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1、目 录摘要.Abstract.第一章 绪论1.1 DNA生物传感器的概述 1.1.1 DNA生物传感器的研究原理 1.1.2 DNA生物传感器的分类1.2 DNA电化学生物传感器的概述 1.2.1 DNA电化学生物传感器研究原理 1.2.2 单链DNA在电极表面的固定化方法 1.2.3 电化学交流阻抗技术概述1.3 纳米材料在DNA电化学生物传感器中的作用1.4 本论文的选题背景，研究思路，研究目的和研究内容第二章 基于目标DNA诱导取代金纳米粒子的高灵敏度阻抗谱DNA 杂交传感器研究2.1 引言2.2 实验部分 2.2.1 试剂 2.2.2 仪器 2.2.3 金纳米的制备 2.2.3 电化学
2、阻抗谱DNA生物传感器的制备 2.2.4电化学测量方法2.3 结果与讨论 2.3.1 金纳米的表征 2.3.2 电化学阻抗谱DNA生物传感器的表征 2.3.3 PDNA的密度优化 2.3.4 电化学阻抗谱DNA生物传感器的线性范围和检出限 2.3.5 电化学阻抗谱DNA生物传感器的选择性2.4 结论第三章 基于纳米金表面电荷信号放大的电化学阻抗DNA生物传感 器的研究3.1 引言3.2 实验部分 3.2.1 试剂 3.2.2仪器 3.2.3 金纳米粒子和报告探针（DPDNA-AuNPs）复合物的制备 3.2.4 电化学阻抗谱DNA生物传感器的制备 3.2.5 电化学测量方法3.3 结果与讨论3
3、.3.1 金纳米的表征3.3.2电化学交流阻抗法表征DNA生物传感器3.3.3 信号增强溶液的选择3.3.4电化学DNA生物传感器的分析特性 3.3.4.1电化学阻抗谱DNA生物传感器的线性范围和检出限 3.3.4.2 电化学阻抗谱DNA生物传感器的选择性3.4 结论总结参考文献致谢攻读硕士期间的研究成果第1章 DNA电化学生物传感器的研究进展二十一世纪是生命科学世纪，在生命科学得到了空前的发展同时，就不能不提到被誉为人类生命科学史上最伟大工程的人类基因组计划(human genome project, HGP)。1985年美国科学家率先提出了人类基因组计划(human genome proj
4、ect, HGP)，于1990年正式启动。人类基因组计划被誉为人类生命科学史上最伟大工程。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。2002年2月12日，历时10年耗资20亿美元的人类基因组计划最终完成，并报道了99%的人类基因组序列，在20世纪，“人类基因组计划”与“曼哈顿原子弹计划”和“阿波罗计划”并称为三大科学计划，它将对生命科学和人类健康产生巨大影响。 生命科学是生物的生命过程为研究对象的，其中糖、蛋白质、核酸是涉及生命活动本质的三类重要生物分子，对这些物质进行测定和分析技术的发展，取决于人类的科学活动和技术实践。核酸是
5、所有生命体的遗传信息分子，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。两类核酸都是由单核苷酸组成的多聚物。核酸分子中的核苷序列组成密码，其功能是贮存和传输遗传信息，指导各类型蛋白质的合成。DNA是遗传信息的载体，许多人类遗传疾病的早期诊断是通过检测已知碱基序列的DNA是否出现变异来实现的，检测与疾病有关的变异对基因筛选、遗传疾病的早期诊断和治疗具有非常重要的意义 DNA(Deoxyribonucleic acid)，中文译名为脱氧核糖核酸。脱氧核糖、核苷酸和磷酸构成了DNA的基本单元，核苷酸由四种碱基组成：腺嘌呤A（adenine）、鸟嘌呤G（guanine）、胞嘧啶C（cytosine）
6、、胸腺嘧啶T（thymine）。Watson和Crick于1953年提出DNA分子为双螺旋结构1，是由两条平行而方向相反的互补核苷酸组成，是通过链间互补核苷酸中的氢键维持的，其中C与G及A与T可分别形成三根和两根氢键2。这种互补为DNA的测序带来了方便。DNA测序的目的就是测定它们的排列顺序，尽管基因组测序已经基本完成，但是大量物种的基因组序列仍未涉及，如何能进一步加快和简化DNA测序工作依然是一个具有挑战性的课题。 分子杂交技术3是利用分子之间的互补性对靶分子进行鉴别的方法，互补性具有序列特异性或形态特异性，它使两个分子彼此间结合，结合的形式包括RNA-RNA、DNA-DNA、DNA-RNA
