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1、GB / T 4 7 8 9 . 3 0 - 2 0 0 3 前言 本标准对 G B / T 4 7 8 9 . 3 0 -1 9 9 4 食品卫生微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验 进行 修订。 本标准与G B / T 4 7 8 9 . 3 0 -1 9 9 4 相比主要修改如下: 按照G B / T 1 . 1 -2 0 0 。 对标准文本的格式和文字进行修改 修改和规范原标准中的“ 设备和材料” 。 培养基成分的含量: A . 4 . 1 氯化钠5 g 改为2 0 g o 对6 . 8小鼠的致病力试验作了修改。 本标准自实施之日起， G B / T 4 7 8 9 . 3 0 -1
2、 9 9 4同时废止。 本标准的附录 A是规范性附录。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位: 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所。 本标准主要起草人: 白竟玉、 付萍、 李志刚、 计融。 本标准于1 9 9 4 年首次发布， 本次为第一次修订。 GB/ T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 食 品 卫 生 微 生 物 学 检 验 单核细胞增生李斯特 氏菌检验 范围 本标准规定了单核细胞增生李斯特氏菌的检验方法。 本标准适用于食品和食物中毒样品中单核细胞增生李斯特氏菌的检验。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注 日期
3、的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注 日 期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 GR I T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 食品卫生微牛物学检验染色法、 培养基和试剂 3 设备和材料 3 . 1 冰箱: 4 一一2 0 C。 3 . 2 恒温培养箱: 3 0 士1 C , 2 4 士1 0C。 3 . 3 恒温水浴锅: 4 6 士1 0 C。 3 . 4 均质器或灭菌乳钵。 3 . 5 显微镜: l o x-l o o x o 3 . 6 离心机
4、: 4 0 0 0 r / mi n e 3 . 7 架盘药物天平: 0 g -5 0 0 g , 精度0 . 5 g , 3 . 8 锥形瓶 : 1 0 0 mL , 5 0 0 ml - . 3 . 9 灭菌吸管: 1 mL ( 具 0 . 0 1 m L刻度) , 1 0 mL ( 具 0 . 1 mL刻度) 。 3 . 1 0 灭菌平皿: 直径 9 0 c m, 3 . 1 1 灭菌试管: 1 6 mm X 1 6 0 mm, 3 . 1 2 离心管: 3 0 mmX1 0 0 m m, 3 . 1 3 灭菌注射器: 1 ml 。 3 . 1 4 单核细胞增生李斯特氏 菌标准株。 3
5、. 1 5 马红球菌。 3 . 1 6 小白鼠: 1 6 g -1 8 g . 4 4 . 1 4 . 2 4 . 3 4 . 4 4 . 5 4 . 6 4 . 7 培 养基和试荆 含。 . 6 %酵母浸膏的胰酪大豆肉汤( T S B - Y E ) : 见第 A . 1 章。 含0 . 6 %酵母浸膏的胰酪大豆琼脂( T S A - Y E ) : 见第 A . 2 章。 E B增菌液: 见第 A . 3 章 李氏增菌液( L B , , I- B 2 ) : 见第 A. 4章。 三糖铁( T S I ) 琼脂: 按 G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中4 . 2
6、 6 , 4 . 2 7 0 S I M动力培养基: 见第 A . 5 章。 血琼脂: G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中4 . 6 . GB / T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 4 . 8 改良的Mc B r i d e ( MMA) 琼脂: 见第 A . 5 章。 4 . 9 硝酸盐培养基: G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中3 . 1 7 4 . 1 0 缓冲葡萄糖蛋白陈水( MR和 V P试验用) : G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中3 . 4 4 . 1 1 糖发酵培养基: GB
