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1、不同浓度的三种精油对香菇POD、CAT及POD活性的影响 摘要：研究了不同浓度的肉桂精油、百里香精油和丁香精油对香菇保藏过程中菇体内的多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)及过氧化物酶(POD)酶活性的影响。探究这三种精油储藏香菇的最适浓度。实验结果：丁香精油具有较强的抗氧化和护色能力，肉桂精油次之，百里香精油抗氧化作用不强。综合三项酶指标与色泽和腐烂指数，储藏香菇的三种最适精油及浓度分别是：20l/L的肉桂精油、10l/L的百里香精油和10l/L的丁香精油。关键字：香菇、肉桂精油、百里香精油、丁香精油、多酚氧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶Effect of three different
2、concentrations of Essential Oils on Polyphenol Oxidase,Catalase and Peroxidase in Lentinus EdodesFood Quality and Safety, Grade 2009: YE Xin-yiInstructor: Professor Qin Wen Abstract: The effects of different concentrations of cinnamon oil, thyme oil and clove oil on the preservation process lentinus
3、 edodes of polyphenol oxidase(PPO),Catalase(CAT) and Peroxidase(POD) enzyme activity. To explore optimal concentration essential oil to storage lentinus edodes. The results showed that: Clove essential oil has strong antioxidant capacity and color protection, the second is cinnamon essential oil, th
4、yme oil antioxidant effect is not strong. Integrated three enzyme targets with color and decay index, three kinds of best oils and concentrations were: 20l/L of cinnamon essential oil, 10l/L of thyme essential oils and 10l/L of clove oil.Keywords: Lentinus Edodes；Cinnamon oil；Thyme oil；Clove oil；Pol
5、yphenol Oxidase；Catalase；Peroxidase1 前言香菇(Lentinus Edodes)又名香菌、冬菇。其营养丰富，产量大，市场广，栽培技术成熟，还有一定得保健功能和药用价值。例如，能促进人体对钙的吸收，可防止佝偻病，香菇素可降低人体内胆固醇含量，而香菇多糖可提高人体免疫功能，且具有保肝、防癌抑癌等作用，因此深受人们喜爱，是国内重点研究的抗癌资源植物之一1, 2，被誉为“菇中之王”3, 4。然而，采摘后的新鲜香菇，一方面旺盛的生理活动，导致菌伞开裂、褐变、老化而使营养物质快速消耗5；另一方面，香菇水分含量高，容易受到微生物的侵染而发生褐变和腐败，致使商品率降低6。在