7、、和蛋白质-蛋白质（抗体）。其中DNA-DNA是应用最多的一种核酸杂交形式。目前大多数DNA生物传感器都是建立在DNA分子杂交的基础上。随着人类对生命本质、生命过程、和生命体与其生存环境的认识不断深入，研究发展新的分析手段越来越重要。分析生物技术受到了大家的关注，而生物传感器（biosensor）便是其中一个重要的领域，它是一个典型的多学科交叉产物，结合了生命科学、分析化学、物理化学和信息科学及其相关技术，能够对所需要检测的物质进行快速分析和追踪。生物传感器的出现，是科学家的兴趣和科学技术发展及社会发展需求多方面驱动的结果，经过30多年的发展，已经成为一个涉及内容广泛、多学科介入和交叉、充满创
8、新活力的领域。生物传感器已经发展到活体测定、联机在线测定和多指标测定，检测的对象包括各种常见的生物化学物质，在化工、食品、环保和临床等方面均显示了广泛的应用前景。许多在过去被认为较难进行的科学实验也采用了生物传感器技术而变的容易。1984年，在华盛顿召开的国际生物工程年会上将生物传感器列为当代生物工程的重要领域之一。 1.1 生物传感器概述 生物传感器的构成包括两部分：分子识别元件和换能器。被分析物扩散进入固定化生物敏感膜层，经分子识别，发生生物学反应，产生的信息继而被相应的化学换能器或物理换能器转变成可以定量和处理的电信号，再经检测放大器放大并输出，便可知道待测物的浓度。构成生物传感器的分子
9、识别元件为具有生物活性的材料。根据分子识别元件的不同，将生物传感器分为七大类3，酶传感器（enzyme sensor）、免疫传感器（immunosensor）、组织传感器（tissue sensor）、细胞传感器（organelle sensor）、核酸传感器（DNARNA sensor）、微生物传感器（microbial sensor）、分子印迹传生物传感器（molecular imprinted biosensor）。1.1.1 DNA生物传感器的研究原理DNA生物传感器的基本组成和其它的生物传感器一样，不同的是分子识别元件为DNA，在传感器敏感元件固定一条含有十几到上千个核苷酸的单链DN
10、A(ssDNA)，在一定的条件下(包括一定的pH值，离子强度和适当的温度等)，作为分子识别元件ssDNA与另一条含有与其互补碱基序列的目标DNA发生杂交反应，结合成双链DNA(dsDNA)，从而实现分子识别的目的。换能器的作用是将DNA分子杂交后产生的变化转变成相应的电信号。根据杂交前后电信号的变化，推断出被检测的DNA。1.1.2 DNA生物传感器的分类DNA生物传感器依据换能器转换方式的不同，可分为三大类：压电晶体DNA生物传感器、电化学DNA生物传感器和光学DNA生物传感器。（一）压电晶体DNA生物传感器压电晶体DNA生物传感器包括体声波（BAW）和表面声波(SAW)传感器，体声波式是基
11、于压电效应的石英晶体微天平（QCM），是目前应用最广泛的一种压电晶体DNA生物传感器。Yoshio Okahata等人4用间接固定化方法（生物素一亲合素的固定化方法）和直接固定化方法将探针DNA固定在27MHz的镀金的压电石英晶体的电极上，此时质量增加，频率变小，加入目标DNA后，目标物与探针互补，质量继续增加，频率继续变小，当目标物完全与探针键合后，频率不再改变。这样通过频率的变化，利用压电DNA传感器来对杂交的整个反应过程的进行监测。如图1-1所示。Nilsson等人5也利用此原理实现了对目标DNA的检测。图1-1 QCM方法检测DNA Fig.1-1 detecting the DNA
