SN-T-1421-2004.pdf

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1、rI 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 4 2 1 - 2 0 0 4 猪水疙病病毒微量血清中和试验 M i c r o-s e r u m n e u t r a l i z a t i o n t e s t f o r s wi n e v e s i c u l a r d i s e a s e v i r u s 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布 2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 S N/ T 1 4 21 -2 0 0 4 J .曰 . o l1青 本标准的附录A是规范性

2、附录， 附录 B是资料性附录. 本标准由国家认证认可监督委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 杨素、 潘文波、 廖秀云、 冯家望。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 4 2 1 -2 0 0 4 猪水疙病病毒微t血清中和试验 范围 本标准规定了猪水疙病病毒微量血清中和试验方法。 本标准适用于猪水疙病病毒中和抗体的检测。 2缩略语 下列缩略语适用 于本标准 2 . 1 C P E : 致细胞病变作用。 T C I D ,o : 半数细胞感染量。 S V D: 猪水疤病。 原理 特异性的血清中和抗体与病毒结合后

3、， 能使病毒失去对敏感细胞的感染能力， 从而阻止病毒的繁 殖。这一反应不但表现为一种病毒只能被相应的免疫血清所中和， 而且还表现在中和一定量的病毒， 必 须有一定效价的免疫血清。本标准规定的中和试验是以定量病毒稀释血清为基础， 当血清能阻止定量 病毒 5 0 %致细胞病变能力时， 其血清的稀释度即为其效价。因而本中和试验是一种定量测定猪水疙病 血清抗体的方法。 试荆和材料 4 , 1 本标准所用试剂配制见附录A, 4 . 2 本标准试剂除特殊规定外， 均指分析纯试剂。 4 . 3 本标准所用试剂、 玻璃器皿除有特殊规定外， 均需高压灭菌。 4 . 4 病毒: 用经蚀斑法纯化并经血清学鉴定的猪水

4、疙病病毒作为标准病毒。 4 . 5 标准血清: 标准阴性血清采用无 S V D病毒抗体的猪血清， 标准强阳性和弱阳性血清采用 S V D病 毒感染发病后康复的猪血清。 4 . 6 细胞系: I B - R s - 2 传代细胞系. 4 . 7 细胞培养液: 含 1 0 %胎牛血清( 经 5 6 0C, 3 0 mi n 灭能) 及抗生素的细胞培养液。 4 . 8 细胞维持液: 含2 纬胎牛血清( 经 5 6 -C, 3 0 mi n灭能) 及抗生素的细胞维持液。 4 . 9 细胞分散液。 4 . 1 0固定液 。 4 . 1 1 染色液。 5 器械和设备 5 . 1 二氧化碳培养箱、 微量振荡

5、器、 倒置显微镜、 冰箱、 超声波细胞破碎仪. 5 . 2 1 0 0 m L细胞培养瓶、 9 6 孔微量细胞培养板、 吸头、 多道可调移液器、 单道可调移液器. S N/ T 1 4 21 -2 0 0 4 6 预备试验 6 . 1 将 S V D病毒接种 I B - R s - 2 细胞单层， 3 7 吸附 I h后加人维持液， 置 5 %二氧化碳培养箱于 3 7 C 培养， 接种2 4 h后用倒置显微镜逐日观察， 待C P E达 7 5 %以上， 冻融一次或置冰浴中用超声波处理 ( 4 0 p A , l m in ) , 2 0 0 0 r / m in 离心2 0 m i n ， 上

6、清 液分装小瓶， 每瓶1 m L ， 置一7 0 保存备用。 6 . 2 病毒毒价的测定及其工作浓度的配制: 将病毒原液用细胞维持液做 1 0倍系列稀释至 I ,) - ， 每个 稀释度作8 个孔， 每孔 5 0 p L ， 每孔加5 0 p L工作细胞液， 再补充细胞维持液5 0 p L 。每块板设 4 孔正常 细胞对照， 于 5 写二氧化碳培养箱 3 7 C 培养， 从 4 8 h 开始至 9 6 h 用倒置显微镜逐日观察记录 C P E ， 按 K a r b e r 方法计算 T C I D ; o 。将病毒原液配制成 1 0 0 T C I D ; o / 5 0 p L ， 备用。

