SN-T-0477-1995.pdf

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1、lSN 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 s N / T 0 4 7 7 一 9 5 出口食品中 B群链球菌检验方法 Me t h o d f o r d e t e c t i o n o f g r o u p B s t r e p t o c o c c i i n f o o d s f o r e x p o r t 1 9 9 5 一 0 9 一 0 6 发布1 9 9 6 一 0 1 一 0 1 实施 中华人民共和国国家进出口商品检验局发 布 中华人民共和国进出口 商品检验行业标准 出口食品中B群链球菌检验方法 s x/ T 0 4 7 7 一9 5 Me t h o d

2、f o r d e t e c t i o n o f g r o u p B s t r e p t o c o c c i i n f o o d s f o r e x p o r t ， 主题内容与适用范围 本标准 规定了在绵羊 血琼脂平板上， 用C A M P ( C h r i s t i e , A t k i n s , M u n c h -P e t e r s e n 的 缩写) 试验作 为 对出口 食品中B 群链球菌检验方法。 本标准 适用于出口肉 类、 奶和奶制品中B群链球菌的检 验。其他食品可参照使用。 2 设备和材料 2 . 1 离心机5 0 0 0 r / m

3、i n ， 离心 管5 0 m L , 1 0 m L , 2 . 2 蔡氏滤器。 2 . 3 微孔滤膜， 孔 径。 . 4 5 IS m, 2 . 4 玻璃抽滤瓶。 2 . 5 玻璃水循环真空泵。 2 . 6 电 热恒温箱: 温度2 0 -6 0 0C 。 2 . 了 显微镜。 2 . 8 定性滤纸。 2 . 9 不锈钢厌氧菌培养罐。 2 . 1 0 电冰箱。 2 . 们乳钵、 研棒或均质器。 2 . 1 2 L形玻璃棒。 2 . 1 3 金黄色葡萄球菌菌株A T C C - 2 5 9 2 3 , 3 培养墓和试剂 3 . 1 T o d d - He w i t t肉汤 参见附录A( 补

4、充件) A1 ) , 3 . 2 牛心汤培养基 参见附录A( 补充件) A2 ) , 3 . 3 选择性牛心汤增菌培养基 参见附 录A ( 补充件) A 3 ) , 3 . 4 牛心汤琼脂 参见附录A( 补充件) A 4 ) , 3 . 5 绵羊血琼脂平板 参见附录A( 补充件) A5 ) . 3 . 6 (- 溶血素 参见附 录A ( 补充件) A 6 ) , 3 . 7 R - 溶血素带 参见附 录A ( 补充件) A 7 ) , 3 . 8 绵羊血球 参见附录A ( 补充 件) A 8 ) , 3 . 9 生理盐水: 灭菌的。 . 8 5 % N a C l . 3 . 1 0 革兰氏染

5、色液 参见附录 A( 补充件) A9 ) , 3 . 1 1 接触酶( 过氧化氢酶) 试验 参见附录B( 补充件) 。 中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 5 - 0 9 - 0 6 批准1 9 9 6 - 0 1 一 0 1 实施 S x / T 0 4 7 7 一9 5 4 样品的制备 4 . 1 肉类 4 . 1 . 1 冷冻产品应在 2 -5 过夜解冻， 或在 4 5 及以下经1 5 mi n解冻， 立即检验。若不能及时检验. 应置于一1 5 左右暂存。其他非冷冻易腐的食品， 亦应置于4 冰箱保存。 4 . 1 . 2 以无菌操作称取剪碎的肉类样品2 5 g , 置于灭菌之乳

6、钵内或 均质杯内， 加入2 5 m L灭菌生理盐 水进行研磨或均质( 8 0 0 0 - 1 0 0 0 0 r / m i n ， 均质 1 m i n ) ， 移入盛 2 0 0 mL生理盐水的 5 0 0 0 mL广口瓶 内， 混合均匀， 制成 1 : 1 0 稀释液。 4 . 2 奶和奶制品类 4 . 2 . 1 鲜奶、 酸奶: 以无菌手续去掉瓶罩纸盖， 瓶口经火焰灭菌后， 用无菌操作吸取 2 5 m L检样， 放人 装 有2 2 5 m L灭菌生理盐水的三角烧瓶内， 振摇均匀。 4 . 2 . 2 奶粉: 以无菌手续开封取样， 称取2 5 g 放人盛有2 2 5 m L温热的灭菌生理