12、with Surface plasmon resonance（二）电化学DNA生物传感器电化学DNA生物传感器可以分为无需杂交指示剂的电化学DNA生物传感器（直接电化学DNA生物传感器）和基于杂交指示剂的电化学DNA生物传感器,6.如图1-2所示。无需杂交指示剂的电化学DNA生物传感器是指直接由杂交引起的DNA界面的电化学性质的变化，Shim等人7证明了杂交后DNA修饰的导电聚合物的导纳明显改变，提出了一种基于测量阻抗的DNA传感器。基于杂交指示剂的电化学DNA生物传感器是指在DNA形成双链过程中选择适当的电活性物质来检测杂交的过程。Yi Xiao等人89将DNA探针的一端标记衍生的亚甲基蓝（
13、MB），通过检测杂交前后亚甲基蓝电化学信号的变化来表征杂交的过程。繁春海等人10采用三明治法，将捕获探针固定在电极表面，杂交以后的待测的长链DNA与标记有生物素的短链报告探针DNA和捕获探针发生杂交反应，标记有辣根过氧化酶（HRP）的亲和素与报告探针一端的生物素结合，加入H2O2和四甲基联苯胺后催化HRP。通过安培法来检测杂交的过程。如图1-2 所示。 图1-2 基于杂交指示剂的电化学DNA生物传感器 Fig.1-2 Sehematic of Basing on hybrid indicator of electrochemical DNA biosensor （三）光学DNA生物传感器 光学
14、DNA生物传感器采用光学换能器，根据所选光学和检测材料不同可以分为表面等离子体共振（SPR）DNA生物传感器、电致化学发光（ECL）DNA生物传感器、荧光DNA生物传感器等多种类型的光学DNA生物传感器。SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感,当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR谱（共振角的变化vs时间）能够反映与金属膜表面接触体系的化。检测DNA杂交是SPR技术最广泛应用之一11。电致化学发光DNA生物传感器是一种将电化学手段、化学发光方法和生物传感技术相结合的一种装置。将DNA链用Ru(bpy)32+衍生物标记后，用ECL检测，可以对DNA进行准确、灵敏
15、的测定12。荧光DNA生物传感是一种将荧光技术和生物传感技术相结合的一种检测DNA的装置，Rothberg等人13在探针DNA一端标记有荧光染料若丹明，由于单链DNA能够缠绕在金纳米表面，使其荧光淬灭。探针DNA和目标物杂交后形成双链DNA后，双链DNA表面带有大量的负电荷会排斥带负电荷的金纳米，此外双链DNA没有裸露的碱基，所以金纳米不能和已经杂交形成双链的DNA结合14荧光不发生淬灭。利用此原理可以检测目标DNA的存在。1.2 DNA电化学生物传感器的概述 与光学15及压电传感器16相比，电化学传感器因其具有高灵敏度、便携性、操作简单等优点获得了广发关注，目前已有多篇文献论述了DNA电化学
16、生物传感器以及他们的应用171819。1.2.1 DNA电化学生物传感器的研究原理 DNA电化学生物传感器是将单链ssDNA固定在电极表面（包括金电极、石墨电极、玻碳电极、碳糊电极）通过与样品溶液中目标DNA碱基互补来进行识别，通过检测电活性指示剂的电流变化，或者由于双螺旋结构的形成而产生的电、界面性质的变化来检测杂交反应的发生。DNA电化学生物传感器检测靶DNA 的过程包括：ssDNA 固定、杂交、杂交指示和电化学信号（电流、电压、电导或电化学阻抗）的检测，如图1-3所示。图1-3 DNA电化学生物传感器制作主要步骤 Fig.1-3 DNA electrochemical biosensor
17、 making main steps 1.2.1 ssDNA探针的固定 在制作DNA生物传感器过程中，首先应该考虑探针DNA的固定。探针DNA在电极表面的分布、密度及排列的方向对传感器的性能有很大的影响20。目前有很多表面表征技术，如XPS21,表面等离子共振22，计时库伦23和中子反射等技术都能够提供非常有用的有关DNA在电极表面的分布信息。探针的固定化方法包括吸附法、分子自组装法、共价键合法、亲和素生物素反应系统等方法。（一）吸附法 吸附法是将DNA 固定在电极表面上的一种最简单的方法，可分为直接吸附2425和电化学吸附。可用于直接吸附法的电极材料有：硝化纤维、聚苯乙烯、尼龙膜、金属氧化物
