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1、技术学院毕业论文（设计）毕 业 论 文（设计） 题 目 葛根黄酮的分离和纯化的研究 指导老师 专业班级 生物技术及应用0701 姓 名 学 号 2010年5月30 日II摘 要本研究通过静态和动态实验考察了四种树脂的吸附解吸能力，确定树脂X-5是分离葛根黄酮的最佳树脂；通过考察药液浓度，pH，洗脱溶剂，乙醇洗脱浓度等各种因素确定分离纯化的最佳工艺是：药液浓度为40mg/ml，将药液pH调至酸性条件下进行吸附，用70%乙醇作为洗脱剂。关键词：葛根总黄酮；大孔吸附树脂；药液浓度；乙醇洗脱浓度目 录引言11 材料和仪器.21. 1 实验材料 21. 2 实验仪器 22 实验方法 .32. 1 葛根黄
2、酮粉末的制备 32. 2 标准曲线制作 32 .3 大孔树脂的筛选 32. 4 最佳分离工艺的筛选 43 结果与分析.53. 1 标准曲线的绘制.53. 2 大孔树脂的筛选 53. 3 最佳分离工艺的筛选 84 结论.10参考文献 .11I引 言葛根为豆科植物野葛或粉葛的块根，有山人参之美称，其主要有效成分为葛根素、大豆苷、大豆苷元等异黄酮类化合物1。现代研究表明2：葛根总黄酮具有降低心肌耗氧量，增加冠状动脉脑血管流量，缓解心绞痛，抗心律失常，抗氧化，增强机体免疫力，生津止渴等多种药理作用，用于高血压引起的头痛、头晕、耳鸣等症状有明显疗效。我国湖南、广西、江西、山东及西南地区等均有丰富的葛根资
3、源。一、葛根黄酮类化合物的分离方法：1. 大孔树脂法：崔九成等3用大孔树脂分离葛根黄酮。将浓缩至1ml 相当于0.5g 葛根药材的提取物100ml，加入到50g 处理过的大孔树脂柱上，用蒸馏水洗至流出液色变淡，再用70%乙醇洗脱至无葛根素，洗脱液回收乙醇浓缩并蒸干即得葛根总黄酮，收率为药材总黄酮的84.58%。2. 盐析纯化法：将葛根粗提物加入蒸馏水后加热煮沸，冷却到室温过滤，再将滤液中加入NaCl后搅拌溶解，静置2d析出白色沉淀,在过滤出沉淀并用少量水洗涤，得葛根异黄酮纯品4。3. 铅盐沉淀法：李稳宏等5用铅盐沉淀法对葛根黄酮进行分离。将醇回流法所得浓缩物用95%乙醇溶解，加入饱和中性醋酸铅
4、溶液至不再有沉淀生成为止，过滤，沉淀用水洗23次，弃去滤渣，滤液与洗液合并。再加入碱式醋酸铅溶液，至不再有沉淀生成，将沉淀物干燥后悬浮于300ml 95%乙醇中，通入H2S脱铅。过滤后，沉淀用醇洗23 次，合并滤液与洗液，调pH为6.57.0，减压浓缩回收乙醇至50ml左右，转移至蒸发皿中，真空干燥，得总异黄酮为浅棕色粉末。铅盐沉淀法得到的成品中总异黄酮含量高，可达62.81% ，但其收率较低。二、大孔树脂吸附法6在各种分离纯化方法中，大孔吸附树脂法是因为其比较环保和低廉倍受欢迎。大孔吸附树脂是一种具有多孔立体结构人工合成的聚合物吸剂，是在离子交换剂和其它吸附剂应用基础上发展起来的一类新型树脂
5、，为用于固体萃取而设计。树脂一般为小球状，直径为0.20. 8mm之间，是依靠它和被吸附的分子(吸附质)之问的范德华引力，通过它巨大的比表面物理吸附而进行的。合成吸附剂有大的比表面积和类似活性炭颗粒的内细孔结构，这些多孔特性使之从水溶液中有效的吸附有机化合物。与其它溶剂萃取技术相比用合成吸附萃取剂能减少溶剂的使用量和增加操作的安全性。与其他分离纯化方法比较大孔树脂吸附法所具有的优点如下：1. 能缩小剂量，提高中药内在质量和制剂水平。 2. 减少产品的吸潮性。 3. 大孔树脂吸附技术能缩短生产周期，所需设备简单，免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工作，节约包装，降低成本，为中药进入国际市场创造了条件
6、。 本实验系统考察葛根总黄酮的纯化工艺，筛选出分离葛根总黄酮的最佳树脂，通过静态实验与动态实验优化分离纯化工艺。1 材料和仪器11 实验材料葛根(购于胡庆余堂)、乙醇、NaOH、HCl、葛根黄酮标准样品、D101树脂、AB-8树脂、X-5树脂、NKA-9树脂、大孔树脂柱12 实验仪器紫外分光光度计 SP1910UV 上海光谱仪器有限公司pH计 PHS-3C 上海精密仪器厂摇床 QYC-200 上海福玛实验设备有限公司旋转蒸发仪 RE-52 上海安亭电子仪器厂2 实验方法2. 1 葛根黄酮粉末的制备7-8将葛根用组织破碎机破碎成粉末，称取粉末20g，置于圆底烧瓶中，以固液比1:10加入75%的乙