7、盐水且装有适量玻璃 珠的灭菌广口瓶内， 振摇使其充分溶解混匀。 4 . 2 . 3 奶酪: 先用灭菌刀削去部分表面封蜡， 然后用点燃的酒精棉球灭菌表面后， 用灭菌刀切开奶酪， 再用无菌操作切取表层和深层检样 2 5 g ， 置于灭菌乳钵内切碎， 加人 2 5 m L生理盐水研成糊状， 移入盛 有2 0 0 m L灭菌生理盐水的广口 瓶内， 混合均匀。 制成1 e 1 0 的稀释液。 4 . 3 其他食品 样品的制备取决于食品的种类和状态。固体或半固体食品按 4 . 1 . 2 或 4 . 2 . 3 进行。液体食品按 4 . 2 . 1 进行。 检验步骤 5 . 1 增菌培养 将上述制备的检样

8、各取 1 0 mL分别接种于 1 0 0 m L牛心汤培养基内; 如检样污染较严重， 可同时按 上 述量 接种 于选择性牛心 汤增菌液内， 经3 5 士1 培养1 5 h ， 再进行C A M P 一 带或C A MP 一 点试验. 5 . 2 C AMP试验的条件 将 C A MP试验的绵羊血琼脂平板置于不锈钢厌氧菌培养罐内， 在 3 5 士1 培养。 5 . 3 C AMP 一 带试验 取件溶血素带 1 -2 条平行轻贴于绵羊血琼脂平板上， 间距 2 0 mm， 将样品或经过增菌的培养物直 接在件溶血素带两侧( 相距 3 -5 mm处) 垂直划线 3 -4 条或涂布接种， 经 1 4 1

9、8 h培养后观察结果。 如在 接种线 与R - 溶血素 带周围 朦胧溶血区 重叠处能见到协同产生清晰的“ 箭头” 状的增强溶血区 为阳性 反应， 可鉴定为B群链球菌。不见增强溶血为阴性反应， 判为B群链球菌阴性。 5 . 4 C AMP 一 点试验 将样品 或经过增菌的 培养物直接划线或用L 形玻璃棒涂布接种于绵羊血琼脂平板上， 经1 4 1 8 h 培养后， 用接种环取P - 溶血素滴加在圆 形突起， 细小的可疑为链球菌的单个菌落边缘， 再将平板进行孵 育， 分别在3 0 , 4 5 , 6 0 m i n 检查溶血变化情况。在滴加件 溶血素的菌落边缘有协同产生“ 扇 形” 增强溶血 区的为

10、阳性反应， 可鉴定为B群链球菌。不出现增强溶血现象的为阴性反应， 判为非B群链球菌。 每次检验时都要用已知阳性菌株作为对照试验。 5 . 5 C A M P - 带或C A M P 一 点试验阳性反应， 再进行革兰氏 染色. 镜检和接触酶试验， 以此来与其他溶血 性细菌如李斯特氏菌， 肉毒梭状芽胞杆菌和葡萄球菌等区别开。 6 报告结果 6 . 1 C AMP 一 带或C A MP 一 点试验阳性， 细菌形态相符， 革兰氏阳性 ， 接触酶阴性， 报告B群链球菌阳性。 6 . 2 C A M P - 带或C A MP 一 点试验阴性， 报 告B 群链球菌阴 性。 z S N/ T 0 477 一

11、9 5 附录A 培养墓和试剂 ( 补充件) A l T o d d - He w i t t 肉汤 牛肉 浸液1 0 0 0 m L 蛋白 陈2 0 g 1 0 mo l / L Na OH 2 . 7 mL Na HC 03 2 g Na C l 2 g N a , H P O, 1 2 H 2 0 1 g 葡萄糖29 p H 7 . 8 将各成分溶解后， 调 p H7 . 8 。分装在 1 5 0 mL烧瓶中， 每瓶 1 0 0 m L， 在 1 1 5 下灭菌 2 0 m i n , A 2 牛心汤 培养 基 牛心 浸液( 可以用牛肉膏5 g , 蒸馏水1 0 0 0 m L 代替) 1

12、 0 0 0 m L 蛋白 陈2 0 g 葡萄糖39 Na HC 03 2 g Na C l 2 g N a 2 H P 0, 1 2 H 2 0 2 g p H 7 . 4 将各成分溶解后， 加入1 m o l / L 3 0 o N a O H ， 校正p H 7 . 4 ， 分装 试管中， 每管1 0 m L ， 于1 1 5 下高压 灭菌 2 0 min , A 3 选择 性牛心汤增菌 培并墓 牛心汤培养基1 0 0 0 m L 三氮化钠。 . 0 7 5 g 结晶 紫0 . 0 0 2 g p H 7 . 4 除结晶紫外， 将其他成分混合， 加热溶解， 校正p H7 . 4 ， 再加