18、表面或碳/碳糊传感器。该方法操作简单，所需时间短。但是这种方法存在的缺点是：在与目标目DNA杂交过程中探针DNA有可能从电极的表面脱落，而且DNA在电极表面的排列杂乱无序，会降低杂交效率。电化学吸附法是通过施加一定的电位将探针DNA吸附固定在碳糊电极或丝网印刷电极上，Wang等26将新抛光的碳糊电极在+1.7V( Ag/AgCl参比电极)下处理1min后，然后在搅拌的含有单链DNA的溶液中在+0.5V电位下电化学吸附2min，施加一定的电势后，电极表面带有正电荷，可以与带有负电荷DNA磷酸骨架通过静电吸附作用使DNA更加稳定的固定到电极的表面。也有一些文献报道在玻碳电极的表面聚合一层聚吡咯膜，
19、插入含有DNA的酸性溶液中，单链或双链DNA可以牢固的吸附在聚吡咯膜上。（二） 分子自组装法 自组装法是指分子在基体表面自发组装成高度有序的单分子层，一般以金电极作为基体电极，金电极表面组装单链DNA是通过在单链DNA的5端修饰巯基，通过Au-S键作用使单链DNA分子成功的组装在金电极表面27，形成自组装单分子层，为了使DNA分子在金电极表面排列有序和减小电极表面的非特异性吸附，使用巯基己醇对金电极表封闭，这样有利于提高杂交的效率。后来发现将单链DNA和巯基己醇混合组装的方法282930 效果更佳。为了更加精确的控制DNA在金电极表面的覆盖度，提高信噪比，Joseph Wang等人31提出了一
20、种将巯基修饰的单链DNA和二硫苏糖醇混合组装到金电极表面，随后再用巯基己醇对其表面进行封闭如图1-4所示。比起前两种方法，不仅进一步减小了非特异性吸附，同时降低了检测过程中的背景电流。图1-4 单链DNA在金电极表面的自组装 Fig.1-4 Single-strand DNA in the gold electrodes surface self-assembly （三） 共价键合法 DNA 分子通过共价键固定到电极表面上的方法根据基底电极不同，固定方法不也不同。一般步骤是将电极表面进行活化处理，并使核苷酸衍生化带上合适的功能团，引入的活性基团如羟基、羧基、氨基等基团。然后用戊二醛( GA)
21、、马来酰亚胺(MA) 、对硝基苯氯甲酸酯(NPC) 、二异硫氰酸酯等双官能试剂（偶联活化剂）联结支持电极与衍生后的DNA。该方法可以提高单链DNA在电极表面的牢固度和耐用性。缺点是步骤复杂，操作费时。(四) 亲和素生物素反应系统固定法 生物素-亲合素系统 (biotin-avidin system，BAS)，是一种新型生物反应放大系统，亲和素与生物素具有非常强的专一性亲和力，亲和常数为1015 L/ mol。首先将亲和素通过静电作用或共价偶联固定到电极表面,随后将标记了生物素DNA分子 通过生物素与亲和素之间的专一性亲和作用而固定在电极表面。图1-5 亲和素生物素反应系统固定法Fig.1-5
22、Immobilization of Biotin-DNA on Avidin-Modified QCM Electrode1.2.2 交流阻抗技术概述电分析化学中存在着很多分析技术，循环伏安法、交流伏安发、方波和脉冲技术、极谱法、电化学阻抗谱法等方法。电化学阻抗谱法相对与其它方法来说是一种敏感的电化学测量技术，已成为研究电极界面和电极过程动力学重要手段，电化学阻抗谱法在电化学领域、生物学领域、物理学领域、材料学领域、金属腐蚀性能评价等都有重要的应用32。通过电极阻抗频谱和等效电路分析，电化学阻抗谱法容易给出电极界面和电极过程动力学的各种参数。这个技术还可以研究电极界面双电层结构、电极上的各种吸
23、附行为、半导体电极（例如掺杂浓度、平带电势）和半导体电极的光电转换行为、金属表面钝化膜和电结晶过程以及其他一些电极表面过程。331.2.2.1 交流阻抗技术基本原理交流阻抗法（AC Impedance），又称电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS），交流阻抗技术常用的是正弦波交流阻抗技术。控制电极电流（或电极电势）使按正弦波规律随时间小幅度变化，同时测量作为其响应的电极电势（或电流）随时间的变化规律。这一响应经常以直接测得的电极系统的交流阻抗Z或导纳Y来代替。电极阻抗一般用复数表示,即ZZ-jZ ,虚部常是电容性的,因此Z 前用负号。
