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1、分光光度技术,分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的技术。,第一节 光学原理,把电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的射线排列，既为电磁波的波谱,电磁波谱,当光线通过某种物质的溶液时，透过光的强度会减弱。因为它分成了三部分： 一部分光在溶液的表面反射或分散，一部分被组成此溶液的物质所吸收，其余便是透过光的强度。即： 入射光=反射光+分散光+吸收光+透过光,“空白”校正：在检测过程中，若用蒸馏水或待测溶液的溶剂作为“空白”校正反射、分散等因素所造成的入射光的损失，则： 入射光(I。)=吸收光+透过光(I),分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含
2、量的技术。 吸收光谱（absorption spectrum）即物质对不同波长光的吸收程度不同而产生的光谱。 分子对各个波长的光吸收程度不同，这是分子的结构特性所决定的。,物质所发射的光是具有波粒二象性： 微粒性 波动性 E 为光子的能量；为光波的频率（Hz）；h为普朗克常数（6.626）； c为光速（2.9977108ms）；为光波的波长,光波具有一定的频率。不同单色光的颜色不同，即因其频率不同所致。 不同频率的光波在真空中的传播速度相同。根据光的速度(c)和频率(v)可计算出它的波长(入 ),物质的吸收光谱:在连续光谱中某些波长的光被物质吸收后产生的光谱被称作吸收光谱,包括分子吸收光谱和原
3、子吸收光谱。吸收光谱取决于物质的结构。,从一个有连续光谱的光源，逐步地分出各个波长的光，使其透过待测物的真溶液，测出其在不同波长时的光密度； 然后以波长为横坐标，光密度为纵坐标，就可以得到待测物的吸收光谱曲线； 由此找出其中吸收最强的波长，作为灵敏光波长对该物质未知液液进行定量测定。,曲线1-细菌叶绿素a；曲线2-叶绿素a；曲线3-叶绿素b；曲线4-藻胆红素；曲线5-类胡萝卜素,朗伯-比尔定律： I0：入射光强度 C:溶液浓度 b:液层厚度 I:透射光强度 T:透光度 A:吸光度 k:吸光系数,I0,I,朗伯-比尔定律的适用条件： 1.入射光为单色光。波长范围越大，单色光纯度越低，偏离越大；
4、2.溶液中邻近分子的存在并不改变每一给定分子的特性，即分子间互不干扰。 3.适用于分子吸收和原子吸收。,光谱分析技术的分类,分子吸收法: 可见与紫外分光光度法、红外光谱法 分子光谱 分子发射法: 分子荧光光度法 光谱技术 原子吸收法：原子吸收法 原子光谱 原子发射法：发射光谱分析法、原子荧光法等,第二节 紫外-可见分光光度计,分光光度计:能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器。 分析精密度高 测量范围广 分析速度快 样品用量少,根据使用的波长范围不同分为紫外光区、可见光区、红外光区以及万用（全波段）分光光度计等。,紫外-可见分光光度计：工作波段在200nm800nm的
5、分光光度计。其中： 200nm400nm为紫外光区。 400nm800nm为可见光区。 属于分子吸收光谱仪。,721 可见分光光度计,722系列 可见分光光度计,SP-756P紫外可见分光光度计,TENSOR系列红外光谱仪,光源,单色器,吸收池,检测器,显示系统,一、紫外-可见分光光度计的基本结构和工作原理,紫外-可见分光光度计的基本结构示意图,它包括5个基本部件：光源、单色器、吸收池、检测器和测量仪表,光源（light source）：提供入射光的装置。 要求: 1.能在所需波长范围的光谱区域内发射连续光谱； 2.有足够的辐射强度并能长时间稳定。 常用的光源有热辐射灯（钨灯、卤钨灯等），气体
6、放电灯（氢灯、氘灯及氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等。,几种常见光源比较,单色器（Monochromator）：是将来自光源的复合光分解为单色光并分离出所需波段光束的装置。,入射狭缝：限制杂散光进入； 色散元件：将复合光分解为 单色光，有棱镜和光栅两种； 准直镜：将来自色散元件的 平行光束聚集在出射狭缝上； 出射狭缝：将固定波长范围 的光射出单色器，可以限制 通带宽度。,吸收池（absorption cell）：是用来盛放被测溶液的器件。 在可见光区常用无色光学玻璃或塑料制作； 在低于350 nm的紫外区需用能透紫外线的石英或熔凝石英制作。 同一套吸收池的厚度、透光面的透射、反射、折射应严格保
7、持一致。 指纹、油污及池壁上的沉淀物都会影响吸收池的透光性能。,微型吸收池（Microdrill absorption cell） ：“光程/体积比”提高了近10倍。 多光路吸收池（Multipie-path absorption cell）：在吸收池壁上装有反射镜，使光线在溶液中经多次反射后才离开吸收池，大大增加了有效光程，提高了测定的灵敏度。,通过改进吸收池的几何形状，可提高“光程/体积比”，即尽可能延长单位体积的光程。常用的有：,检测器：把光信号转换为电信号的装置。 对检测器的要求： 1、产生的电信号与照射到它上面的光强有恒定的函数关系； 2、波长响应范围大； 3、灵敏度高； 4、响应速
