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1、精品论文http:/超级稻“培矮64S/93-11”染色体片段置换系群体的构建及稻谷粒形相关基因的定位肖应辉1, 公杰1, 江玲1, 王春明1, 翟虎渠2, 吕川根3, 张文伟1, 邹江石3, 万建民1,2*1南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏省植物基因工程技术研究中心，南京210095；2中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；3江苏省农业科学院粮食作物研究所，南京 210014.*联系人E-mail：W， W摘 要: 染色体片段置换系是指一套以同一亲本为遗传背景，置换了供体亲本一个或少数染色体片段的系列株系所组成的群体。本研究以双亲均已完成测序的超级稻杂交组合为材
2、料， 构建了一套以“93-11”为遗传背景，包含供体亲本“培矮64S”染色体片段的置换系群体。通过 多代回交和基本均匀分布于全基因组的202个SSR分子标记辅助选择相结合，从不同世代中 筛选出118个单株，构成覆盖全基因组的置换系群体。基因型组成分析表明，各株系置换片 段数在116个之间，其中仅包含3个以下置换片段的株系有73个，包含49个片段的株系 有37个，其余8个株系包含10个以上的置换片段；供体亲本染色体片段占受体基因组的比率 株系间变幅为0.114.1%，平均3.01%，其中占总数80.5%的株系置换率小于5%。利用该群 体对稻谷粒形性状进行QTL分析，分别检测到与粒长、粒宽有关的Q
3、TL位点11和13个。本 文还对超级稻染色体片段置换系在杂种优势、基因精细定位和图位克隆研究上的应用意义， 以及在水稻高产育种实践上的利用价值进行了讨论。关键词:水稻染色体片段置换系SSR标记超级稻分子育种 中图分类号：1.引言农作物产量、品质等许多重要的农艺性状，多属于复杂的数量遗传性状1。近年来，应用 分子标记方法，对控制这些性状的QTL数目、染色体上的位置及遗传效应等方面的研究，取 得了一定进展2-3。然而，当前的研究报道多以F2、DH或重组自交系（RILs）群体为研究对象， 由于其遗传背景复杂，通过扩大群体或增加分子标记密度，仍难以从根本上提高定位的精确 性4-6，也难于对QTL进行准
4、确的效应估计和可靠的标记辅助选择，更不能实现QTL的分离克 隆。近年来，不少学者提出构建以同一亲本为遗传背景，置换了供体亲本一个或少数染色体 片段的系列株系所组成的染色体片段置换系群体7-10，利用该群体无需考虑其他基因组区域的 遗传效应，可大大提高对复杂农艺性状基因定位的精确性9-12。其次，在初级定位基础上，通 过利用含有目标QTL的染色体片段置换系和背景亲本建立F2次级分离群体及其高密度的遗传3精品论文图谱，能将QTL位点分解成单个的孟德尔因子，进而通过图位克隆技术分离目标基因13-15。“培矮64S/93-11”是我国利用两系法培育的第一个超级杂交稻组合 16。该组合1999-2002
5、 年在南方稻区种植面积约2.5106ha,现已成为长江流域杂交稻的主栽品种17。同时，中国科学 家相继完成了“93-11”和“培矮64S”的全基因组序列分析18。因此，本研究通过多代回交与SSR 分子标记辅助选择相结合，构建了一套以“93-11”为遗传背景，包含“培矮64S”染色体片段的置 换系群体，为水稻重要农艺性状的基因（QTL）精细定位和图位克隆及水稻杂种优势的遗传 学研究提供了新的基础研究材料。2.材料与方法2.1 材料.本研究所用实验材料为籼型杂交组合“培矮64S/93-11”及其衍生后代。“培矮64S/93-11”是国家杂交水稻工程技术研究中心和江苏省农业科学院合作培育的两系法杂交
6、水 稻组合。2.2 DNA 样品制备和SSR 分析.采用SDS 法提取叶片组织DNA ，提取程序在 Dellaporta等19方法基础上略作修改。提取的DNA溶解在TE缓冲液里，用MBA 2000 UV/VIS 分 光光度计(Perkin Elemer Co.) 检测其质量和浓度。每份DNA用重蒸馏水稀释成20 ng/ul的工作 液，4冰箱贮存备用。本研究选用的SSR分子标记其中有729对引物序列来源于SSR分子标记 数据库(http:/www.gramene.org/microsat)20-21，由大连TaKaRa公司合成。SSR分析参照Chen 等程序22，10 ul PCR反应体系包括：
7、10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 50uM dNTPs, 0.2uM引物, 0.5U Taq酶(TaKaRa, 大连) 和20ng DNA模板。扩增反应在PTC-200PCR 仪(MJ Research Inc.)上进行：94 预变性5 min；94 30s, 52-61 30s（因引物而异，大多 数引物采用55），72 1min，35个循环；72 延伸7 min。扩增产物加入2ul 指示剂后，用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，通过银染显色，银染根据Sanguinetti23方法进行。2.3 新SSR 分子标记的开发.根据日本粳
8、稻品种Nipponbare 基因组序列数据库（http:/www.gramene.org/japonica/mapview），利用目标染色体区段对应BAC克隆的序列信息， 对籼稻品种93-11的基因组序列数据库（http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST分析，找到 唯一对应的BAC 克隆。根据93-11相应克隆的序列信息，通过基于网络平台的软件SSRIT24 搜索其中包含10个以上简单重复的序列，并利用Primer 5.0软件在目标序列两端设计引物。自 行设计的24对SSR引物由上海BioAsia生物技术公司合成，其中3对在双亲表现多态性差异。2.4 表型性状调查.