24、测量电极阻抗的方法总是围绕解决测量实部和虚部这两个成分或模和相位角。其中Z称为电阻，即；Z称为电抗，=1/，其中为电容，为角频率，。电极的导纳是由导纳的实部Y和虚部Y组成。导纳是电极阻抗的倒数，即=1/Z。Y称为电导，Y称为电纳。利用电化学阻抗谱测量时有三个前提条件：（1）因果条件：测定的响应信号是由输入的扰动信号引起的。（2）线性条件：对体系的扰动与体系的响应成线性关系。通常情况下，该线性条件只能被近似的满足。（3）稳定性条件：在测量过程中电极体系是稳定的，扰动停止后体系回复到原先的状态。一个可逆电极的电极系统在受到扰动时，由于内部结构没有产生大的变化，受到小振幅的扰动后很容易回到原先的状态
25、。一个不可逆的电极过程只能近似的满足稳定性条件。（4）有限性条件：整个频率范围内多测定的阻抗或导纳值是有限的。1.2.2.2等效电路化学阻抗技术中最重要的是找到拟合很好的等效电路，使该电路的阻抗谱与实验所测得的电极系统的电化学阻抗谱很好的吻合，并确定各电路元件值。电解池系统的电过程用各种元件如电阻、电容或电感L串、并联组成的电路进行模拟，这种用来模拟的电路称为等效电路，一个给定的等效电路表示一个给定频率下的电解池性能，因此被测体系的交流阻抗谱可由不同的等效电路进行描述，一般最常用的等效电路是Randles电路。电化学阻抗谱法的主要分析方法为等效电路法，施加相同的交流电压信号，通过一个电解池的交
26、流电流与通过一个由电化学元件组成的电路的交流电流具有完全相同的振幅和相位角，这个电路就称为电解池的等效电路34。由电阻、电容或电感L串、并联组成的电路。一般可以用图1-6所示，Ret表示表面电子传递（转移）、电阻Rs代表溶液电阻、Cd1表示双电层电容、ZW 表示Warburg阻抗。Ret为工作电极表面电子传递电阻，RS为参比电极与被研究的电极之间的溶液电阻，Cd1为电解质溶液与电极两相之间的双电层电容，ZW为扩散过程引起的交流阻抗。 图1-6电化学池的Randles等效电路图Fig.1-6 Randles equivalent circuit for impedance spectroscop
27、y measurements in an electrochemical cell在实验过程中，如何选择合适的电解池的等效电路，要根据实验条件和被研究对象来决定，一个合理的等效电路图模拟曲线应该和实验所测得的电极系统的电化学阻抗谱很好的吻合。对于无浓差极化电极，电极的等效电路变为Cd1与Ret并联再与RS串联构成，如图1-7所示。如果把电位控制在被研究电极的理想极化区内，使电极上不发生电化学反应，则等效电路图可简化为RS和Cd1串联构成，如图1-8所示。RsRetCdl 图1-7 无浓差极化电极的等效电路图Fig.1-7 Equivalent circuit for non-concentra
28、tion polarization in electrode 图1-8 理想极化电极的等效电路图Fig.1-8 Equivalent circuit for non-Faradaic impedance spectroscopy measurements in the absence of the redox probe1.2.2.3 表示方法交流阻抗法可以通过Nyquist图、Bode图、导纳图、电容图和Warburg图等多种图谱表示，每一种图谱方式都有自己典型的特征，依据实验的需要和具体体系，可以选择不同的图谱形式进行数据解析。常用的电化学阻抗谱有奈奎斯特图（Nyquist plot）和波