6、储藏过程中如何有效保持鲜香菇的品质，备受关注7。冷藏保鲜、气调保鲜法和化学保鲜法是目前果蔬保鲜的主要方法，但这些方法存在一些不足，如低温冷藏可能导致果蔬产生冷害，且能耗较高；气调保鲜对设备要求较高，且气体组分的波动影响保鲜效果；化学杀菌剂的残留危害人类健康或产生抗药性，人们对食品安全的关注程度越来越高，研制无公害高效防腐保鲜剂成为迫切的需要。研究表明植物提取物中含有抑制病原微生物的成分，人们提出了利用植物中的抗菌物质对果蔬采后病害生物防治的设想并进行了大量研究8，植物精油类防腐保鲜剂成为一个研究热点9-11。植物精油(Essential Oils，EOs)是具有较强挥发性的植物次生代谢产物，一
7、般从中药和香辛料中提取，可用于食品、药品和化妆品行业，有杀虫、抗菌、抗真菌、抗氧化和抗癌的作用，获得了美国食品药物管理局安全的认可12, 13。目前，精油作为一种天然的绿色农药、环境友好型的生物防治试剂应用于果蔬14, 15 、肉类16、蛋17等的防腐保鲜中，有较为明显的效果18-20。国内外的学者在天然提取物在果蔬保鲜上的应用研究也较多10，如潘磊庆21等报道了丁香精油可诱导樱桃番茄的防御性酶活性升高。曾晓房22等研究得出肉桂精油对紫金春甜柑的贮藏保鲜有积极作用。王建清23报道，百里香精油对鲜切冬瓜具有明显的抑菌作用。精油类防腐保鲜剂被认为是食品添加剂研究领域最有前景的发展方向，是开发新型高
8、效果蔬生物防腐保鲜剂的重要途径。然而，精油对香菇的影响研究，鲜有报道，而通过查阅大量文献发现对果蔬采后病原菌抑制作用较强的植物主要有丁香、上苍子、百里香、肉桂、高良姜等。丁香既是香料又中药，具有抑菌作用，易挥发，无残留24，国内已有学者研究了丁香精油对果蔬的保鲜效果15, 25, 26。肉桂精油是一种林特产品27常用于饮料、糖果、香烟等食品28, 29。百里香精油具有很好的抑菌作用，其主要抑菌成分为百里香酚和香芹酚30。美国食品药品监督管理局(FDA)将百里酚和百里香植物都列为食品添加剂31，安全系数高。三种精油极具代表性，因此本实验选择了丁香、百里香、肉桂三种精油作为供试精油。而之所以选择香
9、菇多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)作为实验指标，是因为他们是香菇在采后的生理过程中主要的活性酶。其活性与抗病性有较密切的关系。PPO是导致香菇子实体褐变的主要酶，催化各种酚类物质氧化成醌类，再聚合成黑色素，酶活性被抑制有利于保持香菇的颜色、风味、营养32。而细胞内存在CAT、POD等抗氧化酶类，有清除活性氧自由基的能力，能在一定程度上对氧自由基的损害形成保护，酶活性被诱导有利于保持香菇性状和品质。本文重点探究三种精油的对香菇抗氧化特性的影响，为研究开发果蔬生物防腐保鲜剂提供借鉴。2 材料与方法2.1 供试材料供试精油：肉桂精油，百里香精油，丁香精油均购于吉安盛大
10、香料油有限公司，密封避光4冰箱贮藏。香菇：购自雅安市雨城区蔬菜批发市场，当天运回实验室进行分拣，选取菌盖呈茶褐色、菌褶纯白色、个体大小一致、无病虫害、无损伤的香菇进行保鲜试验。实验处理后装入18cm20cm、厚0.04mm的低密度聚乙烯(LDPE)保鲜袋，4冰箱贮藏。2.2 试剂与仪器2.2.1 主要试剂所用试剂除注明外，均为分析纯，水为蒸馏水或超纯水，洗涤用水为城市饮用自来水。磷酸钠、邻苯二酚、过氧化氢、愈创木酚和焦亚硫酸钠均为分析纯，成都科龙化工试剂厂生产。2.2.2 主要仪器ULT 138.3.v型超低温冰箱海尔公司BS210S型电子天平(1/10000)塞多利斯北京天平有限公司UV-3
11、200型紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司冷冻高速离心机Thermo公司2.3 实验方法2.3.1 样品处理预处理：当天运回实验室进行分拣，选取菌盖呈茶褐色、菌褶纯白色、个体大小一致、无病虫害、无损伤的香菇进行保鲜试验。实验处理后装入18cm20cm、厚0.04mm的低密度聚乙烯(LDPE)保鲜袋，4冰箱贮藏。经预试，各精油设置10L/L、15L/L、20L/L、25L/L 4个处理组，于室温（2025）下熏蒸处理。将香菇装入一定体积的密闭容器内，在密闭容器内放一培养皿，将11cm11cm的滤纸片固定在培养皿上，用移液枪将精油涂加在滤纸片上，精油不与菇体接触，立即密闭熏蒸。熏蒸3h后，将