7、醇200ml，80水浴提取3次，每次1.5h。收集提取液浓缩并干燥成粉末。2. 2 标准曲线的制作精密称取干燥至恒重的葛根素5mg，于25ml容量瓶中，加95%乙醇溶解并稀释至刻度精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9m1分别置于10ml容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀。以此溶剂做空白对照，在250nm处测定吸光度。2. 3 大孔树脂的筛选9-102.3.1 静态吸附取4种处理好的大孔树脂各10g，分别加入葛根水溶液30ml，放置于摇床中进行振荡，2h后分别取各树脂吸附后的溶液1ml，于250nm处测吸光度，计算各种树脂对葛根黄酮的吸附率11。2.
8、3.2静态解吸将静态吸附的树脂过滤抽干，加30ml70%乙醇解吸，放置摇床进行振荡，2h后分别吸取各解吸液1ml，于250nm处测吸光度，计算各树脂对葛根黄酮的解吸率。2.3.3 动态吸附取处理好的4种树脂各10ml于220cm的柱内，加葛根水溶液于柱顶，以3BV/h的流速进行动态吸附，收集流出液，按树脂床体积收集，于250nm处测吸光度计算黄酮含量，绘制各树脂的泄漏曲线。2.3.4 动态解吸取处理好的4种树脂各10ml于220cm的柱内，加葛根水溶液于柱顶，以3BV/h的流速进行动态吸附后，先用蒸馏水进行洗脱，再以70%乙醇以3BV/h的流速进行洗脱，按床体积收集，于250nm处测定吸光度，
9、计算乙醇洗脱液中总黄酮的含量。2. 4 最佳分离工艺的筛选12-132.4.1药液浓度的考察取葛根黄酮水溶液（总黄酮含量为40mg/ml）10ml，分别加水稀释0，5，10，15，20倍，于10g X-5树脂中进行静态吸附，放置于摇床中振荡，2h后分别取树脂吸附后的溶液1ml，于250nm测定吸光度，计算吸附率。2.4.2 pH的考察取葛根黄酮水溶液10ml，用1mol/l的HCl或1mol/l的NaOH调pH12，34，56，78，910，加于10g的X-5树脂中，放置在摇床上进行振荡，2h后分别取树脂吸附后的溶液1ml，于250nm处测吸光度。2.4.3 洗脱溶剂的考察 取葛根黄酮溶液10
10、ml，加于10g的X-5树脂中，置于摇床上振荡进行吸附后，分别用30ml水、乙醇、丙酮置于摇床上振荡进行洗脱，2h后取1ml解吸液在250nm处测定吸光度。2.4.4 乙醇洗脱浓度的考察取葛根黄酮溶液10ml，放于10g的X-5树脂中进行吸附后，分别用10%，30%，50%，70%，90%乙醇进行洗脱，放置于摇床上振荡2h后取各解吸液1ml，于250nm处测定其吸光度。3、结果与分析31 标准曲线的绘制以葛根浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线如下:表3.1 标准曲线吸光度(A)0.10.2260.3380.4850.6380.8060.9381.0881.186体积(ml)0.10.20
11、.30.40.50.60.70.80.9浓度(mg/ml)0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0140.0160.018 图3.1 标准曲线标准曲线为：y = 68.809x - 0.0388(R2 = 0.9967)3. 2 大孔树脂的筛选3.2.1 静态实验表3.2 4种大孔树脂对葛根总黄酮的吸附率与解吸率树脂种类吸附率(%)解吸率(%)NKA-990.432.8AB-898.933.8X-5 98.858.3D10169.141.6图3.2静态吸附和解吸率曲线从表3.2和图3.2可以看出从静态吸附和解吸的角度来看AB-8和X-5的静态吸附率和解吸率大于其他2种树