9、2004年夏季，中选单株种植于江苏农业科学院实验基地（江苏南京），单本移栽。成熟期收获全部中选单株，种子自然充分干燥后各株系随机取20粒种子，用 游标卡尺分别测定稻谷长度、宽度，取平均值作为粒长、粒宽表型值，精确到0.02mm。2.5 置换系遗传组成分析.采用GGT软件对置换系群体的基因型组成进行分析25。标记间的遗传距离根据Temnykh和McCouch等发表资料确定20-21。供体亲本染色体置换片段 占受体基因组的比例，根据Young等26的方法计算。当染色体上2个连续的标记均为同一基因 型时，则假定其间的染色体片段基因型与之相同；当2个连续的标记为不同的基因型时，则假 定2标记之间的染色
10、体片段各有1/2与相邻标记基因型同。所有假定建立在标记区间不存在双交 换的基础之上。2.6 遗传分析方法.对各株系与背景亲本93-11的表型差异进行t测验，取P=0.05为统 计检验阈值。根据表型与背景亲本存在显著差异的置换系图示基因型分析结果，进行基因定 位。QTL命名遵循McCouch等的原则27.3.结果与分析3.1 SSR分子标记连锁图从1095对SSR引物中筛选到211对（19.3%）在亲本间表现出多态性（表1）。多态性标记 在不同染色体上的分布频率有一定差异，其中第9染色体最低，仅有11.6%；第7染色体相对较 高，达30.7%，可能与SSR标记在基因组的分布有关。从表现多态的21
11、1对SSR引物中,选择其 中在12条染色体上分布相对均匀的202个标记，构建了分子标记连锁图。该图谱覆盖全基因组1 595.7 cM，标记间平均间距为6.35 cM，最大间距20.1cM（图1）。上述的202个SSR分子标记（或部分），用于分析“培矮64S/93-11” BC3F1及其衍生后代单株基因型，筛选目标候选单株。表1 SSR引物来源及多态性标记在染色体上的分布频率Table 1 Frequency of distribution on the genome of SSR markers染色体引物来源 Source of SSR primer 多态性标记数目Chromosome公共数据
12、库Commentdata自行合成总计Design byTotal selfpolymorphism markerspolymorphism markers110729136240.176210424128250.19539722119210.1764542276180.23758324107180.1686741791150.165752052160.307870070170.242910012112130.11610301747130.27611621274120.16212721385190.224总计90319210952110.193Number of多态率Ratio of精品论文ht
13、tp:/Chr.1Chr.2Chr.3Chr.4Chr.5Chr.69RM4955.8OSR173.6 RM489 g3-51.1g4-00RM518RM1532.2 RM508RM46916.01.2BJ1-00516.51.9RM110RM183RM2115.212.1g3-68.8g3-93.610.11.1RM76.8RM232RM28210.58.4g4-611.43.6RM405 g5-45.412.1RM1907.0 RM4904RM233A g4-8ID331.24.31.14.13.86.7RM5496RM243RM583ID-5g1-15RM4492.45.26.312.1
14、g2-3g2-4 g2-5RM624716.02.6 5.2 ID-82RM307RM401 g4-1312.43.47.2 g5-7 g5-8g5-109.410.18.0RM402RM5277.311.2ID-6ID-583.2 g2-94.8 g2-103.7 RM5390g2-127.612.33H-1126.1g4-15 ID-8512.77.1g5-1410.4 g5-16g6-13g6-173.2 RM56.84.0ID-864.63.34.37.44.5RM306RM488 g1-28 RM24616.4g2-14g2-186.68.6g3-21ID75g3-266.63.81
15、2.4RM5749RM115510.38.7RM3437RM16412.05.26.4g6-20 g6-218.0g1-318.0 RM341g4-223.2 RM3663 g5-236.8g6-23ID993.6 RM297RM3023.8 RM32720.110.810.74.3RM1626.13.0 RM4864.210.5RM262 RM71176.6g4-253.4RM5770 g5-2710.04.28.713.0g1-39RM315 g1-448.04.72.1g2-25 RM263RM1385RM5262.63.74.96.02.63.8g3-33RM3117RM448RM46