8、度快，一般要求小于10-8s； 5、产生的电信号易于检测、放大，噪声低。,检测器工作原理,光照射在某些金属表面，会有光电子从金属表面逸出，这种光电效应称为外光电效应。 利用外光电效应可以制成光电管和光电倍增管。,光深入到物体内部，将物体内部原子中的一部分束缚电子激发成自由电子，但这些电子并不逸出物体，而是留在物体内部从而使物体导电性增强，称为内光电效应。 利用内光电效应可制成光敏电阻、光敏二极管以及光电池。,几种常用检测器比较,第三节 分光光度技术的应用,一、测定溶液中物质的含量 可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中物质的含量。 比色法： 这需要测定标准溶液(浓度已知的溶液)和未知液(浓度待
9、测定的溶液)的吸光度，将两者进行比较。 由于所用吸收池的厚度是一样的，可用下式进行计算。 Ax/As=KCxL/KCsL，即： Cx=AxCs/As 式中Cx代表未知液的浓度，Cs代表标准液的浓度，Ax和As分别代表未知液和标准液所测得的吸光度值，式中只有Cx是未知的，可由上式计算得之。,分光度法： 可以先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线. 然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。 含量测定时所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长，这样做有两个好处： 灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异； 可以避免其
10、他物质的干扰。,二、用紫外光谱鉴定化合物,使用分光光度计可以绘制吸收光谱曲线。 方法是用各种波长不同的单色光分别通过某一浓度的溶液，测定此溶液对每一种单色光的吸光度 以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标绘制吸光度波长曲线，此曲线即吸收光谱曲线。,各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定 当一种未知物质的吸收光谱曲线和某一已知物质的吸收光谱曲线形状一样时，则很可能它们是同一物质。,一定物质在不同浓度时，其吸收光谱曲线中峰值的大小不同，但形状相似，即吸收高峰和低谷的波长是一定不变的。,紫外光吸收是由不饱和的结构造成的，含有双键的化合物能表现出吸收峰。,紫外光吸收光
11、谱比较简单，同一种物质的紫外光吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。 除了特殊情况外，单独依靠紫外光吸收光谱不能决定一个未知物的结构，必须与其他方法配合。 紫外光吸收光谱分析主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。,第四节 分光光度法的误差,在分光光度法中，即使将各种因素都控制好，对于浓度过大或过小的样品，误差仍然很大。 浓度过大的样品，其吸光度过高，影响检测器的灵敏度，且读数标尺刻度的精度差，误差亦大，故难于准确。 浓度过低的样品，其吸光度小，则因与仪器本身因素有关，也容易引起检测器标尺上的读数误差。例如光源波动的影响：当光源强度改变1、吸光度为1.0时，只有0.4的
12、误差，但在吸光度为O.045时，则可产生9.6的误差。,实际上，在整个透光度(或吸光度)范围的不同部分均有不同的误差。 从理论上推算，相对误差的最小的部分在透光度为36.8处(或吸光度为O.4343处) 故通常认为测定值在吸光度0.200.80范围内(透光度为2065)误差较小，超出此范围，相对误差均会增大。,【注意事项】,1.仪器须安放在稳固的工作台上，不能随意搬动。严防震动，潮湿和强光直射。 2.盛装比色液时，约达比色皿2/3体积，不宜过多或过少。若不慎使溶液流至比色皿外面须用棉花或拭镜纸擦干，才能放入比色架。拉比色杆时要轻，以防溶液溅出，腐蚀机械。 3.千万不可用手或滤纸等物摩擦比色皿的
13、透光面。 4.比色皿用后应立即用自来水冲洗干净，若不能洗净，用5%中性皂溶液或洗衣粉溶液浸泡，也可用新鲜配制的重铬酸钾洗液短时间浸泡，然后用水冲洗干净，倒置晾干。,5.每套分光光度计上的比色皿和比色皿架不得随意更换。 6.试管或试剂不得放置于仪器上，以防试剂溅出腐蚀机壳。 7.如果试剂溅在仪器上，应立即用棉花或纱布擦干。 8.测定溶液浓度的光密度值宜在0.10.7之间最符合光吸收定律，线性好，读数误差较小。如光密度超过0.11.0范围，可调节比色液浓度，适当稀释或加浓，再进行比色。 9.合上检测室盖连续工作的时间不宜过长，以防光电管疲乏。每次读完比色架内的一组读数后，立即打开检测室盖。,10.
14、仪器连续使用不应超过2小时，必要时间歇半小时再用。 11.测定未知液时，先作该溶液的吸收光谱曲线，再选择最大吸收峰的波长作为测定波长。 12.721分光光度计的放大器暗盒及单色器箱处放有两个硅胶筒，检测室内放硅胶袋，应经常检查，发现硅胶变色，应更换新硅胶或烘干再用。 13.仪器较长时间不使用，应定期通电、预热。 14.仪器用完之后，须拔去电源，套上仪器罩。,紫外-可见分光光度计常见故障及排除方法,分光光度计常见故障包括光路、电路故障。 根据故障不同应采取不同的排除措施。 接通电源后，指示灯不亮，仪器不工作，可能是电路故障； 读数表不能调零（即0T）和不能置100T则可能是光路故障或微电流放大器损坏。,