12、脂。3.2.2 动态吸附图3.3动态吸附泄露曲线表3.3 4种大孔动态吸附结果树脂体积树脂种类NKA-9AB-8X-5D10110.450.270.320.3620.560.340.380.4130.620.440.540.4840.980.610.660.5951.120.910.750.7261.251.370.991.0571.431.441.231.2381.461.491.331.2891.481.511.54101.531.56从表3.3和图3.3中可以看出AB-8、X-5和D101的泄漏点相近，与NKA-9相差较大。3.2.3 动态解吸表3.4 动态解吸结果树脂体积树脂种类NKA
13、-9AB-8X-5D10111.361.301.511.0321.511.441.781.1930.541.590.961.4140.460.710.840.8350.380.560.580.6260.340.480.50.4170.300.370.410.2280.240.29图3.4 动态解吸曲线从表3.4和图3.4中可以看出NKA-9的解吸能力最好，其次是X-5，再次是AB-8和D101。综合考虑树脂的吸附解吸性能，认为X-5分离葛跟黄酮效果好。3.3 最佳分离工艺的筛选3.3.1药液浓度的考察表3.5 药液浓度考察结果稀释倍数（倍）05101520吸附率(%)98.0099.8099.
14、9099.9299.93表3.6 单因素方差分析差异来源SSdfMSFP-valueF crit组间20030120030633.76.64E-095.318组内252.9831.61总计202839从方差分析表3.6中可以看出P0.01，说明不同浓度样液吸附量差异极显著。从表3.5中可以看出当药液稀释20倍时吸附率最高，可达99.93%，但药液不稀释也可达到98.00%，所以在生产实践中为了节约人力、物力，可以选择药液不稀释。3.3.2 pH的考察表3.7 药液pH考察结果pH12345678910吸附率(%)99.6099.6799.6699.1097.60从表3.7中可以看出当药液浓度在
15、酸性条件下其吸附结果比在碱性条件下好，但在酸性范围内其吸附率变化不大。3.3.3 洗脱溶剂的考察表3.8 洗脱溶剂考察结果溶剂水乙醇丙酮解吸率(%)0.133.25.6从表3.8中可以看出用丙酮洗脱效果较好，但由于丙酮有毒且价格较乙醇贵，所以综合考虑，我们选用乙醇作为洗脱溶剂。3.3.4 乙醇洗脱浓度的考察表3.9 乙醇浓度考察结果乙醇浓度(%)1030507090解吸率(%)1.122.402.374.034.01表3.10 单因素方差分析差异源SSdfMSFP-valueF crit组间55721557311.130.010295.318组内40068500.8总计95799从表3.9中可
16、以看出当乙醇浓度为70%时洗脱效果最好。在低于70%时解吸效果远不如70%时高，90%的乙醇效果虽然不错但是不符合经济的条件。从方差分析表中得知：0.01P0.05，说明不同乙醇浓度洗脱效果差异显著。4.结论通过不同大孔树脂对葛根黄酮溶液的静态吸附率和解吸率以及动态吸附率和解吸率的考察，最后确定大孔树脂X-5为分离葛根黄酮溶液的最佳树脂。再通过树脂X-5对葛根黄酮溶液进行静态吸附和解吸来筛选吸附和解吸的合适条件。选择从药液浓度，pH，洗脱溶剂，乙醇洗脱浓度这几个方面着手，利用静态吸附和解吸来考察最优条件。通过计算吸附率和解吸率的大小来确定各条件下的合适的范围。实验结果表明最佳分离工艺是：药液浓
17、度为40mg/ml，将药液pH调至酸性条件下进行吸附，用乙醇作为洗脱的溶剂，综合各因素考虑确定用70%的乙醇进行洗脱。参考文献1 郭建平, 孙茸荣. 葛根化学成分及临床应用研究概况J. 药学实践杂志. 1996. 14(3): 46-148.2 何惟胜. 葛根及其提取物冶疗心脑血管疾病的药理和临床研究进展J. 中医药研究, 2000, 17(3): 58-59.3崔九成, 蒙跃尤, 杨匀. 大孔树脂分离葛根黄酮研究J. 西北药学杂志, 1999，14(4): 54-55. 4 曾祥群. 葛根总黄酮提取工艺J . 食品工业科技, 2002, 21(3): 23-25.5 李稳宏, 李剑君, 高新
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