7、/ T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3 中 3 . 2 4 . 1 2 过氧化氢酶试验: G B / T 4 7 8 9 . 2 8 -2 0 0 3中4 . 3 8 4 . 1 3 1 %盐酸 丫吮黄溶液( Ac r i f l a v i n e HC ll: 见第 A . 4 . 2 . 1 章。 4 . 1 4 1 %蔡吮酮酸钠盐溶液( Na l a d i x i c a c i d ) : 见第A. 4 . 2 . 1 章。 5检验程序 单核细胞增生李斯特氏菌检验程序见图 1 . 2 4 2 GB / T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 6操作 步骤 6
8、 . 1 样品的收集及处理 无菌取样品2 5 g ( m L ) 放灭菌均质器中 加2 2 5 m L E B 和L B 增菌液中， 充分搅拌成均质。如不能及 时检验， 可暂存 4 冰箱。 6 . 2 增菌培养 E B增菌液放 3 0 士I 培养 4 8 h , I . B ， 增菌液 2 2 5 mL放 3 0 士1 0 C 培养 2 4 h ， 吸取 0 . 1 mL ， 加人 1 0 m l , L B z 增菌液中二次增菌 6 . 3 分离培养 将 E B增菌液和 L B : 二次增菌液分离于选择培养基MMA琼脂平板上， 培养 3 0 士1 0C 4 8 h ， 挑选 可疑菌落， 用白
9、炽灯 4 5 0 角斜光照射平板， 李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色， 小的圆形菌落。 6 . 4 选五个以上的上述可疑菌落接种三糖铁( TS I ) 琼脂和S I M动力培养基， 培养于 2 5 0 C士1 0 C， 观察 是否有动力， 且成伞状或月芽状生长。一般观察 2 d -7 d ， 阳性者可做下一步鉴定。 6 . 5 纯培养 将上述有动力、 形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、 下层的产酸而不产硫化氢的可疑培养物接 种于胰酪脉大豆琼脂培养基( T S A - YE ) 上纯培养， 做以下鉴定。 6 . 6 染色镜检 将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查; 李斯特氏菌为革兰 氏阳性小
10、杆菌， 大小为 ( 0 . 4 ) t m 0 . 5 p m ) X ( 0 . 5 f m-2 . 0 k m) ; 用生理盐水制成菌悬液， 在油镜或相差显微镜下观察， 该菌 出现轻微旋转或翻滚样的运动。 6 . 7 生化特性 将上述可疑菌做进一步的生化试验， 单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特性及其种间的区别见 表 t o 表 1 单核细胞增生李斯特氏菌生化性状与有关菌的区别 菌 种 溶血反应 硝酸盐还原尿素酶MR - V P甘露醇鼠李糖木糖七叶普 单核细胞增生李斯特氏菌 ( L . mo n o c y t o g e n e s ) +一一+ / +一+一小 绵 羊 李 斯 特 氏
11、菌 ( L . i m n o v i i ) +一一+ / +一一+ 英诺克李斯特氏菌 ( L . i n n o c u a ) 一一一+ / 十一v一+ 威尔斯李斯特氏菌 ( L. we l s h i m e r i ) 一一一+ / +一V+ 西尔李斯特氏菌 ( L . s e e l i g e r i ) +一一+ / +一一+ 格氏李斯特氏菌 ( 毛 . g r a y i) 一一一+ / 十+一一+ 默氏李斯特氏菌 ( L . mu r my i ) 一+一+ 了 +v一+ 注: V反应不定; +阳性; 一阴性。 GB / T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 6
12、 . 8 对小鼠的毒力试验 将符合上述特性的纯培养物接种于TS B - Y E中， 3 0 培养 2 4 h ， 离心， 弃上清液， 用 。 . 8 5 写灭菌生 理盐 水制备成浓度为1 0 0 c f u / m L的 菌悬液， 取此菌悬液进行小鼠腹腔注射3 只一5 只， 每只。 . 5 m L ， 观 察小鼠死亡情况。致病株于2 d - 5 d内死亡。试验时可用已知菌作对照。单核细胞增生李斯特氏菌、 绵羊李斯特氏菌( L . i v a n o v i i ) 对小鼠有致病性。 6 . 9 协同溶血试验( c AMP ) 在血平板上平行接种金黄色葡萄球菌和马红球菌 ( R. e q u i
