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1、SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 S N/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 昏 眩 病 诊 断 操 作 规 程 P r o t o c o l o f d i a g n o s i s f o r w h i r l i n g d i s e a s e 2 0 0 4 - 0 6 - 0 1 发布2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 中华人民共和匡 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 婿 S N/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 月U吕 本标准的附录 A, 附录C, 附录 D均为规范性附录， 附录 B为资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会
2、提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国珠海出人境检验检疫局。 本标准主要起草人: 吴小伦、 薄清如、 黄建珍、 赖子平、 兰乃洪。 本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 S N/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 昏 眩 病 诊 断 操 作 规 程 范 围 本标准规定了昏眩病的诊断操作规程。 本标准适用于进出口继缚 鱼的昏眩病检验检疫。 2 材料 2 . 1 仪器设备 普通天平， 分析天平， 普通离心机， 微型振荡器， 水浴锅， 振荡水浴装置， 普通显微镜， 血球计， p H试 纸， 研钵， 解剖刀， 镊子， 烧杯， 玻片， 离心管， 可调移液管等。 2 . 2 试剂 漂白粉
3、， 1 0 %福尔马林， 1 %孔雀绿， 7 0 %, 8 0 %, 9 0 %, 9 5 %, 1 0 0 %酒精， 二甲苯， 姬姆萨染色液( 见附 录 A ) , 胃蛋白酶液( 0 . 5 %)( 见附录A) , 酪蛋白酶液( 0 . 1 %)( 见附录 A ) , 0 . 1 m o l / L氢氧化钠， 1 0 %牛 血清蛋白， 磷酸盐缓冲液( P B S )( 见附录 A ) ， 甲醇， 丙酮。所有化学试剂均为分析纯。 昏眩病诊断 3 . 1 临床症状 病鱼作狂乱追尾运动， 特别当喂食或被惊吓时症状加剧。在冷水条件下， 旋转运动的临床表现通常 发生在感染后 2 个3 个月， 并可持续
4、长达一年。2 月龄8月龄的病鱼， 躯干后部和尾部呈黑色。昏 眩病后期的病鱼鳃盖骨萎缩， 鳃裸露在外， 下领骨畸形， 脊椎弯曲， 眼后头盖骨严重凹陷， 这种鱼染病三 年后仍带有病原体。 3 . 2 寄生虫检查 3 . 2 . 1 病原体形态 该病病原体为脑粘体虫( M y x o s o m a c e r e b r a L i s ) ,脑粘体虫的抱子大小为( 6 . 5 k m -7 t m ) X ( 7 . 5 p m- - - 8 E + m) , 微卵形， 侧面观似小扁豆; 有两个梨形极囊， 袍质中有两个圆形的胚核， 一条无缝合脊 的明显可见的缝合线， 无嗜碘泡 ( 参见附录B )
5、 , 3 . 2 . 2 采样 3 . 2 . 2 . 1 采样原则 选择有临床症状的鱼作寄生虫检查， 若无症状， 可根据鱼的数量随机抽样检查。 3 . 2 . 2 . 2 采样数皿 对有症状的鱼取5 尾1 0 尾作寄生虫检查， 或对无症状鱼群则按表 C . 1 进行抽查 3 . 2 . 3 涂片检查 3 , 2 . 3 . 1 将头部纵切开， 观察耳区软骨组织中有无胞囊( 乳白色， 直径为 1 mm-2 m m) , 3 . 2 . 3 . 2 若有胞囊， 取一小块胞囊放在载玻片上， 压碎， 用 4 5 。 倍6 0 0 倍显微镜检查， 观察是否有脑 粘体虫抱子 3 . 2 . 3 . 3
6、如果没有发现胞囊， 则从耳石区将软骨组织切开， 刮取内含物作涂片检查。左右耳石区都需 检查。 3 . 2 . 3 . 4 上述两项检查都未发现抱子， 可按 3 . 2 . 4检查。 3 . 2 . 4 涂片染色检查 3 . 2 . 4 . 1 将可疑鱼的头部割下并纵切开， 4 5 水中孵育 1 mi n -3 m i n ， 将松散的肉和脑移到一废物容 S N/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 器( 水和家用漂白剂比例为 1: 1 ) 消毒， 从脑壳、 耳石、 鳃拱处收集骨和软骨样。用等体积的 1 0 %福尔马 林于研钵磨碎样品。用水将所有磨碎样冲人小烧杯并使物质沉淀。 3 . 2 .