29、特图（Bode plot）。Nyquist图谱也称为复平面阻抗图，以所得阻抗值的虚部Z对其实部Z作图。Nyquist图谱是最常用的阻抗数据的表示形式，特别适用于表现体系阻抗变化的大小。根据图的形状，可大概推断电极过程的机理，计算电极过程的动力学参数。对于电化学极化和浓差极化电极同时存在的电极，其Nyquist图呈现为相连的半圆和斜线两部分，如图1-9所示。图 表明电极过程受电荷转移和扩散步骤混合控制的电极交流阻抗复平面图，由高频区的半圆和低频区一条与横轴夹角为45的直线组成，当电极的可逆的程度越高时半径越小，并且45的直线出现的越快。 图1-9电极阻抗的Nyquist图Fig.1-9 Sche
30、matic Faradaic impedance spectra presented in the form of a Nyquist plot对于一个无浓差极化电极，其Nyquist图为一半径为Ret/2的半圆，如图1-10所示，该图表明电极过程是受电化学极化控制的。 图1-10 无浓差极化的Nyquist图Fig.1-10 Nyquist plot for non-concentration polarization对于理想极化电极，其Nyquist图为一条距Z轴为Rs, 且垂直于实轴Z的直线。由直线在Z轴上的交点到原点的距离，可以求得溶液电阻Rs。1.2.2.4 交流阻抗技术在传感器中的
31、应用 电化学阻抗谱是一种有效的表征界面性质的分析方法通过多个参数来分析电极表面生物膜的形成及分子间相互作用的过程和动力学机理35可以与适配体传感器、免疫传感器、DNA生物传感器等多种传感技术结合来检测目标物。（一）适配体传感器 通过指数富集配基的系统进化技术（SELEX）筛选获得了适体（Aptamer）36如图1-11所示。由于适体与其目标物的结合具有高特异性和高亲和力，可以与生物大分子（蛋白质）、小分子物质（金属离子，小分子药物）等结合。近些年来利用适体的这些性质建立起来许多分析方法，如石英晶体微天平37、表面等离子体共振38、荧光、比色、电化学等方法，在这些方法中，电化学方法是最重要的一种
32、，在未来的研究中扮演着重要的角色。电化学方法中应用最广泛的电化学阻抗谱法。OSullivan等人39将巯基修饰过的凝血酶适配体通过分子自组装方式键合在金电极表面，当加入凝血酶后，凝血酶与固定在金电极表面的适配体的一个位点结合，此时电子转移阻抗值随着凝血酶浓度的增加而增大，许等人40应用同样的原理来检测IgE，王等41人用此方法来检测带有正电荷的溶菌酶，但是由于蛋白质分子的大小和表面电荷的影响在一定程度上限制了检测的灵敏度。董绍俊等人42建立了一种信号放大的阻抗谱适配体传感器。该方法很大程度上提高了检测灵敏度。 图1-11 SELEX筛选技术流程图 Fig.1-11 For the SELEX
33、enrichment process（二）免疫传感器 抗体和抗原能够特异性结合形成稳定的免疫复合物，将高灵敏度的传感技术和特异性免疫反应结合起来，用以检测抗原-抗体反应的生物传感器称为免疫传感器43。Behzad Rezaei等44将人体生长激素（HGH）固定在金纳米修饰的金电极表面，加入人体生长激素后，在电极表面形成了抗体-抗原复合物，通过循环伏安法(CV)，电化学阻抗谱(EIS)来表征不同修饰电极界面变化。固定抗体的电极与检测液中氧化还原电对Fe(CN)63-/4之间的电子转移阻抗值随着加入生长激素的浓度的增加而增大，从而通过电阻抗值的变化获得生长激素的浓度信息。本方法有望应用于疾病诊断和
34、临床医学的研究，取代有扩散性和危险性的放射免疫方法。（三）DNA生物传感器 基于电化学阻抗谱检测的DNA的传感器是一种非标记的电化学检测方法，为了提高DNA生物传感器的灵敏度、选择性和稳定性，今年来，各种纳米材料被用到了生物传感器的制作中焦奎等人45将聚苯胺纳米纤维（PANnano）掺杂到碳糊电极(CPE)中，制备成PANnano/ CPE电极，金纳米颗粒与碳纳米管混合修饰到PANnano/ CPE电极表面，即增大了电极表面积，同时降低了背景阻抗值，将探针DNA固定在该电极表面后，电极与检测液中氧化还原电对Fe(CN)63-/4之间的电子转移阻抗值明显增大，当加入目标DNA后，目标物与固定在电