13、 ) ， 在它们中两者之间垂直接种可疑李斯 特氏菌， 但不要触及它们， 3 0 培养 2 4 h -4 8 h ， 检查平板中垂直接种点对溶血环的影响。靠近金黄色 葡萄球菌接种点的单核细胞增生李斯特菌的溶血增强， 西尔李斯特氏菌( L . s e e l i g e r i ) 的溶血也增强， 而 绵羊李斯特氏菌( L . i v a n o v i i ) 在马红球菌附近的溶血增强。 GB / T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 附录A ( 规范性附录) 培养基 A . 1 含 0 . 6 %醉母漫膏的胰酷膝大豆肉汤( T S B - Y E ) A . 1 . 1 成分 胰陈
14、1 7 g 多价脉39 酵母膏69 氯化钠5g 磷酸氢二钾2 . 5 9 葡萄糖2 . 5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL A. 1 . 2制 法 将上述各成分加热搅拌溶解， 调至p H 7 . 2 - 7 . 4 ， 分装, 1 2 1 灭菌1 5 m in ， 备用 A . 2 含 0 . 6 %酵母膏胰酪膝大豆琼脂( T S A - Y E ) A. 2 . 1 成分 胰脉1 7g 多价膝3g 酵母膏69 氯化钠59 磷酸氢二钾2 . 5 9 葡萄糖2 . 5 9 琼脂1 5 9 蒸馏水1 0 0 0 ml A. 2 . 2制法 将上述各成分加热搅拌溶解， 调 p H至 7 . 2 -7
15、 . 4 ， 分装, 1 2 1 高压灭菌， 备用。 A. 3EB增菌液 A. 3 . 1 成分 胰陈 多价膝 酵母膏 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖 蒸馏水 盐酸 丫Pit黄 1 7 g 3g 6g 5g 2 . 5 g 2 . 5 g 1 0 0 0 m L 1 5 mg / L GB / T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 禁吮酮酸4 0 m g / L A . 3 . 2 制法 除蔡吮黄和禁吮酮酸外， 其余成分加热混合， 调p H至7 . 2 7 . 4 , 1 2 1 0C 1 5 m i n 高压灭菌。 使用前 加丫吮黄溶液 1 5 mg / L和禁吮酮酸溶液 4 0 m
16、g / L， 此两种成分要无菌配制或过滤除菌。 A. 4李氏增菌液( L B- L BL B ) A. 4 . 1 成分 胰陈5 9 多价脉5g 酵母膏59 氯化钠2 0 g 磷酸二氢钾1 . 3 5 g 磷酸氢二钠1 2 g 七叶昔19 蒸馏水1 0 0 0 mL A. 4 . 2制法 将上述成分加热溶解， 调 p H至 7 . 2 -7 . 4 ， 分装， 1 2 1 0C 1 5 mi n高压灭菌。 A . 4 . 2 . 1李氏 I 液( L B , ) 2 2 5 mL中加人: 1 0 a 禁吮酮酸( 用 。 . 0 5 mo l / L氢氧化钠溶液配制) 0 . 4 5 mL 1
17、%盐酸丫吮黄( 用灭菌蒸馏水配制)0 . 2 7 mL A 4 . 2 . 2李氏II液( L B 2 ) 2 0 0 mL中加人: 1 %蔡陡酮酸0 . 4 0 mL 1 %丫吮黄0 . 5 0 mL 无菌分装于 1 0 mL大试管中。 A. 5改 良的 Me B r i d e琼脂 ( MMA) A . 5 . 1 成分 胰陈5g 多价陈 59 牛肉膏39 葡 萄糖19 氯化钠59 磷酸氢二钠19 苯 乙醇2 . 5 mL 无水甘氨酸1 0g 氯化锉0 . 5 g 琼脂1 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL A. 52制法 将上述成分加热搅拌混匀， 调p H至 7 . 2 -7 . 4 ，
18、 分装， 1 2 1 0C 1 5 m i n高压灭菌， 备用。 GB / T 4 7 8 9 . 3 0 -2 0 0 3 A. 6 S I M 动 力培养基 A . 6 . 1 成分 胰膝2 0 g 多价脉69 硫酸铁按0 . 2 g 硫代硫酸钠0 . 2 g 琼脂3 . 5 g 蒸馏水1 0 0 0 mL A. 6 . 2制法 将上述各成分加热混匀， 调 p H7 . 2 ， 分装小试管， 高压灭菌 1 2 1 0C 1 5 mi n , *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/