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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N f T 1 3 7 7 -2 0 0 4 从精液中分离马病毒性动脉炎病毒 试验操作规程 P r o t o c o l o f t h e i s o l a t i o n o f e q u i n e v i r a l a r t e r i t i s v i r u s f r o m s t a l l i o n s s e me n 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布 2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 S N/ T 1 3 7 7
2、-2 0 0 4 前言 本标准的附录A是规范性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国山东出人境检验检疫局. 本标准主要起草人: 梁成珠、 朱来华、 王树锋、 王丽。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 3 7 7 -2 0 0 4 从精液中分离马病毒性动脉炎病毒 试验操作规程 范围 本标准规定了从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验方法。 本标准适用于从精液中分离马病毒性动脉炎病毒。 2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 1 E A V: 马病毒性动脉炎病毒。 Z ME M: 含非必需氨基酸的细胞培养液。 仪器设备 么23
3、 3 . 1 超净工作台或生物安全柜。 3 . 2 二氧化碳培养箱。 3 . 3 倒置显微镜。 3 . 4 液氮贮存罐。 3 . 5 蔡氏滤器和微孔滤膜( 0 . 2 2 ja m) , 3 . 6 蒸汽消毒器。 3 . 7 微量细胞培养板( 9 6 孔) 。 3 . 8 微型振荡器。 3 . 9 可调微量移液器和吸嘴( 2 0 0 K L ) , 3 . 1 0 电子天平( 0 . 1 m g -2 0 0 g ) , 3 . 1 1吸管( 1 mL , 2 mL, 5 mL, 1 0 mL) , 试剂 4 . 1 抗生素贮存液。 4 . 2 7 . 5 % 碳酸氢钠溶液。 4 . 3 细胞
4、消化液( 0 . 0 2 % E D T A) 。 4 . 4 标准病毒株和细胞系: 一1 9 6 C ( 液氮) 冻存备用。 4 . 4 . 1 标准病毒株: 马病毒性动脉炎病毒( E q u i n e A r t e r i t i s V i r u s , E A V ) B u c y r u s 株。 4 . 4 . 2 细胞系: 兔肾细胞( R K - 1 3 ) , 4 . 5 细胞培养液和细胞维持液。 4 . 6 1 %细胞染色液。 4 . 7 7 . 5 %梭甲基纤维素。 5操作方法 精液 采集 准备干净、 无菌的采精管( 如假阴道、 阴茎套) 。采精管不得含有防腐剂或消
5、毒剂。 S N / T 1 3 7 7 -2 0 0 4 5 . 1 . 2 采集精液时可同时采两份， 也可在不同时间各采一份， 应采集含精子量多的部分( 射精中期) 作 为待检样品进行病毒分离。 5 . 1 . 3 采精后， 应立即将含精液的采精管放人碎冰中或冰盒中， 尽快送到实验室。如果不能及时送实 验室， 可将精液暂时冷冻于一2 0 以下保存( 不超过 7 d ) ， 冷冻精液不影响病毒的分离。 5 . 2 病毒分离 5 . 2 . 1 将精液进行预处理， 超声波裂解三次， 每次1 5 S . 5 . 2 . 2 在 4 下1 0 0 0 g 离心 1 0 m i n ， 沉淀精子细胞。
