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1、I CS 0 7 . 1 0 0 . 3 0 C 5 3 (Gs 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 GB / T 1 9 9 1 5 . 4 - 2 0 0 5 猪链球菌 2型三重 P C R检测方法 Me t h o d o f d e t e c t i n g S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 2 b y t r i p l e - P C R 2 0 0 5 - 0 9 - 2 7发布2 0 0 5 - 1 1 - 0 1实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布 GB
2、 / T 1 9 91 5 . 4 -2 0 0 5 o li青 猪链球菌2型是链球菌属的成员， 其致病菌株可致猪链球菌病， 引起猪败血症、 脑膜炎等。人可通 过伤口感染该菌， 并导致死亡。为了区别正常猪所携带的猪链球菌 2型无毒菌株与发病猪分离的致病 菌株， 特制定本标准。本标准是采用现代分子生物学诊断技术制定的。 本标准由农业部畜牧兽医局提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会归口。 本标准起草单位: 南京农业大学。 本标准主要起草人: 陆承平、 姚火春、 范红结、 何孔旺。 GB / T 1 9 9 1 5 . 4 -2 0 0 5 猪链球菌 2 型三重 P C R检测方法 范围 本
3、标准规定了猪链球菌 2 型荚膜基因( c p s 2 ) , 溶菌酶释放蛋白基因( m r p ) 和o r f 2 这三个毒力基因 的三重P C R检测技术。 本标准适用于由猪链球菌 2 型致病基因和致病菌株的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法 术语 和
4、定义 下列术语和定义适用于本标准。 3 . 1 猪链球菌2 型 S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 2 猪链球菌是属于链球菌属的一种细菌， 根据其荚膜多糖抗原的差异， 可分为 1 - 3 4 及 1 / 2共 3 5个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型， 不仅对猪致病性很强， 而且可以感染特定的人群， 是 一种重要的人畜共患病病原菌。 测定方法 4 . 1 方法提要 挑取可疑细菌培养物菌落， 加人 P C R反应管中， 进行 P C R扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测 P C R产物， 与标准分子量标记比较， 来确定扩增产物的大小。 4 .
5、2 试剂和材料 除另有规定， 所用试剂均为分析纯， 水为符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 的灭菌双蒸水。 4 . 2 . 1 c p s 2 , m r p和o r f 2 的上下游引物， 按合成说明书使用。 4 . 2 . 2 T a q D N A聚合酶。 4 . 2 . 3 琼脂糖: 电泳级。 4 . 2 . 4 澳化乙锭。 4 . 2 . 5 分子量标记: DL - 2 0 0 0 , 4 . 2 . 6 T E 缓冲液: 1 0 m m o l / L T r i s - H C I ( p H 8 . 0 ) , l m m o l / L E D T A (
6、 p H 8 . 0 ) , 4 . 2 . 7 I O XP C R缓冲液: 1 0 0 m mo l / L K C 1 , 1 6 0 m mo l / L ( NH , ) 2 S O 1 , 2 0 m mo l / L Mg S O , , 2 0 0 m mo l / L T r i s - H C I ( p H 8 . 8 ) , 1 % T r i t o n X - 1 0 0 , 1 m g / m L B S A , 4 . 2 . 8 电泳缓冲液: 2 4 2 g T r is 碱， 5 7 . 1 mL冰乙酸， 1 0 0 mL 0 . 5 mo l / L E
7、D T A( p H8 . 0 ) ， 加蒸馏水至 1 0 0 0 mL ， 使用时 1 0 倍稀释。 4 . 2 . 9 加样缓冲液: 0 . 2 5 澳酚蓝， 4 0 %蔗糖。 4 . 2 . 1 0 阳性对照猪链球菌 2型 HA9 8 0 1株基因组 D N A模板， 阴性对照马链球菌兽疫亚种 AT C C 3 5 2 4 6株和金 黄色葡萄球菌 ATCC 2 5 9 2 3株基 因组 DNA模板 。 GB/ T 1 9 9 1 5 . 4 -2 0 0 5 4 . 2 . 1 1 猪链球菌 2 型三重 P C R反应混合物。 4 . 3 仪器和设备 4 . 3 . ， 离心机 。 4
8、. 3 . 2 D N A热循环仪。 4 . 3 . 3 核酸电泳仪。 4 . 3 . 4 p H计。 4 . 3 . 5 移液器: 1 0 p L , 2 0 p L , 1 0 0 p L , l 0 0 0 p L , 4 . 3 . 6 紫外线透射仪或捉胶成像系统。 4 . 3 . 7 恒温水浴锅。 4 . 4 P C R操作步骤 4 . 4 . 1 阳性对照和阴性对照D N A模板的提取 分别将猪链球菌 2型 H A9 8 0 1 、 马链球菌兽疫亚种 AT C C 3 5 2 4 6株和金黄色葡萄球菌 A T C C 2 5 9 2 3 株接种于 5 %犊牛血清 T o d d -
9、 Hw e i t t 肉汤培养基， 3 7 摇振培养 1 8h ， 用革兰氏阳性细菌柱离心 式基因组 D NA小量抽提试剂盒提取D NA模板， -2 0 保存备用。 4 . 4 . 2 P CR扩增 用铂金耳钓取血平板上的可疑单菌落至含有猪链球菌2型三重P C R反应混合物的P C R管中， 混 匀， 加人T a q 酶( 2 U / (a L ) 0 . 7 p L , 2 0 0 0 r / m in 离心1 0 s ， 立即 进行P C R 扩增; 同 时设去离子水的空白 对照、 猪链球菌2型 HA 9 8 0 1 株基因组 D N A模板的阳性对照、 马链球菌兽疫亚种 A T C C
10、 3 5 2 4 6 和金黄 色葡萄球菌 A T C C 2 5 9 2 3 株基因组 D NA模板的阴性对照。扩增条件为: 9 4 预变性 5 mi n ; 9 4 0 C 3 0 s , 5 5 C3 0 s , 7 2 * C 4 0 s , 3 0个循环; 7 2 0C延伸 7 m i n , VC 保存。 4 . 4 . 3 琼脂精凝胶电泳 在电泳缓冲液中加人 1 %琼脂糖， 加热融化后加人澳化乙锭制备凝胶， 凝固后进行电泳。8 p L酶切 产物加人2k L5 X上样缓冲液， 混匀后加人上样孔， 8 0 V恒压电泳 2 0 mi n , 紫外线透射检测。 5结果及判 断 5 . 1
11、试验结果成立条件 阳性对照 HA 9 8 0 1 株经 P C R扩增出现约 8 5 8 6 p , 3 8 7 b y和 3 1 6 b y三条条带， 去离子水的空白对 照、 马链球菌兽疫亚种AT C C 3 5 2 4 6 和金黄色葡萄球菌 A T C C 2 5 9 2 3株基因组 D N A模板的阴性对照 P C R产物电泳后没有条带， 试验结果成立， 否则， 结果不成立。 5 . 2结果判 断 琼脂糖凝胶电泳后， 在紫外线投射下检测， 在空白和阴、 阳性对照成立的情况下， 待检样品只出现 3 8 7 b y一条条带， 可判定为猪链球菌 2 型; 待检样品出现约 3 8 7 6 p ,
12、 3 1 6饰 和8 5 8 b y 三条条带， 或出现 3 8 7 b y和8 5 8 b y两条条带， 可判定为猪链球菌 2 型致病菌株; 待检样品只出现 8 5 8 b y一条条带， 可判 定为非猪链球菌 2 型的致病菌; 待检样品不出现条带， 结果为阴性。 6 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物， 应收集后高压灭菌处理。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/