7、 6 . 3 将标准阳性血清、 阴性血清、 被检血清经5 6 0C 3 0 min灭能， 备用。 6 . 4 将细胞用细胞培养液稀释成工作细胞液( 1 0 个细胞/ mL ) ， 备用。 7中和试验 7 .1 对照设立 7 . 1 . 1 细胞对照: 设4 孔正常细胞对照， 每孔加工作细胞液5 0 p L 、 细胞维持液 1 0 0 p L , 7 . 1 . 2 强阳性血清对照: 将已知滴度的标准强阳性血清用细胞维持液在 9 6孔微量培养板上从 1: 4 开 始做 倍比 系列稀释， 每 个稀释 度作5 个孔( 5 0 p L / 孔) , 4 孔加1 0 0 T C I D ; o / 5

8、0 p L 病毒 悬液5 0 p L ， 微量振 荡器振荡混匀， 置 5 %二氧化碳培养箱 3 7 中和 Ih ， 再加人工作细胞液 5 0 k L / 孔。余下的一孔作为 7 . 1 . 6 所描述的血清毒性对照， 7 . 1 . 3 弱阳性血清对照: 将已知滴度的标准弱阳性血清用细胞维持液在 9 6孔微量培养板上从 1， 4 开 始做倍比系列稀释， 每个稀释度作 5 个孔( 5 0 p L / 孔) , 4孔加1 0 0 T C I D ; a / 5 0 K L病毒悬液5 0 p L ， 微量振 荡器振荡混匀， 置 5 %二氧化碳培养箱 3 7 中和1h ， 再加人工作细胞液5 0 P

9、L / 孔。余下的一孔作为 7 . 1 . 6 所描述的血清毒性对照。 7 . 1 . 4 阴性血清对照: 设 5 孔阴性血清对照 4 孔加阴性血清和 1 0 0 T C I D 5 o / 5 01 L病毒悬液各5 0 p L, 再加人工作细胞液 5 0 p L o余下的一孔作为7 . 1 . 6 所描述的血清毒性对照。 7 . 1 . 5 病毒 回归对照: 将病毒稀释为 1 0 0 0 T C I D s o / 5 0 I .L , 1 0 0 T C I D ; o / 5 0 y L , 1 0 T C I D s o / 5 0 t L , 1 T C I D s o / 5 0

10、p L ， 每个稀释度作 4 孔， 每孔加人病毒悬液5 0 K L ， 再加人工作细胞液 5 0 K L ， 每孔补充细 胞维持 液5 0 # , L , 7 . 1 . 6 血清毒性对照: 被检血清每个稀释度设 1 孔血清毒性对照， 即 5 0 I L各稀释度血清， 补充 5 0 p L 维持液， 再加人工作细胞液5 0 t L a 7 . 2 被检血清中和试验 7 . 2 . 1 被检血清用细胞维持液在微量培养板上从 1， 4 开始做倍比系列稀释， 每个稀释度作 5 孔， 每孔 5 0 p L, 7 . 2 . 2 被检血清每个稀释度 4 孔加人预备试验滴定好工作浓度的病毒悬液 1 0 0

11、 T C I D s o / 5 0 p L ， 微量 振荡器振荡混匀， 置5 %二氧化碳培养箱 3 7 中和 Ih ， 再加人工作细胞液 5 0 u L ， 余下的一孔作为 7 . 1 . 6所描述 的血 清毒性对照 。 7 . 2 . 3 将 9 6孔微量细胞培养板置于含 5 %二氧化碳的培养箱中， 3 7 C培养2 d - - 4 d . 7 . 3结果判定 7 . 3 . 1 用倒置显微镜观察， 4 8 h 初判， 9 6 h终判， 终判前需固定染色。 7 . 3 . 2 终判定前的固定染色: 弃去培养液， 每孔加 5 0 p L固定液， 固定 3 0 mi n ， 弃去固定液， 将板