35、极表面的探针发生杂交反应，电子转移阻抗值明进一步增大，并且随着目标物浓度的增加，电子转移阻抗值与目标物的浓度在一定的范围内程线性关系。该方法大大提高了检测的灵敏度。Bonanni等人46报道了一种基于碳纳米管和金纳米粒子作为信号放大剂的电化学阻抗谱检测猪流感病毒（H1N1）,原理图为1-12。图1-12 电化学阻抗谱检测猪流感病毒原理图 Fig.1-12 The principle of Electrochemical impedance spectroscopy testing swine flu virus 1.3纳米金在DNA生物传感器中的应用纳米技术的思想是1959年美国物理学家费曼（
36、Ferynman R.P）提出的，它是在1100纳米（1纳米=10-9米）尺度的空间内，研究电子、原子和分子运动规律和特性的崭新技术，当物质达到纳米尺度以后，就会表现出特殊的性能4748。由于纳米技术将最终使人类能够按照自己的意愿操纵单个原子和分子，以实现对微观世界的有效控制，所以被认为是21世纪一系列高新技术的产生和发展有极为重要影响的一门热点学科，被世界各国列为21世纪的关键技术之一，并投入大量的人力物力进行研究和开发。纳米技术本身具有小尺寸效应、量子尺寸效应、表面效应等特点而引起了人们的广泛关注。越来越多的人认识到了纳米技术的重要性。纳米材料在光电领域、生物工程、化工领域、医学与健康等方
37、面都有着潜在的应用价值，已经成为21世纪的核心技术。纳米粒子独特的物理、化学性质使其在生物传感方面具有广阔的应用前景4950。 为了提高DNA生物传感器的灵敏度、选择性和稳定性，今年来，各种纳米材料被用到了生物传感器的制作中5152 53。在生物分析中应用最广泛的是胶体金和半导体量子点纳米粒子，这些纳米粒子作为放大标记物及纳米粒子与生物分子的自组装产生极大的信号增强作用。这就为超灵敏的光学和电学DNA生物传感器的的构建奠定了坚实的基础54由于纳米金胶体有其独特的物理学性质、化学性质、高稳定性和生物活性等特性，被广泛应用在DNA生物传感器中。在制作DNA生物传感器时，一种方法是利用Au与DNA分
38、子上修饰的氨基或者巯基发生共价键和作用，使金纳米固定在DNA分子上；另一种方法是在合成金纳米的过程中加入一定量的修饰试剂使金纳米粒子表面带有特定的修饰集团来实现信号放大目的；通过电化学沉积法或者对电极表面衍生化来实现金纳米在电极表面的固定，从而增大电极的有效面积，提高检测的灵敏度。 金纳米粒子的粒径在520纳米时，金溶胶表现出酒红色，表面等离子共振吸收峰在520纳米55，当金纳米粒子聚集后由于粒子间距不同可导致光学性质的变化，应用此性质Elghannian等建立一种快速、简单的比色法对寡核苷酸进行检测56。实验选用两个修饰巯基烷烃的寡核苷酸探针1和2和一个目标寡核苷酸3，带有巯基的探针1和2与
39、金纳米粒子共价结合，探针1和2上的碱基不互补，经杂交后，寡核苷酸探针与目标寡核苷酸探针结合，形成双螺旋片段，随着杂交的进行，形成一个聚合网络，体系的颜色将随着纳米粒子在聚合网络中的距离改变而改变，因此可以通过颜色的变化来判断是否发生了杂交反应。此外Rothberg等建立了一种应用非标记纳米金基于静电作用的比色法来检测DNA的的方法57. 图1-13 金纳米在比色法中的应用Fig.1-13 Application of gold nanoparticle in colorimetry 基于金纳米粒子的的电化学DNA生物传感器在基因检测方面的应用引起了广泛的关注，通过阳极溶出伏安法58对纳米金进行
40、电化学检测（见图1-14），从而实现对目标DNA的间接检测。把目标DNA固定在聚乙烯微孔板的内壁，金纳米修饰的探针DNA与目标DNA杂交，随后加入HBr/Br2酸溶液，修饰在探针DNA上的纳米金被氧化溶解为Au3+，然后将丝网印刷电极进入到检测液中，利用溶出伏安法检测Au3+。图1-14基于金纳米粒子的电化学DNA生物传感器Fig.1-14 Schematic representation of the Au nanoparticle-based electrochemical detection of HCMV-amplified DNA 基于纳米粒子的电化学阻抗谱DNA生物传感器有很多种方