12、香菇取出装入18cm20cm、厚0.04mm的低密度聚乙烯(LDPE)保鲜袋，封口保湿。处理后的香菇放置于4的环境中贮藏，每组250g。同时设置两组对照，一组以未加精油熏蒸的香菇作为对照CK1。另一组先用0.01%焦亚硫酸钠水漂洗香菇35min，再用0.1%焦亚硫酸钠浸泡30min，取出菇体，自然晾干装入保鲜袋中，作为对照CK2。每药剂浓度处理重复3次。贮藏期间每隔3d取一次样并进行氧化生理指标的测定。2.3.2 色泽变化与腐烂指数的测定每天观察记载菇体表面色泽变化，新鲜菇体呈灰褐色(0)，随后逐渐加深至棕褐色(+)，最后变为黑褐色(+)。按菇体腐烂面积的大小分为3级。0级无腐烂；1级腐烂面积
13、小于50%；2级腐烂面积达50%以上；按下式计算腐烂指数：腐烂指数=(腐烂级别该级别菇体个数)/(菇体总个数最高级别)2.3.3 多酚氧化酶(PPO)活性的测定：参考汤章城方法、现代植物生理学实验指南33 测定，略有改动。准确称取2.0g待测样品，并向其中准确加入17mL 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH6.4)制成粗酶液。取2.5ml 0.05mol/L pH6.4磷酸盐缓冲液与5.0ml 0.2mol/L邻苯二酚混合。25保温10min后快速加入50l酶液，立即计时，以蒸馏水为参比，在反应15s后开始记录420nm波长下的初始OD值，以后每间隔5s记录一次，连续测定OD值在3min内的
14、增加量，计算酶活力。每个处理至少重复三次。以每g样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO酶活力单位（U），单位为OD420/(min.gFW)。2.3.4 过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照植物生理学实验技术34的方法，略有改动。准确称取5.0g待测样品，并向其中准确加入5mL 0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.5)冷冻离心制成粗酶液。在指形试管中加入0.1ml酶液、2.9ml0.02mol/L H2O2溶液，以蒸馏水为参比，在反应15s时开始记录反应体系在240nm波长的OD240值，作为初始值，以后每间隔10s记录一次，连续测定OD值在1min内的增加量，重复3次。以每g样品每分钟吸
15、光度变化值减少0.01时为一个CAT酶活力单位（U），单位为0.01OD240/(min.gFW)。2.3.5 过氧化物酶(POD)活性的测定愈创木酚法，参照现代植物生理学实验指南33，略有改动。准确称取2.0g 待测样品，并向其中准确加入17mL 0.05mol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)制成粗酶液。在试管中加入2.6ml 2.5%愈创木酚和0.1ml 0.6% H2O2摇匀后置于30水浴5min，快速加入0.3ml酶液并开始计时，迅速倒入比色皿中，以蒸馏水为参比，记录反应体系在470nm波长的OD470值，作为初始值，以后每间隔5s记录一次，连续测定OD值在3min内的增加量，重复测定3
16、次。以每g样品每分钟吸光度变化值增加1时为一个POD酶活力单位（U）。3 结果与分析3.1 不同浓度的三种精油对香菇颜色和品质的影响表1 各精油处理下香菇的色泽和腐烂指数保鲜剂及浓度(l/L)CK1CK2肉桂精油百里香精油丁香精油00.1%101520251015202510152025色泽变色7912151591513141215129915d+18d+腐烂指数15d0.20.320.170.130.080.230.140.150.150.20.150.20.210.1718d0.380.660.280.290.270.420.20.330.210.230.30.330.50.44Table