16、8RM5712.4 RM7187RM4707.5RM54734.60.82.73.1RM274RM26 g5-29 g5-308.85.2g6-27g6-30RM439g1-4715.46.0 g3-382.1 RM227RM5548RM5301.2RM14819.02.1 RM208RM266Chr.7Chr.8Chr.9Chr.10Chr.11Chr.1213.8RM436RM1257.011.4RM152(CHR-8) RM68630.64.78.43.3g9-3 g9-4RM444RM2199.211.5ID-112 g10-39.62.13.7RM286RM7557RM3324.25
17、.38.8RM7102RM4A RM62889.93.3 RM69997.4RM296ID-486.8 ID119RM31334.0 ID121RM7003RM2146.9RM8020RM5246.4RM3114.0g11-66.28.811.04.9RM432RM6394RM61842.9 RM6208 RM60086.4RM254.8RM3109.211.42.48.21.9g9-14 g9-15ID-1108.03.45.26.1RM467 g10-12 g10-1312.85.6g11-9 g11-111.17.43.610.5RM101RM7102ID122ID1235.4RM368
18、93.4RM2422.3 ID-4911.6g12-1311.99.6RM2966RM455RM2344.96.317.0RM5808RM735612.74.0RM553RM189 g9-214.814.31.03.2RM271RM258RM228RM4968.76.24.8g11-15BJ11-013 BJ11-007RM2244.64.86.05.09.6 RM277 g12-15ID53RM5198.719.7RM1185.015.9RM149RM5493RM5901.6 g12-18 g12-1911.2RM12RM2484.0RM447RM264图1 用于构建染色体片段置换系群体的S
19、SR标记及连锁图谱Fig. 1 SSR markers and the linkage map used for genotype analysis for construction of chromosome segment substitution line population精品论文3.2 染色体片段置换系群体构建过程2000年，以“培矮64S”为母本，与“93-11”配制杂交组合，随后以“93-11”为轮回亲本分别 在南京和海南两地连续回交，获得BC3F1种子。自2002年夏季起，利用前述分子标记连锁图中 的部分或全部SSR标记，对培矮64S/93-11 BC3F1及其以后各世代单株
20、进行基因型分析，根据其 基因型特征，候选单株进一步回交或自交。各世代候选单株的选择标准主要有以下2条：1)每 个单株包含的供体染色体片段尽可能少；2)所有单株包含的置换片段覆盖供体亲本“培矮64S” 全基因组。中选单株继续回交或自交，并且逐代进行基因型分析和分子标记辅助选择。最终 从BC3F4、BC3F4BC1、BC3F5、BC3F3BC2、BC4F3、BC4F3BC1、BC4F4和BC4F2BC2等世代中选 择118个单株构成水稻染色体片段置换系群体（图2）。其中，由最少数目（67个）株系组成 的CSSL群体图示基因型表明，每条染色体由3-10个株系的供体片段所覆盖，所有染色体置换 片段基本
21、涵盖了供体亲本全基因组（图3）。培矮 64S 93-11F1 93-11Bc1F1Bc2F1 93-11 93-11Bc3F1Bc3F4Bc3F3Bc3F2 93-11Bc3F3Bc1 93-11Bc4F1Bc4F2 93-11Bc4F2Bc1Bc4F3SSR 分子 标记辅助 选择 93-11 93-11 93-11 93-11Bc3F5Bc3F4Bc1Bc3F3Bc2Bc4F2Bc2Bc4F4Bc4F3Bc1Bc3F5Bc3F6BC3F4BC1F1Bc3F3Bc2F1Bc4F2Bc2F1Bc4F5Bc4F3Bc1F1Bc4F4622,4,65,68,71,77,10258,83,84,85,
22、115,119,1216,7,57,63,94,95,104,10722,44,45,46,82,10327,28,32,33,34,35,38,40,49,53,56,70,75,76,79,80,81,87,88,89,90,91,96,98,101,112,113,114,1231,8,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,23,24,25,26,30,36,37,39,41,42,43,47,48,50,51,52,54,55,59,72,73,78,92,93,105,106,111,120,1223,5,10,11,29,31,60,61,64,66,67
23、,69,74,86,97,99,100,108,109,110,116,117,118图 2 置换系群体构建过程及其系谱图, 分别表示自交和回交过程Fig. 2 The breeding schedule of the chromosome segment substitution lines., indicates self-propagation and backcross, respectively图3“培矮64S/93-11”染色体片段置换系图示基因型Fig.3 Graphic genotype of candidate individuals of chromosome segmen
