GBT 19915.6-2005.pdf

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1、I CS 0 7 C 5 3 1 0 0 . 3 0 (r i a 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB / T 1 9 9 1 5 . 6 -2 0 0 5 猪源链球菌通用荧光 P C R检测方法 Me t h o d o f t h e r e a l - t i m e P C R f o r t h e d e t e c t i o n o f S t r e p t o c o c c u s s u i s 2 0 0 5 - 0 9 - 2 7 发布 2 0 0 5 - 1 1 - 0 1实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中 国 国 家 标 准 化 管

2、理 委 员 会 发 布 GB / T 1 9 91 5 . 6 - 2 0 0 5 前言 本标准的附录A是规范性附录， 附录 B是资料性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国北京出人境检验检疫局、 中国兽医药品监察所。 本标准主要起草人: 张鹤晓、 宋立、 高志强、 宁宜宝、 周琦、 乔彩霞、 杨承槐、 吴丹、 谷强。 本标准系首次发布的国家标准。 GB / T 1 9 9 1 5 . 6 -2 0 0 5 猪源链球菌通用荧光 P C R检测方法 范 围 本标准规定了猪源链球菌通用荧光 P C R检测方法。 本标

3、准适用于增菌培养物、 疑似病料及生猪拭子、 猪组织样品中猪源链球菌的检测。 规 范性 引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 GB / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4禽流感病毒通用荧光 RT- PC R检测方法 缩 略语 本标准采用下列缩略语: 荧光P C R 荧光聚合酶链式反应 C t 值每个反应管内的荧光信号量达到设定的闽值时所经

4、历的循环圈数 D NA脱氧核糖核酸 T a q 酶T a q D NA聚合酶 P B S磷酸盐缓冲生理盐水 原理 采用 T a g Ma n方法， 在比对猪源链球菌 1 6 S r D NA基因序列的基础上， 设计针对该基因的特异性引 物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针 5 端标记 F A M荧光素为报告荧光基团( 用 R表示) ， 3 端标记T A MR A荧光素为淬灭荧光基团( 用Q表示) ， 它在近距离内 能吸收5 端荧光基团发出的荧光 信号。P C R反应进人退火阶段时， 引物和探针同时与目的基因片段结合， 此时探针上 R基团发出的荧 光信号被Q基团 所吸收， 仪器检测不到荧光信

5、号; 而反应进行到延伸阶段时， T a q 酶的5 -3 的外切核 酸酶功能将探针降解。这样探针上的 R基团游离出来， 所发出的荧光不再为 Q所吸收而被检测仪所接 收。随着 P C R反应的循环进行， P C R产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 猪源链球菌通用荧光 P CR检测实验 室的标准化设 It与管理 猪源链球菌通用荧光P C R检测实验室的标准化设置与管理见 G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4中附录 C . 试荆和材料 6 . 1试剂 除另有说明， 所用试剂均为分析纯。 6 . 1 . 1 无水乙醇: -2 0预冷。 6 . 1 . 2 7 5 %乙醇: 用

6、新开启的无水乙醇和无D NA酶的灭菌纯化水配制， -2 0预冷。 6 . 1 . 3 0 . 0 1 mo l / L p H 7 . 2 的 P B S : 配方见附录 A, ( 1 2 1 士2 ) 0 C, 1 5 mi n 高压灭菌冷却。 GB / T 1 9 91 5 . 6 - 2 0 0 5 6 . 1 . 4 猪源链球菌通用荧光 P C R检测试剂盒U: 试剂盒的组成、 说明及使用注意事项参见附录B , 6 . 2 仪器设备 6 . 2 . 1 高速台式冷冻离心机: 最大转速 1 3 0 0 0 r / m i n以上。 6 . 2 . 2 荧光 P C R检测仪、 计算机。

7、6 . 2 . 3 2 0C-8 冰箱和一2 0 冰箱。 6 . 2 . 4 微量移液器: 0 . 5 fa L - 1 0 fa L , 5 p L - 2 0 p L , 2 0 p L 2 0 0 tA L , 2 0 0 p L -1 0 0 0 p L , 6 . 2 . 5 组织匀浆器。 6 . 2 . 6 混匀器。 样品的采集 与前处 理 采样过程中样本不得交叉污染， 采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 7 . 1 取样工具 7 . 1 . 1 棉拭子、 剪刀、 镊子、 研钵、 E p p e n d o r f 管。 7 . 1 . 2 所有上述取样工具应经( 1 2 1

8、士2 ) 0 C, 1 5 mi n 高压灭菌并烘干或经 1 6 0 干烤2 h , 7 . 2采样方 法 7 . 2 . 1 生猪拭子样品 咽喉拭子采样， 采样时要将拭子深人喉头及上愕来回刮 3 次一5 次， 取咽喉分泌液。 7 . 2 . 2 扁桃体、 内脏或肌肉样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品 1 . 0 g于研钵中充分研磨， 再加 5 . 0 mL P B S混匀， 然后将组织 悬液转人无菌 E p p e n d o r f 管中， 编号备用。 7 . 2 . 3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌 E p p e n d o r f 管中， 编号备用。 7 . 3 存放与运送

