 9 GB/ T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) 专用培养基及试剂 A . 1 B B L琼脂培养基 A . 1， 成分 蛋白 脉1 5 . 0 g 酵母粉2 . 0 g 葡萄搪2 0 . 0 g 可溶性淀粉。 . 5 9 氯化钠5 . 0 g 5 %半胧氨酸1 0 . 0 mL 西红柿浸出液4 0 0 . 0 mL 吐温- 8 0 1 . 0 mL 肝提取液8 0 . 0 m L

17、琼脂2 0 . 0 g 蒸馏水5 2 0 . 0 mL p H7 . 0 士0 . 1 A. 1 . 2制法 A . 1 . 2 . 1 西红柿浸出液的制备: 将新鲜西红柿洗净称重后切碎， 加等量蒸馏水在 1 0 0 水浴中加热， 时 时搅拌， 约 9 0 mi n , 然后用绒布过滤， 校正 p H 7 . 0 ， 分装锥形瓶， 1 1 5 高压灭菌 1 5 m i n -2 0 mi n . A . 1 . 2 . 2 肝提取液的制备: 称取新鲜猪肝1 0 0 0 g ， 切成小块或绞碎， 加蒸馏水至2 0 0 0 m L , 混匀， 置冰 箱中过夜。第二天煮沸 1 5 mi n -2 0

18、 m i n ， 绒布过滤， 并挤压收集全部滤液， 加水补足原量。分装锥形瓶。 A . 1 . 2 . 3 按A. 1 . 1 成分配制， 校正 p H7 . 0 ， 分装锥形瓶， 1 1 5 C 高压灭菌 1 5 m i n -2 0 m i n , A. 2 BL琼脂培 养基 A. 2 . 1 成 分 蛋白脉 胰陈 植物陈 酵母粉 葡萄糖 可溶性淀粉 牛肉膏 吐温- 8 0 A液 B液 肝提取液 琼脂 5 %半胧氨酸 5 . 0 g 5 . 0 g 3 . 0 g 2 . 0 g 1 0 . 0 g 0 . 5 g 3 . 0 g 1 . 0 mL 1 0 . 0 m L 5 . 0 mL

19、 1 5 0 . 0 mL 2 0 . 0 g 1 0 . 0 m L GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 蒸馏水8 4 0 . 0 mL p H7 . 2 士0 . 1 A. 2 . 2制法 A . 2 . 2 . 1 A液的制备: 称取磷酸二氢钾 1 0 g , 磷酸氢二钾 1 0 g , 加蒸馏水至 1 0 0 mL , 混匀， 1 1 5 高压 灭菌 1 5 m i n -2 0 mi n e A . 2 . 2 . 2 B液的制备: 称取硫酸镁 1 0 g , 硫酸亚铁 。5 g , 氯化钠 0 . 5 g ， 硫酸锰 。 . 3 3 7 g ， 加蒸馏水至

20、2 5 0 mL , 混匀， 1 1 5 0C 高压灭菌 1 5 mi n -2 0 m i n e A . 2 . 2 . 3 按 A. 2 . 1 成分配制， 校正 p H 7 . 2 ， 分装锥形瓶， 1 1 5 , C 高压灭菌 1 5 m i n -2 0 mi n A . 3 T P Y琼脂培养基 A . 3 . 1 成 分 水解酪蛋白1 0 . 0 g 植物陈5 . 0 g 酵 母粉20 g 葡萄糖5 . 0 g 5 %半胧氨酸1 0 _ 0 m1 _ 磷酸氢二钾( K2 HP 0 , ) 2 . 0 g 氯化镁( Mg U l 6 H, 0 ) 0 . 5 g 硫酸锌( Z n

21、 5 0 7 H 0 ) 0 . 2 5 g 氯化钙( C a C l )0 . 1 5 g 氯化铁( F e C l , )微量 吐温- 8 0 1 . 0 ml , 琼脂2 0 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 . 0 mL p H6 . 5 士0 . 1 A. 3 . 2制法 将 A . 3 . 1 成分加热溶解、 校正至 p H6 . 5 士。 . 1 ， 分装锥形瓶， 1 1 5 高压灭菌1 5 m i n -2 0 mi n , A 4 A 4 双歧杆菌生化用基础培养基 1 成 分 蛋 白陈 胰陈 吐温- 8 0 溶液 B L半胧氨酸 1 . 6 0 0 嗅甲酚紫 琼脂 p H7

