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1、G B / T 1 9 4 3 8 . 4 -2 0 0 4 月 U舌 G B / T 1 9 4 3 8 -2 0 0 4 禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 分为以 下四 个部分: -G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4 禽流感病毒通用荧光 R T - P C R检测方法 ; G B / T 1 9 4 3 8 . 2 -2 0 0 4 ( H 5 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 ; -G B / T 1 9 4 3 8 . 3 -2 0 0 4 ( H 7 亚型禽流感病毒荧光 R T - P C R检测方法 ; G B / T 1 9
2、4 3 8 . 4 -2 0 0 4 ( H 9 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 。 本部分的附录A是资料性附录。 本部分由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本部分起草单位: 中 华人民共和国 北京出人境检验检疫局、 深圳市匹基生物工程股份有限公司 本部分主要起草人: 张利峰、 张鹤晓、 刘继红、 郭晋优、 刘艳华、 杨伟。 G B / T 1 9 4 3 8 . 4 -2 0 0 4 H 9 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法 1 范围 本部分规定了荧光R T - P C R检测 H 9 亚型禽流感病毒的操作方法。 本部分适用于活禽及其产品中H9
3、亚型禽流感病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日 期的引用文件， 其随后所有 的 修改单( 不包括勘误的内 容) 或修订版均不适用于本部分， 然而， 鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本凡是不注日 期的引用文件， 其最新版本适用于本部分 G B / T 1 9 4 3 8 . 1 -2 0 0 4 禽流感病毒通用荧光R T - P C R检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本部分。 荧光 R T - P C R 荧光反转录一 聚合酶链反应。 3 . 2 C t 值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阑值时所经历的
4、循环数。 3 . 3 RNA 核糖核酸。 3 . 4 DEP C 焦碳酸乙二酉 旨 。 3 . 5 P BS 磷酸盐缓冲盐水。 3 . 6 T a q 酶 T a q D N A聚合酶 4 原理 H9 亚型禽流感病毒荧光R T - P C R检测方法是采用 T a g Ma n 技术。设计一对仅在 H9 亚型禽流感 病毒血凝素基因间 保守的 特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 探针的5 端和3 端分别标记 不同的荧光素， 如5 端标记F A M荧光素， 它发出的荧光能够被检测仪器接收， 称为报告荧光基团( 用R 表示) ， 3 ， 端一般标记T A M R A荧光素， 它在近距离内能吸收5
5、 ， 端报告荧光基团发出的荧光信号 称为 淬灭荧光基团( 用 Q表示) 。 当P C R反应在退火阶段时， 一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合， 此时探针上R基团发 1 G B / T 1 9 4 3 8 . 4 -2 0 0 4 出的荧光信号被 Q基团所吸收， 仪器检测不到 R所发出的荧光信号; 当P C R反应进行到延伸阶段时， T a q 酶在引物的引导下， 以四种核昔酸为底物， 根据碱基配对的原则， 沿着模板链合成新链; 当 链的延伸 进行到探针结合部位时， 受到探针的阻碍而无法继续， 此时的T a q 酶发挥它的5 -3 外切核酸酶的功 能， 将探针切成单核普酸， 消除阻碍，
6、与此同时标记在探针上的R基团游离出来， R所发出的荧光再不 为Q所吸收而被检测仪所接收; 在 T a y 酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链， R和 Q基团均游离 于溶液中， 仪器可继续检测到R所发出的荧光信号。 5 材料与试剂 5 . 1 试剂 除特别说明以 外， 本标准所用试剂均为分析纯， 所有试剂均用无R N A酶污染的容器 2 0 0 0 r / m i n 离心 5 ， 冰上保存备用。提 G B / T 1 9 4 3 8 . 4 -2 0 0 4 取的R NA须在2h内进行 P C R扩增; 若需长期保存须放置于一7 0 冰箱。 7 . 3 检测 7 . 3 . 1 扩增试剂准备