7、4 . 2 涂 5 滴 - 1 0 滴沉淀物到一干净的显微镜玻片上， 空气干燥。 3 . 2 . 4 . 3 1 %孔雀绿染色 5 mi n ， 流水冲洗， 并将玻片依次放置于 7 0 %, 9 0 %, 1 0 0 %酒精中各 3 0 s ， 脱水 脱色。 3 . 2 . 4 . 4 2 0 O X镜检。观察是否存在具有深绿色极囊的绿色卵形虫体口 3 . 2 . 5 切片检查 3 . 2 . 5 . 1 将头保存在 1 0 %的中性缓冲福尔马林液中约 3 d . 3 . 2 . 5 . 2 除去石灰质后， 流水冲洗 4 h - 5 h . 3 . 2 . 5 . 3 用 7 0 %, 8 0
8、 %, 9 5 %, 1 0 0 %酒精脱水， 其中 9 5 %, 1 0 0 %酒精重复两次。各级酒精脱水的时间 约4 5 m i n - - 6 0 min ， 然后用二分之一 1 0 0 %酒精加二分之一二甲苯脱水 3 0 mi n -4 5 mi n ， 再后人二甲苯 直到组织透明为止约 1 5 mi n -3 0 m i n a 3 . 2 . 5 . 4 用石蜡包埋。 3 . 2 . 5 . 5 切成5 1 c m-7 F c m的切片.姬姆萨染色( 见附录D ) , 3 . 2 . 5 . 6 2 0 O X 镜检观察抱子和营养体。 3 . 3 综合判定 3 . 3 . 1 出现
9、上述临床症状， 又检查到脑粘体虫的抱子或营养体， 则判定为昏眩病。 3 . 3 . 2 未出现上述临床症状， 但检查到脑粘体虫的抱子或营养体， 也判定为昏眩病。 S N/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 附录A ( 规范性附录) 试剂配制 A . 1 P T D法试剂的配制 A . 1 . 1 胃蛋白酶液( 0 . 5 %) : 5 . 0 g胃蛋白酶, 5 m L浓盐酸， 1L去离子水。 A . 1 . 2 酪蛋白酶液( 0 . 1 %) : 0 . 2 g E D T A, 8 . 0 g 抓化钠， 。2g抓化钾， 0 . 2 g 磷酸二氢钾， 5 . 0 g酪蛋 白酶, 1 . 5
10、 g磷酸二氢钠， 1 L去离子水。 A . 2 磷酸盐缓冲液( P B S ) 的配制 P B S 缓冲液( p H7 . 2 -7 . 4 ) : 8 . 0 1 g氯化钠， 0 . 2 0 g氯化钾， 0 . 6 1 g磷酸氢二钠， 0 . 1 9 g磷酸二氢 钾， 1 L去离子水。 A. 3 姬姆萨染色试剂的配制 A. 3 . 1 Gi e ms a原液 A . 3 . 1 . 1 称 3 . 7 5 g G i e ms a粉置研磨器中， 加少许丙三醇研磨， 研磨越细越好。 A . 3 . 1 . 2 将研细的 G i e m s a 加丙三醇移人 5 0 0 mL棕色瓶内， 丙三醇的
11、总量为 2 5 0 mL ， 用一定量甲醇 洗干净研磨器。 A . 3 . 1 . 3 摇匀， 置6 0 水浴锅 2 4 h或3 7 0 C 温箱 7 2 h ， 经常摇动。 A . 3 . 1 . 4 取出冷却后， 加甲醇总量至 2 5 0 m L混匀， 密封棕色瓶备用。贮藏时间越长， 染色效果越好。 A. 3 . 2 Gi e ms a染色液 用 p H7 . 0 -7 . 2的P B S 缓冲液， 将姬氏原液稀释为 2 %-3 %的比率。 S N/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 附录B ( 资料性附录) 病 原 虫 图 谱 B . 1 昏眩病病原体脑粘体虫抱子 矛。右 戈产 一一
12、 ， 路f花 一厂一 . ! 释履 气秒、 色几、 羲 ，:霖。六 焦二 。_ 1.- 图 B . 1 脑 粘体 虫抱 子 矍 B 2带极 生轴 丝的脑粘体 虫抱 子 图 B . 2 带极生轴丝的脑粘体虫抱子 s x/ T 1 4 2 0 -2 0 0 4 附录c ( 规范性附录) 采样数t 表 c. 1 采样数f 鱼 群 大 小 / 尾 s o1 0 0 S o o1 00 01 0 万 1 0万 以 上 应 取 样 本 数 / 尾 2 0 2 32 6272 73 0 附录D ( 规范性附录) 姬 姆 萨 染 色 D . 1 先用甲醇固定标本， 1 0 mi n , D . 2 将甲醇尽量
13、除去， 风干。 D . 3 将标本保持水平， 滴上 G i e m s a 染色液。染色 1 5 mi n -3 0 mi n ( 在染色过程中用水来冲洗数次以 便检查染色的程度。若染色过度， 则以酒精来褪色) D. 4用7 k冲浩后. 涌讨类离子A风千后封片_ *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/