22、. 2 士0 . 1 1 0 . 0 g 5 . 0 g 1 . 0 m L 5 . 0 m I . 0 . 2 g 1 . 4 m L 1 . 5 g A . 4 . 1 . 1 B液: 称取硫酸镁 1 0 g ， 硫酸亚铁 0 . 0 5 g , 氯化钠 0 . 5 g ， 硫酸锰0 . 3 3 7 g ， 加蒸馏水至2 5 0 mL e A . 4 . 1 . 2 用于糖分解试验的培养基配制: 将基础培养基成分( 除指示剂溶液外) 溶解后， 调 p H至 7 . 2 士0 . 1 ， 再加指示剂溶液糖的种类按 。 . 5 %加人( 七叶昔为 。 . 2 5 0 a ) ， 分装小试管，

23、每管 3 mL , 1 1 5 0C高 压灭菌 2 0 mi n e 生化试验必须设无糖对照管， 每管接种菌悬液 。 . 0 5 mL ， 直接接种到培养基的底部。因双歧杆菌是 GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0 3 专性厌氧， 所以要在培养基上面盖上一层液体石蜡( 0 . 8 ml , ) . 3 7 培养 7 d -1 0 d . A. 4 . 2观察结果 第 4 天和第 1 0 天两次观察糖分解性能。以培养基中的指示剂变色情况判定: 微黄色为士， 部分变 黄者为+， 全部变黄者微透明为+， 全部变黄且菌发育明显呈混浊者为+。 A . 5 P Y G液体培养基 A. 5

24、 . 1 成分 蛋白 陈1 0 . 0 g 葡萄糖2 . 5 9 酵母膏5 . 0 g 盐酸半胧氨酸。 ， 2 5 9 盐溶液2 0 . 0 ml , 维生素 K, 溶液。 . 5 m L 氯化血红素溶液5 m g / m l - 2 . 5 m L 蒸馏水5 0 0 . 0 ml p H7 . 2 士0 . 1 A . 5 . 1 . 1 盐溶液的配制: 称取无水氯化钙 。 . 2 g ， 硫酸镁 。 . 2 g , 磷酸氢二钾 1 g , 磷酸二氢钾 1 g , 碳酸 氢钠 1 0 g , 氯化钠 2g ， 加蒸馏水至 l 0 0 0 mL A . 5 . 1 . 2 氯化血红素溶液( 5

25、 mg / m 工 一 ) 的配制: 称取氯化血红素 。 . 5 g溶于 1 mo l / L氢氧化钠 1 MI . 中， 加蒸馏水至 1 0 0 ML , 1 2 1 高压灭菌 1 5 mi n ， 冰箱保存。 A . 5 . 1 . 3 维生素 K 溶液的配制: 称取维生素 K , 1g 加无水乙醇 9 9 mL ， 过滤除菌， 放冷暗处保存 A . 5 . 1 . 4 制法; 将 A . 5 . 1 成分混合加热溶解， 冷后调 p H至 7 . 2 ， 加热 1 0 m i n ， 过滤, 1 2 1 高压灭菌 1 5 m i n GB / T 4 7 8 9 . 3 4 -2 0 0

26、3 附录B ( 规范性附录) 标准溶液的标定 B . 1 乙酸的标定: 准确称取乙酸3g ， 加水 1 5 m L, 酚酞指示液两滴， 用 1 mo l / I氢氧化钠溶液滴定， 并 将滴定结果用空白试验校正。1 mL 1 mo l / L氢氧化钠溶液相当于 6 0 . 0 5 mg的乙酸( CH , 0 3 ) . B . 2 乳酸的标定: 准确称取乳酸 1g ， 加水 5 0 mL ， 精密加人氢氧化钠滴定液( 1 mo l / I . ) 2 5 mL , 煮沸 5 m i n ， 加人酚酞指示液两滴， 趁热用 0 . 5 mo l / L硫酸滴定液滴定， 并将滴定结果用空白试验校正。每

27、 1 m L 1 mo l / L氢氧化钠滴定液相当于 9 0 . 0 8 m g的乳酸( CH6 0 3 ) . *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/