24、t substitution linesAHdenotes the genotype of 93-11、Pai64S and heterozygous type, respectively3.3 染色体片段置换系群体遗传组成分析采用GGT软件对118个单株的基因型组成进行分析。结果表明供体亲本染色体片段占受体 基因组的平均比率为3.01%，但在染色体间有一定差异，其中第2、5、7、8和10染色体的比率 都低于2.5%，而第11和12染色体的比率相对较高，2者均在4%以上，这可能与后者染色体上 标记密度相对较小有关。各置换系基因型组成分析表明，不同株系置换片段数在116之间，其中仅包含3个以下
25、置换片段的株系有73个，包含49个片段的株系有37个，其他8个株系包含的置换片段数大于10个(表2)。供体亲本染色体片段（包括纯合供体型与杂合型）占受体基因组的比率在不同株 系间的差异很大，变幅在0.114.1%之间，其中有95个（占总数的80.5%）株系的置换率在5% 以下。部分株系包含的染色体片段数较多，供体亲本基因型占全基因组的比例较大，其主要 原因是在染色体置换系群体构建初期，由于某些染色体区段未能检测到多态性SSR标记，导 致相应的供体染色体片段缺失；而利用新开发的多态性SSR标记对低世代单株补选时，候选 单株目标片段以外的其他基因组区域置换不彻底。精品论文表2各置换系遗传组成分析T
26、able 2 Genome compositions analysis for all chromosome segment substitution lines株系line置换 片段 segment供体基 因型%percent of donor株系line置换 片段 segment供体基 因型%percent of donor株系line置换 片段 segment供体基 因型%percent of donor株系line置换 片段 segment供体基 因型% percent ofsubstitutiongenomesubstitutiongenomesubstitutiongenomesu
27、bstitution donor genome164.53144.56110.69122.2221.73211.56232.49211.13119.63344.76388.5931614.14213445.46477.29410.3532.33546.16511.79511632.13644.86654.79621.67223732.16722.19777.5843.238116821.69852.9921.53910.56954.19911.31086.44043.87042.910043.41121.84132.5718710163.71242.14284.87232.210293.913
28、10.34332.17310.6103117.71420.54476.17432.210433.21520.74510.87563.610522.11620.84621.37632.210611.61721.34754.27721.810711.31820.64810.97811.110822.41987.64910.97986.510910.52010.75021.8804311097.92110.65131.68153.3111118.222108.95210.98276.2112332321.953688310.71131612.92488.35422.18411.311432.2252
29、1.25554.48520.911543.62611.6561613.48610.111631.82711.15721.68710.111721.82821.358108.58821.411833.32920.75920.38910.930336076.59054.13.4 稻谷粒形性状QTL分析两个亲本的粒长、粒宽值均存在显著差异，93-11的粒长、粒宽均大于培矮64S。在置换 系群体中，2个性状的表型均呈单峰连续分布，但偏向于大值亲本93-11，而且均有明显的超 亲分离现象，其中84%株系的粒长大于背景亲本93-11，近90%株系的粒宽小于背景亲本（图4）。对所有置换系与背景亲本进行差异显
30、著性分析，共检测到24个与粒长、粒宽有关的QTL位点。t测验表明，28个（占总数的23.7%）株系的粒长值在5%水平上显著大于背景亲本，而株系数 Number of lines9.069.309.539.7610.00 10.22稻谷粒长 Grain length株系数 Number of lines25201510502.342.442.532.632.722.822.92稻谷粒宽 Grain width株系数 Number of lines40353025201510503.303.483.663.844.024.20 稻谷长宽比值 Grain length-width ratio图 4