13、人结晶紫， 充分混合溶解后， 分装于试管 内， 每管 1 0 mL， 于 1 1 5 下高压灭菌 2 0 mi n , A 4 牛心汤琼脂 牛心浸液( 可以 用牛肉 膏5 g , 蒸馏水1 0 0 0 m L 代替) 1 0 0 0 m L 蛋白 陈2 0 g 葡萄糖3 9 Na HC 03 2 g Na Cl 2 g s N/ T 0 4 7 7 一9 5 N a , HP O ; 1 2 H, O 2 g 琼脂粉1 2 g p H 7 . 4 将各成分溶解后， 加人1 m o t / 1 . 3 % N a O H ， 校正p H 7 . 4 ， 加入琼脂粉1 2 g ， 于1 1 5 下

14、高压灭菌 2 0 mi na A5 绵羊血琼脂平板 将牛心汤琼脂加热溶化后. 待冷却到 5 0 时， 加经洗过的绵羊血球 5 %， 旋转混合均匀， 倾注平板， 冷凝备用。 A 6 卜溶血素 将金黄色葡萄球菌 A T C C - 2 5 9 2 3 菌株接种在T o d d - H e wit t 肉汤里， 于 3 5 士1 生长4 8 h ， 培养液以 3 5 0 0 r / m i n 离心1 0 m i n 。 取其上清液， 用装有微孔滤膜的蔡氏 滤器作真空抽滤除菌， 滤液则为件 溶血 素。分装在灭菌带盖小瓶内， 每瓶 5 mL . 冰冻保存， 备用。 A 7 p 一 溶血紊带 把灭菌的定

15、性滤纸条( 约4 c m X 0 . 4 c m ) 浸泡在装有汗 溶血素的带塞玻 璃瓶中， 则制成爵 溶血素 带。 置4 冰箱中 备用。 A 8 编羊血球制备 将无菌新采绵羊血， 用三倍灭菌生理盐水以2 5 0 0 r / m i n离心 1 5 min ， 弃去上清液， 洗两次， 最后用 生理盐水将血球悬浮到原体积。 A 9 革兰氏 染色液 A 9 . 1 结晶紫染色液: 结晶紫1 9 9 5 %乙醇2 0 m L 1 %草酸铁水溶液8 0 m L 将结晶紫溶解于乙醇中. 然后与草酸按溶液混合. A 9 . 2 革兰氏 碘液: 碘1 9 碘化钾2 9 蒸馏水3 0 0 mL 将碘与碘化钾先

16、进行混合， 加入蒸馏水少许， 充分振摇， 待完全溶解后， 再加蒸馏水至 3 0 0 mL , A9 . 3 沙黄复染液: 沙黄0 . 2 5 g 9 5 %乙醇1 0 mL 蒸馏水9 0 mL 将沙黄溶解于乙醇中， 然后用蒸馏水稀释。 A 9 . 4 染色法: A 9 . 4 . 1 将涂片在火焰上固定， 滴加结晶紫染色液， 染 1 min ， 水洗。 A 9 . 4 . 2 滴加革兰氏碘液， 作用 1 m i n ， 水洗。 A 9 . 4 - 3 滴加 9 5 %乙醇脱色， 约 3 0 s ; 或将乙醇滴满整个涂片， 立即倾去， 再用乙醇滴满整个涂片， 脱色 a S N / T 0 4 7

17、 7 一9 5 1 0 S , : : 水洗， 滴加复染液， 复染 1 m i n 。水洗， 待干， 镜检。 结果: 革兰氏阳性菌呈紫色， 革兰氏阴性菌呈红色。 A9A9 附录B 接触酶( 过级化氮酶) 试验 ( 补充件) B/ 试剂 3 % 过氧化氢溶 液: 临用时配制。 B 2 试验方法 挑取固体培养基上菌落一接种环， 置于洁净试管内， 或涂于干净的载玻片上， 然后分别滴加 3 %过 氧化氢溶液 2 mL或一滴观察结果。 B 3 结果 于 0 . 5 mi n内发生气泡( 氧气) 者则为接触酶阳性反应( 葡萄球菌) ， 不发生气泡者则为阴性反应( 链 球菌) 。 附加说明: 本标准由中华人

18、民共和国国家进出口商品检验局提出。 本标准由中华人民共和国陕西进出口商品检验局负责起草。 本标准主要起草人卢敬堂。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/