9、 采集或处理的样本在 2 0 C - - 8 条件下保存应不超过 2 4 h ; 若需长期保存， 须放置一7 0 冰箱， 但应 避免反复冻融( 最多冻融 3次) 。采集的样品密封后， 采用保温壶或保温桶加冰密封， 尽快运送到实 验室 。 操作方法 8 . 1 样本核酸的提取 在样 本处理区进行 。 8 . 1 . 1 提取方 法 1 8 . 1 . 1 . 1 取n 个1 . 5 m L 灭菌E p p e n d o r f 管， 其中n 为待检样品数、 一管阳 性对照及一管阴 性对照之 和， 对每个管进行编号标记。 8 . 1 . 1 . 2 每管加人1 . 0 m L 裂解液， 然后分别

10、加人待测样本、 阴 性对照和阳 性对照各1 0 0 p L ， 一份样本 换用一个吸头， 混匀器上震荡混匀 5s ， 于 4 r-2 5 条件下， 1 0 0 0 0 r / mi n离心1 0 m i n . 8 . 1 . 1 . 3 取与8 . 1 . 1 . 1 中相同数量的1 . 5 m L 灭菌E p p e n d o r f 管， 加人5 0 0 p L无水乙醉( -2 0 预 冷) ， 对每个管进行编号。吸取 8 . 1 . 1 . 2 离心后各管中的上清液转移至相应的管中， 上清液要充分吸取， 不要吸出底部沉淀， 颠倒混匀。 8 . 1 . 1 . 4 于4 0 C -2

11、5 条件下， 5 0 0 0 r / min离心 5 m i n ( E p p e n d o r f 管开口保持朝离心机转轴方向放 置) 。轻轻倒去上清， 倒置于吸水纸上， 吸干液体， 不同样品应在吸水纸不同地方吸干。加人 1 . 0 m L ” 由指定单位提供， 给出这一信息是为了方便本标准的使用者， 并不表示对该产品的认可.如果其他等效产品具 有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 GB / T 1 9 9 1 5 . 6 -2 0 0 5 7 5 % 乙醇， 颠倒洗涤。 8 . 1 . 1 . 5 于4 0C -2 5 条件- F , 5 0 0 0 r / m i n 离心1 0

12、m i n ( E p p e n d o r f 管开口 保持朝离心机转轴方向 放 置) 。轻轻倒去上清液， 倒置于吸水纸上， 吸千液体， 不同样品应在吸水纸不同地方吸干。 8 . 1 . 1 . 6 4 0 0 0 r / m i n 离心1 0 s ， 将管壁上的残 余液体甩到管底部， 用微量加样器尽量将其吸干， 一份 样本换用一个吸头， 吸头不要碰到有沉淀一面， 室温干燥 5s -1 5s 。不宜过于干燥， 以免 D N A不溶。 8 . 1 . 1 . 7 加人1 1 p L无D N A酶的灭菌纯化水， 轻轻混匀， 溶解管壁上的D N A , 2 0 0 0 r / m i n 离心

13、5 。 ， 冰上保存备用。 8 . 1 . 2 提取方法2 8 . 1 . 2 . 1 取。 个1 . 5 m L 灭菌E p p e n d o r f 管， 其中n 为待检样品数、 一管阳 性对照及一管阴性对照之 和， 对每个管进行编号标记。 8 . 1 . 2 . 2 每管加人1 0 0 p L D N A提取液1 . 然后分别加人待测样本、 阴性对照和阳性对照各1 0 0 p L ， 一 份样本换用一个吸头， 混匀器上震荡混匀 5s ， 于 4 0C - - 2 5 条件下， 1 3 0 0 0 r / m i n离心 1 0 min , 8 . 1 . 2 . 3 尽可能吸弃上清且不

14、碰沉淀， 再加人1 0 p L D N A提取液2 , 混匀器上震荡混匀5 ， 于4 一 2 5 条件下， 2 0 0 0 r / min离心 1 0 s , 8 . 1 . 2 . 4 1 0 0 干浴或沸 水浴1 0 m i n ; 加人4 0 p L 无D N A酶的 灭菌纯化水， 1 3 0 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n , 上清即为提取的 D N A， 冰上保存备用。 8 . 1 . 3 D N A提取后的处理要求 提取的 D NA须在 2h内进行 P C R扩增或放置于 一7 0 冰箱。 8 . 2 扩增试剂准备与配制 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出