17、.1 Lentinus edodes color and index of rotted against essential oils+表示棕褐色 +表示黑褐色在上表中，由腐烂指数和色泽变化可以看出，在贮藏后期，肉桂10l/L、15l/L、20l/L都有防腐效果，但10l/L的护色效果欠佳，香菇变色较为严重，20l/L的防腐和护色效果突出；百里香精油的护色防腐效果整体都较好；10l/L和15l/L的丁香精油防腐效果相差不大，但20l/L、25l/L的丁香精油护色能力弱，腐烂指数也较高；高浓度的肉桂和丁香精油在后期腐败情况比对照组CK1明显。总的来看，三种精油中有较好保鲜效果的有20l/L的肉桂
18、精油、10l/L、20l/L的百里香精油和10l/L的丁香精油。可初步推断精油对香菇有一定的毒害，毒害程度丁香精油肉桂精油百里香精油，这与前言中论述一致31。3.2 不同浓度的三种精油对香菇PPO活性的影响香菇在贮藏期间PPO活性的变化情况如下图1所示。可知，肉桂精油中，10l/L、20l/L两组在储藏的整个周期内均能有效抑制PPO活性，且效果优于对照组CK2；而25l/L的精油第一个活性高峰在第12d，比空白对照组推迟了6天；15l/L组在第12d出现第二个活性高峰，比空白对照组提前3天，且高于空白对照组，在贮藏后期15l/L的肉桂精油对PPO有诱导作用。说明适宜浓度的肉桂精油对香菇PPO有
19、抑制作用。A、B、C分别是不同浓度的肉桂精油、百里香精油和丁香精油与对照组的PPO活性变化图图1 不同浓度的三种精油对香菇PPO活性的影响Fig.1 Effect on PPO activity of lentinus edodes by three different concentrations of essential oil百里香精油，在前期（19d）各组都抑制PPO活性，但在后期（918d）不同浓度的百里香精油对PPO活性影响差异较大；各组在第12天的活性均高于对照组，而其变色也在12天开始出现；但实验组高于对照组活性的天数中，10l/L组最短，约2.5d，其次为25l/L组，约3d
20、，最多的为15l/L组，约为4.5d，这与第18d的腐烂指数相一致。说明百里香精油在在前期对PPO普遍有抑制作用，而在后期，百里香精油抑制能力减弱。丁香精油处理的各实验组香菇PPO活性在贮藏整个周期均处于被抑制的状态，在0-3d浓度梯度和抑制效果呈现出负相关关系。10l/L和15l/L相对平稳，20l/L在第9d上升，而20l/L也在第9d开始变色；25l/L组的抑制作用随时间有下降的趋势。说明低浓度丁香精油对PPO活性有很强的抑制作用。3.3 不同浓度的三种精油对香菇CAT活性的影响在果实成熟过程中，氧化作用不断加强，导致活性氧自由基累积，膜系统遭到破坏，有害的过氧化物积累。随着贮藏时间的延
21、长，抗氧化酶类的活性逐渐下降35，表明这些抗氧化酶类被激活清除氧自由基，一段时间后清除能力达到顶点，然后开始下降，这时白蘑菇的品质也相应地快速下降36。香菇在贮藏期间CAT活性的变化情况如图2所示。A、B、C分别是不同浓度的肉桂精油、百里香精油和丁香精油与对照组的CAT活性变化图图2 不同浓度的三种精油对香菇CAT活性的影响Fig.2 Effect on CAT activity of lentinus edodes by three different concentrations of essential oil由图2可知，在贮藏期间，三种精油处理的香菇CAT活性普遍表现为逐渐上升，达到峰
22、值后迅速下降的趋势，但不同精油的不同浓度表现出些许差异。而对照组CK2对CAT的活性表现为抑制作用。在前3d，肉桂精油对香菇有一定得诱导性，但在39d各组的诱导和抑制关系较为混乱，在第9d 15l/L和20l/L两组才达到了峰值，比对照组CK1延迟了3d；第9d之后，各组均呈现诱导性。15l/L和20l/L组别激活CAT的时间较迟，与之对应的在第15d的腐烂指数分别0.13和0.08，而对照CK1为0.2。这说明适宜浓度肉桂精油可以有效延长激活CAT清除氧自由基的时间，从而增强保鲜防腐的效果。百里香精油实验组中，除25l/L组推迟了6d出现活性高峰外，其余各组均同对照组CK1相同，在第6d出现