41、法59。本实验小组61将含有巯基修饰的探针单链DNA（PDNA）通过分子自组装的方法固定到金电极的表面，并用巯基己醇（MCH）对其表面进行封闭，随后加入带正电荷的金纳米颗粒，通过Au与单链DNA裸露的碱基8的共价键和作用及静电吸附作用，使纳米金键合到单链DNA上，此时Fe(CN)63-/4-向电极传质受到阻碍，电子传递电阻Ret值明显减小。目标DNA替换键合在探针DNA上的纳米金颗粒后，目标DNA与探针单链DNA杂交，纳米金被目标DNA替代，电子传递电阻Ret值明显增大，通过测量目标DNA结合前后Ret值的改变，对目标DNA进行定量测定，建立一个非标记、高灵敏度、高选择性、简单易操作的电化学阻
42、抗谱DNA生物传感器。 依据金纳米粒子具有高的比表面积可以固定大量的探针分子的特点，Luong等人62使用电化学沉积法将纳米金沉积在金电极的表面63电化学沉积法可以使金纳米粒子有序的排列在电极表面，通过改变沉积的条件来控制金纳米在电极表面的尺寸、密度和结构。有效的提高了DNA探针在金电极表面的固定量，同时使探针在电极表面的排列有序性有所增加。使用电化学阻抗谱法检测与G-C碱基的小沟槽可以特异性结合的抗癌药物和纺锤菌素，与A-T碱基的小沟槽特异性结合的诺加霉素，很大程度的提高了检测的灵敏度。与没有经过电化学沉积纳米金修饰的金电极相比，其检测限提高了20-40倍。 1.5 本论文的选题背景、研究思
43、路、研究目的和研究内容随着人类对生命本质的认识不断深入，如何在分子水平上阐明生命活动规律和生命现象的本质对现存分析方法和技术提出了巨大的挑战，因此发展新的检测技术，并研究建立简单的、有效的、高灵敏度、高选择性的科学技术将是解决这一问题的关键之一。因此，在本研究小组多年来对DNA生物传感器研究的基础上，本论文提出基于金纳米的电化学阻抗谱DNA生物传感器的研究课题。分别通过将带有正电荷的纳米金固定在探针DNA上和将带有负电荷的纳米金通过Au-S键作用固定在报告探针上，两种不同的方法来实现对目标物的检测。本论文的总体研究思路是以固定在金电极表面的探针DNA作为分子识别物质，建立两种不同的模型的DNA
44、生物传感器，探索简单的检测DNA的电化学传感器新方法，解决电化学阻抗谱DNA生物传感器中的背景信号高、灵敏度较低等基础性问题，建立高灵敏度、高选择性的电化学DNA生物传感器，解决基因检测、临床诊断等相关重要问题，为药物筛选、重大疾病的早期发现和诊断等生命科学中的重大研究提供新的分析测试方法。本论文的研究目的是探索简单、实用、高灵敏度的阻抗谱检测方法，对DNA不进行化学修饰，而直接固定在所期望的机制表面，以建立非标记、高灵敏度、高选择性的检测DNA的电化学方法，对临床检测和生物分析具有一定的应用前景，且对生命科学和生物传感器的发展具有重要意义。本论文研究工作是在国家自然科学基金“20805029
45、”项目的资助下完成的。围绕本研究目的，本论文拟从以下两个方面开展研究工作：（1）基于纳米金作为杂交指示剂的电化学阻抗DNA生物传感器的研究。金纳米颗粒与PDNA通过Au-N和静电吸附作用结合到一起，基于目标DNA和探针DNA之间的互补性替换键合在探针DNA上的纳米金颗粒的方法建立一个非标记、高灵敏度、高选择性、简单易操作的电化学阻抗谱DNA生物传感器。（2）基于纳米金表面电荷信号放大的电化学阻抗谱DNA生物传感器的研究。基于目标DNA和探针DNA之间的互补，将修饰金纳米的的报告探针与长链目标DNA中未与探针DNA杂交的部分杂交，建立了一种三明治模型，信号增强溶液中浸泡后AuNPs粒子表面的负电荷排斥Fe(CN)63/4的平衡电对，阻碍了平衡电对向电极表面进行电子传递。本文中我们所构建的传感器采用了三级阻抗谱信号放大的方法 第2章 基于目标DNA诱导取代金纳米粒子的高灵敏度阻抗谱DNA杂交传感器研究2.1 引言DNA具有存储和传递信息的功能，它控制了生物遗传、蛋白质的合成等诸多生命过程。DNA的总和就是基因组，人体遗传物质总和就是人类基因组，由大约30亿碱基对组成，分布在细胞核的23对染色体中。现代医学研究表明，人类疾病都直接或间接的与基因有关人类基因组蕴涵有人类生