7、 在反应混合物配制区进行。 从试剂盒中取出相应的荧光R T - P C R反应液、 T a q 酶， 在室温下融化后， 2 0 0 0 r / m i n 离心5 s 。设 所需荧光R T - P C R检测总数为n ， 其中n 为被检样品、 阳性样品与阴性样品的和， 每个样品测试反应体 系配制见表 1 e 表 1 每个样品测试反应体系配制表 R T - P C R反应液/ p L 1 5 T a q 酶/ p L 0. 2 5 剂一量 试-用 根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量， 加入到适当体积试管中， 按每四份样品加人一颗 R T - P C R 反转录酶颗粒， 计算应加入的酶颗粒数，
8、 充分混合均匀， 向每个荧光R T - P C R管中各分装1 5 P L 反应混合物液体， 转移至样本处理区。 7 . 3 . 2 加样 在样本处理区进行。 在各设定的荧光R T - P C R管中分别加人7 . 2 . 7 中制备的R N A溶液各1 0 I L ， 盖紧管盖， 5 0 0 r / m i n 离心3 0 s , 7 . 3 . 3 荧光 R T - P C R检测 在检测区进行。 将7 . 3 . 2 中离心后的P C R管放人荧光R T - P C R检测仪内， 记录样本摆放顺序。 循环条件设置: 第一阶段， 反转录4 2 0C / 3 0 m i n ; 第二阶段，
9、预变性 9 2 0C / 3 m i n ; 第三阶段， 9 2 0C / 1 0 s , 4 5 0C / 3 0 s , 7 2 0C / l mi n , 5 个循环; 第四阶段， 9 2 0C / 1 0 s , 6 0 0C / 3 0 s , 4 0 个循环， 在第四阶段每次循环的退火延伸时收集荧光。 试验检测结束后， 根据收集的荧光曲线和C t 值判定结果。 8 结果判定 8 . 1 结果分析条件设定 直接读取检测结果阐值设定原则根据仪器噪声情况进行调整， 以阂值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准 8 . 2 质控标准 8 . 2 . 1 阴性样品无C t 值或无扩增曲
10、线。 8 . 2 . 2 阳性对照的C t 值应小于2 8 . 0 ， 并出现典型的扩增曲线。否则， 此次实验视为无效。 8 . 3 结果描述及判定 8 . 3 . t 阴性 无C t 值或无扩增曲线， 表示样品中无H9 亚型禽流感病毒。 83 . 2 阳性 C t 值小于等于3 0 . 0 ， 且出现典型的扩增曲线， 示样品中存在H 9 亚型禽流感病毒。 8 . 3 . 3 有效原则 C t 大于3 0 . 0 的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性， 否则为阳性。 G B / T 1 9 4 3 8 . 4 -2 0 0 4 附录A ( 资料性附录) H 9 亚型禽流感病毒荧光 R T -
11、 P C R检测试剂盒的组成 A . 1 试剂盒组成 每个试剂盒可做 4 8 个检测， 包括以下成分: 裂解液3 0 mL XI 盒 D E P C水1 MI-XI管 H 9 亚型禽流感病毒R T - P C R反应液7 5 0 P L X 1 管 R T - P C R酶1 颗/ 管X1 2 管 T a y 酶1 2 l c l . X 1 管 阴 性对照1 m l . XI 管 阳性对照( 非感染性体外转录R N A ) 1 m 工 _ X1 管 A . 2 说明 A. 2 . 1 A. 2 . 2 A. 2 . 3 种离子 裂解液的主要成分为异硫氰酸肌和酚， 为R N A提取试剂， 外观
12、为红色液体， 于4 保存。 D E P C水， 是用 l o o D E P C处理后的去离子水， 用于溶解R N A H9 亚型禽流感病毒R T - P C R反应液中含有检测 H9 亚型禽流感病毒的特异性引物、 探针及各 A . 3 使用时的注意事项 A . 3 . 1 由于阳性样品中模板浓度相对较高， 检测过程中不得交叉污染 A . 3 . 2 反应液分装时应避免产生气泡 上机前检查各反应管是否盖紧， 以免荧光物质泄露污染仪器。 A . 3 . 3 R T - P C R酶颗粒极易吸潮失活， 必须在室温条件下置于干燥器内保存， 使用时取出所需数量 剩余部分立即放回干燥器中 *草庐一苇草庐
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