23、活性高峰；第11d之后，各组均呈现诱导性，而对比15-18天，10l/L、15l/L、20l/L组诱导CAT的下降程度，发现各下降了18.1%、29.1%和42.%。这说明百里香精油激活香菇产CAT的能力较弱，但低浓度百里香精油在保鲜后期，有较好的稳定性。丁香精油实验组中15l/L、20l/L、25l/L组均在第3d出现活性高峰，比对照组CK1提前3d，且15l/L、20l/L高于CK1，15l/L、20l/L、25l/L在前期均能诱导CAT的活性高峰提前出现，而10l/L组的活性高峰出现在第9d，推迟了3d；10天之后各组都呈现出诱导作用，均在第15d达到第二个活性高峰，此时腐烂指数差异不大
24、，15-18d，15l/L、20l/L组诱导能力下降严重。说明丁香精油有较强的诱导作用，较低浓度丁香精油可以有效延长激活CAT的时间，并保持较好的持久性。3.4 不同浓度的三种精油对香菇POD活性的影响 POD为植物体内专一的抗坏血酸过氧化物酶，能够催化组织中低浓度的过氧化物和H2O2氧化成其它底物，降低H2O2对组织的伤害作用，从而延缓果实衰老腐败，延长贮存期37, 38。香菇在贮藏期间POD活性的变化情况如下图3所示。A、B、C分别是不同浓度的肉桂精油、百里香精油和丁香精油与对照组的POD活性变化图图3 不同浓度的三种精油对香菇POD活性的影响Fig.3 Effect on POD act
25、ivity of lentinus edodes by three different concentrations of essential oil精油实验组果实中POD活性在整个贮藏过程中先缓慢下降，随后稍有上升，而后又缓慢下降，总体现出上升的趋势，说明精油对香菇POD活性的升高具有一定的抑制作用。贮藏前期（09d），对照组在3d，肉桂精油均在第9d，百里香精油中10l/L、20l/L在第9d，15l/L、25l/L在第3d，丁香精油中10l/L、15l/L、25l/L均在第3d分别出现了POD活性峰值，各精油组比对照组的CK1活性峰值低；整个过程中，肉桂精油组、百里香精油组和丁香精油组的
26、POD活性分别较对照组总体分别降低了20.94%，27.14%和24.82%。说明不同精油抑制POD程度有所差异，肉桂精油最弱，百里香精油最强。精油处理抑制POD活性的原因有待进一步研究。4讨论与结论不同浓度的肉桂精油、百里香精油和丁香精油对香菇的PPO、CAT和POD均有影响。10l/L、20l/L的肉桂精油、四个浓度的丁香精油均对香菇的PPO有很好的抑制作用，百里香精油在储藏前期对PPO有良好的抑制，但随着时间增长，其抑制作用减弱。三种精油都能诱导香菇的CAT，其中丁香精油最强，肉桂次之，百里香最弱，同时，15l/L、20l/L的肉桂精油、10l/L的丁香精油可以有效延长激活CAT清除氧自
27、由基的时间，从而增强保鲜防腐的效果，低浓度的百里香虽没有这种能力，但在保鲜后期，其有较好的稳定性。各精油对香菇POD普遍有抑制作用，百里香的抑制作用最强，肉桂最弱。综合三项酶指标与色泽和腐烂指数，储藏香菇的三种最适精油及浓度分别是：20l/L的肉桂精油、10l/L的百里香精油和10l/L的丁香精油。参考文献: 1姚杭海. 中国境内抗癌资源植物及其开发J. 生物学教学, 2005,30(5):7-10. 2史丽亚, 辛晓林, 杨立红, 等. 香菇多糖对力竭小鼠抗疲劳及保肝作用的研究J. 吉林农业大学学报, 2004,26(3):301-304. 3刘雅嘉, 李炜, 衣杰荣. 香菇多酚氧化酶酶学特
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41、值此论文完成之际，谨向辛勤培养我的导师致以忠心的谢意与诚挚的敬意。本论文的完成历时八个月，同时要感谢与我一起在奋战在实验室、朝夕相处的队友兰海波、杜云雷、王凯云和刘洋同学，论文的顺利完成离不开你们帮助和鼓励，感谢有你们与我同喜悦，共悲伤，一起品尝其中的酸甜苦辣。感谢朋友们四年来对我的关心与鼓励，理解与包容，愿同窗友谊之树长青。最后，我衷心感谢学校、学院为我们创造优良的学习环境，感谢各位老师的辛勤栽培，感谢父母的养育之恩，你们为我们的成学成才付出了大量心血。四年的求学生涯，让我已经对她产生了深厚的感情，这里的一切都将成为我一生中最珍贵的回忆。衷心祝愿川农越来越好！祝愿老师们和同学们身体健康、工作顺利！13