31、置换系群体稻谷长、宽及其比值的次数分布. Fig.4 Distribution of grain length and width and its ratio in chromosome segment substitution lines population仅有4个（占总数的3.4%）株系显著小于背景亲本，图 示基因型分析检测到11个与 粒长有关的QTL位点，分布 在除1、2、11和12以外的其 他8条染色体，其中9个位点 对粒长起增效作用，同时也 检测到2个使粒长减小的基 因位点。以其中4个QTL位点 为例，分析其在染色体上的 位置及其遗传效应（图5）。 qGL-3-1 纯合型植株表现为
32、 减效作用，使置换系稻谷粒 长降低0.17mm，但杂合型植 株谷粒长未发生显著变化（图5A）；qGL-3-2、qGL-4 和qGL-5均表现为显著的增 效作用，分别使谷粒长增加0.23-0.42mm （图 5B ）、0.13-0.61mm （图 5C ）和 0.23-0.48mm（图5D）。同时， 共检测到13个与稻谷粒宽有 关的QTL位点，分布在除1、3和11以外的其他9条染色体 上，其中10个是减效基因位 点，而分布在2、5和6染色体 上的3 个QTL 对粒宽起增效 作用。图5E、F、G和H分别显示了第2、4、6和8染色体上的QTL位点，qGW-2-1、qGW-4和qGW-8都显著减小稻谷
33、粒宽，各置换片段分别使粒宽降低0.17-0.23mm、0.2-0.23mm和0.2-0.46mm，其中qGW-8是具有显性效应的基因位点；而位于第6染色体上的qGW-6则对稻谷粒宽起增效作用，增加粒宽达0.33mm以上。RM282RM7117RM227RM227ABChr.3Line1183536C93-11qGL-3-126.828.9 Grain lengthcM9.74mm9.49mm*9.49mm*RM5749RM11559.66mmChr.3Line10241424093-11RM5548RM 4483.811.131.1RM468RM571RM148qGL-3-23.1 18.8
34、cMGrain length10.08mm*10.02mm*9.94mm *9.89mm *RM57709.66mmDRM3437RM164RM3663Chr.5qGL-5RM26RM274Grain lengthRM518RM8219Chr.4Line468893-11Grain lengthqGL-42.8 c5.325.3M10.27mm*9.79mm9.66mmLine cM586641405793-1118.08.716.514.97.810.14mm*10.12mm*10.02mm*9.89mm *9.89mm *9.66mmEFGH图5 与稻谷粒长、粒宽有关的QTL 基因型图示分
35、析. 黑色和划线方块分别表示纯合供体亲本 和杂合基因型置换片段；*，*，*，*分别表示在0.05,0.01,0.005,0.001 水平上差异显著； 图中各株系仅标示出与性状差异有关的染色体置换片段。Fig.5 Graphical genotype analyses of QTL conferring grain length and width.Black and line bars indicates: homologous donor and heterozygous type substitution segment, respectively. *, *, *, * indicate
36、s: significant levels at =0.05,0.01,0.005, and 0.001,respectively. The lines on this figure were only showed the substituted chromosome segment related to grain length and width.精品论文http:/4. 讨论4.1 测序亲本构建的染色体片段置换系群体在基因精细定位和图位克隆的应用优势日本学者以籼稻品种IR24和粳稻品种Asominori为材料，分别构建了互为背景的染色体片 段置换系群体28。国内也报道了一套包含29个株
37、系的单片段置换系群体，但分布于9条染色体 的置换片段仅覆盖水稻基因组23.47%29。本文首次报道一套基于亲本均已完成测序的超级杂 交稻染色体片段置换系群体，为基因精细定位和图位克隆提供新的研究材料。本研究利用该 群体对稻谷粒形性状进行了QTL剖析，共检测到24个与稻谷粒长和粒宽有关的QTL位点。目 前，笔者课题组正在构建F2次级分离群体以进行基因精细定位。另一方面，传统的图位克隆 技术，需要建立大片段物理图谱，通过染色体步移或登陆技术分离克隆目标基因30-31，该方 法费工费时，而且染色体步移可能还会受到重复序列阻碍导致无法继续。然而，基因组序列 数据库资源为分子标记开发和高密度遗传图谱构建提供了可能；同时，利用生物信息技术通 过基因预测和序列差异分析，将可能迅速发现并缩小候选基因范围。因此，利用该染色体片 段置换系群体进行基因精细定位，结合应用现代生物信息技术，