6、 5 . 2 . 3 上清液用维持液做 1 0 - 1 - 1 0 - 3系列稀释， 接种于已长成单层的R K - 1 3细胞瓶或细胞培养板上， 每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照， 单层细胞仅加维持液做细胞对照， 用 6 0 倍 稀释的标准病毒接种做阳性对照。 5 . 2 . 4 加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层。 5 . 2 . 5 在 5 %二氧化碳恒温恒湿二氧化碳培养箱中孵育1 h . 5 . 2 . 6 加人含 0 . 7 5 0 0 竣甲基纤维素的培养液， 再培养。 5 . 2 . 7 培养 2 d - - 6 d 后， 在显微镜下观察 C P E情况( 细胞圆缩、
7、 脱离、 裂解) 。 5 . 2 . 8 如果不出现 C P E ， 应盲传一次， 即将细胞培养物冻融两次， 再接种到单层细胞培养 5 d - - 7d后， 用细胞染色液( 工作液为 。 . 1 %福尔马林缓冲结晶紫溶液) 染色。 5 . 2 . 9 用微量血清中和试验或其他方法对分离的病毒进行鉴定。 6结果判定 检查各种对照试验， 细胞对照正常， 无 C P E ; 阳性对照出现明显的 C P E ， 说明试验成立。如果试验 组出现明显的C P E， 表现为细胞圆缩、 脱落、 裂解， 则判为病毒分离阳性; 如果没有明显的C P E, 结晶紫 染色后， 细胞单层出现细胞壁不完整的死细胞区域，
8、也判为病毒分离阳性。如果分离的细胞培养物能被 E A V阳性血清中和或其他方法， 则分离的病毒为E A V. S N/ T 1 3 7 7 -2 0 0 4 附录A ( 规范性附录) 试剂的配制 A . 1 抗生素贮存液 用灭菌蒸馏水配成每毫升含 1 0 0 0 0 l u青霉素和 1 0 m g链霉素的抗生素贮存液， 用微孔滤膜 ( 0 . 2 2 p m) 过滤除菌， 分装成2 mL / 瓶， 一2 0 冻存备用。保存期不超过 6 0 d , A . 2 7 . 5 %碳酸氢钠溶液 7 , 5g 碳酸氢钠溶解于 1 0 0 m L蒸馏水， 用微孔滤膜( 0 . 2 2 p m) 过滤除菌，
9、 分装成2 mL / 瓶, 4 冷藏 备用。保存期不超过 6 0 d , A . 3 细胞消化液( 0 . 0 2 % E D T A) E D T A( 乙二胺四乙酸二钠: V e r s e n s e ) ( A. R . ) 0 . 2 g 氯化钠 ( A. R . )8 . 0 g 氯化钾 ( A . R . )。 . 2g 磷酸氢二钠( A . R. )1 . 1 5 g 磷酸二氢钾( A . R . )。 . 2g 加双蒸水至1 0 0 0 m L ， 充分溶解， 分装成小瓶， 1 1 5 高压灭菌 1 0 min , 4 冷藏备用。保存期不超 过 9 0 do A . 4 细胞
10、培养液和维持液 细胞培养液: 含 1 0 %灭能的无菌胎牛血清( F B S ) 的ME M培养基。 细胞维持液: 含2 %灭能的无菌胎牛血清( F B S ) 的ME M培养基。 细胞培养液和维持液均用微孔滤膜( 0 . 2 2 p m) 过滤除菌， 分装成小瓶， 4 冷藏备用。保存期不超 过6 0 d 。 使用时加1 % 抗生素贮存液( 终浓度为每毫升M E M培养基含1 0 0 1 U和1 0 0 u g ) ， 并用7 . 5 % 碳 酸氢钠溶液调 p H值至7 . 0 -7 . 2 . A . 5 5 %结晶紫贮存液 2 5 g 结晶紫粉溶解于4 7 5 mL纯乙醇， 再定容至 5
11、0 0 mL ， 过滤除去结晶。 A . 6 1 %细胞染色液 5 %结晶紫贮存液 1 0 0 mL 、 生理盐水( 0 . 8 5 氯化钠) 3 7 5 mL 、 福尔马林( 含4 0 %甲醛) 2 5 mL混匀， 分装成 5 m L一瓶, 4 保存备用。保存期不超过 9 0 d e A . 7 5 梭甲 基纤维素 竣甲 基纤维素粉7 . 5 g 溶解于1 0 0 m L双蒸水， 充分搅拌混匀， 1 2 1 0C 高压灭菌 1 5 m i n ， 分装成 5 mL 一瓶， 4 保存备用。保存期不超过 3 0 d , *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或
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