15、 猪源链球菌通用荧光P C R 反应液、 T a q 酶， 在室温下融化后， 2 0 0 0 r / m i n 离心5 s , 设所需 P C R数为 n ， 其中n为待检样品数、 一管阳性对照及一管阴性对照之和。每个测试反应体系需 使用1 5 I L P C R反应液及。 . 3 / LT a q 酶。 计算各试剂的 使用量， 加人一适当体积试管中， 向每个P C R 管中各分装1 5 L ， 转移至样本处理区。 8 . 3 加样 在样本处理区进行。在各设定的P C R管中分别加人 8 . 1 . 1 . 7或者 8 . 1 . 2 . 4中制备的D NA溶液 1 0 p L ， 使总 体

16、积达2 5 p L , 盖紧管盖后， 5 0 0 r / m i n 离心3 0 s , 8 . 4 荧光P C R反应 在检测区进行。将 8 . 3中加样后的P C R管放人荧光 P C R检测仪内， 记录样本摆放顺序。 反应参数设置: 第一阶 段， 预变性9 2 0C 3 m i n ; 第二阶 段， 9 2 0C 5 s , 6 0 0C 3 0 s , 4 5 个循环， 荧光收集设置在第二阶段每次循环的 退火延伸时 进 行 。 结果判定 9 . 1 结果分析条件设定 读取检测结果。阐值设定原则以阑值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点， 不同仪器可 根据仪器噪音情况进行调整。 9

17、. 2 质控标准 9 . 2 . 1 阴性对照无 C t 值并且无扩增曲线。 9 . 2 . 2 阳性对照的C t 值应簇3 0 . 0 ， 并出现特定的扩增曲线。 9 . 2 . 3 如 阴性 对照和阳性条件不满足以 卜条件 ， 此次实验视为无效。 GB / T 1 9 91 5 . 6 -2 0 0 5 9 . 3 结果描述及判定 9 . 3 . 1 阴性 无 C c 值并且无扩增曲线， 表明样品中无猪源链球菌。 9 . 3 . 2 阳性 C a 值(3 0 . 0 ， 且出现特定的扩增曲线， 表示样本中存在猪源链球菌。 GB/ T 1 9 9 1 5 . 6 -2 0 0 5 附录A (

18、 规范性附录) 确酸盐级冲生理盐水配方 A . 1 A液( 0 . 2 m o l / L 礴酸二级钠水溶液) 一水合磷酸二氢钠( N a H , P O , H 0 ) 2 7 . 6 g , 溶于蒸馏水中， 最后稀释至1 0 0 0 m L . A . 2 B液( 0 . 2 mo l / L确酸红二钠水溶液) 七水合磷酸氢二钠( N a , H P O , 7 H2 0) 5 3 . 6 g , 或+二水合磷酸氢二钠( N a t HP 0 , 1 2 H2 0) 7 1 . 6 g 或二水合磷酸氢二钠( N a z H P 0 , 2 H 0 ) 3 5 . 6 g 加燕馏水溶解， 最

19、后稀释至1 0 0 0 m L . A . 3 0 . 0 1 m o l / L , P H 7 . 2 麟酸盐缓冲生理盐水的配制 l436 0 . 2 mo l / L A液 0 . 2 mo l / L B液 抓化钠 用蒸馏水稀释至 1 0 0 0 mL, 8 . 5 g GB/ T 1 9 9 1 5 . 6 -2 0 0 5 附录B ( 资料性附最) 猪派链球菌通用荧光 P C R试荆A组成、 说明及使用时的注愈事项 B . 1 试荆盒的组成 试剂盒的组成见表 B . 1 . 裹 B . 1 猪派链球菌通用荧光 P C R试荆盒的组成 组成 ( 4 8 t e s t s / 盒)

20、数量 裂解液( 提取方法 1 ) 或DN A提取液 1 ( 提取方法 2 ) . DN A 提取液 2 ( 提取方法2 ) 4 8 mL X 1 盒( 裂解液) 或 5 mLX 1管( DN A提取液1 ) , 1 . 6 mL X1 管( D NA提取液2 ) 猪源链球菌通用荧光 P C R反应液7 5 0 1 A L X 1 管 T “ q南( 5 U / I L ) 1 5 tt LX1管 无DN A酶的灭菌纯化水1 m LXI管 阴 性 对 照1 m LXI管 阳 性 对 照1 m LXI管 B. 2说明 B . 2 . 1 裂解液外观为浅绿色， 于4 保存; D N A提取液 1 ,

21、 2 为无色液体， 一2 0 保存。 B . 2 . 2 无DN A酶的灭菌纯化水， 用于溶解提取的D N A. B . 2 . 3 P C R反应液中含有特异性引物、 探针及各种离子。 B . 3 使用时的注愈事项 B. 3 . 1 B. 3 . 2 染仪 器. B. 3 . 3 由于阳性样品中模板浓度相对较高， 检测过程中不得交叉污染。 反应液分装时应尽量避免产生气泡， 上机前注意检查各反应管是否盖紧， 以免荧光物质泄漏污 除裂解液外， 其他试剂一2 0 保存， 有效期为6 个月。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/