12、浸人 染色液中3 0 m i n 。流水冲洗， 观察结果。 7 . 3 . 3 结果判定需以各对照成立为前提， 当病毒回归为 1 0 s TC I D , o - 1 0 = s T C I D ;o ， 标准强阳性血清、 标准弱阳性血清效价与原滴定效价相差 1 个滴度以内， 标准阴性血清对照孔未着色. 细胞对照孔细胞染 z S N/ T 1 4 21 -2 0 0 4 成蓝色时， 才能进行终判。 7 . 3 . 4 被检样品孔细胞层染成蓝色判为阳性， 细胞层染成空白判为阴性( 细胞出现 C P E， 经固定染色 后为 空白; 细 胞未出现C P E ， 经固定染色后， 细胞层染成蓝色) 。血

13、清效价以5 0 终点血清与病毒混合 液中血清的总稀释度表示。 7 . 3 . 5 O I E / F A O参考实验室判定标准参见附录 B , S N / T 1 4 2 1 -2 0 0 4 附录A ( 规范性附录) 试剂配制 A . 1 细胞培养液的配制 1 9 9 培养基 ( 或 ME M 等其他培养基) ， 加人 1 0 %胎牛血清 ( 5 6 C 3 0 m i n灭能) ， 含青霉素 2 0 0 I U / m L , 链霉素2 0 0 f a g / m L ， 抽滤除菌分装， 4 保存备用. A . 2 细胞维持液的配制 1 9 9 培养基 ( 或 ME M 等其他培养基) ，

14、 加人 2 %胎 牛血清 ( 5 6 0C 3 0 min灭能) ， 含青霉素 2 0 0 I U / m L ， 链霉素 2 0 0 f a g / m L ， 抽滤除菌分装， 4 保存备用。 A . 3 抗生素选用及工作浓度参考表( 每毫升培养液含f) 两性霉素 B 制霉菌素 庆大霉素 卡那霉素 新霉素 青霉素 G 链霉素 多猫菌素 B 1 . 2 5 W g 1 0 0 I U 5 0 f a g 5 0拜 g 5 0 M g 1 0 0 I U - 2 0 0 I U 1 0 0 fa g -2 0 0 fa g 1 0 0 I U A . 4 细胞分散液的配制 胰酶 乙二胺四乙酸二钠

15、( E D T A ) 无钙镁 P B S 抽滤除菌 ， 冻存 。 2 . 5 g 0 . 2 g 1 00 0 m 1 A. 5无钙镁 P B S的配制 氯化钠8 . 0 g 氯化钾029 磷酸氢二钠1 . 1 5 g 磷酸二氢钾。 . 2 9 三蒸水1 0 0 0 mL 将上述成分依次溶解， 分装、 高压灭菌或抽滤备用。 A . 6 固定液的配制 1 0 %福尔马林。 A . 7 染色液的配制 亚甲蓝0 . 5 g 固定液1 0 0 0 mL 4 S N/ T 1 4 2 1 -2 0 0 4 附录B ( 资料性附录) O I E / F A O今考实脸室判定标准 由于实验室之间对终点的确

16、定会有不同， 或不同操作人员之间对病毒定量和血清稀释以及使用的 试 剂不同， 因而常会 造成试 验结果的 差异， 所6: ! 各 实验室可 通过O I E / F A O世界F M U参考实脸室提供 的标准试剂做参考来建立 自己的标准. O I E / F A O参考实验室判定标准为: 在 5 0 %终点， 血清与病毒混合液中血清的总稀释度为 1: 4 5 或 1， 4 5以上为阳性; 1， 1 6 至 1， 3 2 为可疑, 1 : 1 1 或小于1: 1 1 为阴性。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/