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1、Shaanxi University of Chinese Medicine硕士学位论文疏筋解毒汤干预PD大鼠黑质内质网应激的实验研究中文摘要目的：探讨疏筋解毒汤对帕金森病(PD)模型大鼠脑内黑质多巴胺能神经元内质网应激信号传导蛋白基因表达的调节作用。方法：采用向大鼠黑质内定位注射6-OHDA法制备PD大鼠模型。用正常SD大鼠作为空白对照组，并将造模成功的大鼠分为模型组、西药治疗组、疏筋解毒汤小剂量治疗组、疏筋解毒汤中剂量治疗组、疏筋解毒汤大剂量治疗组，共6个组。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法对各实验组大鼠黑质的CHOPmRNA、XBP-1mRNA表达进行分析，检测各个指标在各组中的
2、表达情况。结果：1、CHOPmRNA表达：中药组CHOPmRNA的表达从14d到60d的用药过程中，随时间的延长，CHOPmRNA的表达呈渐降趋势。且在14d、21d、30d、45d、60d 5个时间点均低于西药治疗组和模型对照组，有统计学意义（P0.01）。各组CHOPmRNA的表达在各个时间点均高于空白组。2、XBP-1mRNA表达：中药组XBP-1mRNA表达从14d到60d的用药过程中，随时间的延长，XBP-1mRNA表达呈渐升趋势。且在14d、21d、30d、45d、60d 5个时间点均高于西药治疗组、模型对照组，有统计学意义（P0.01）。结论：1、疏筋解毒汤能明显抑制内质网过度应
3、激时促凋亡因子CHOPmRNA的表达，从而对多巴胺能神经元凋亡有阻抑作用。2、疏筋解毒汤能明显促进未折叠蛋白反应信号传导通路的分子伴侣XBP-1mRNA的表达，从而保护多巴胺能神经元。3、疏筋解毒汤可以通过干预内质网应激保护帕金森大鼠黑质多巴胺能神经元。关键词：疏筋解毒汤；内质网应激；CHOP； XBP-1The experimental research of the endoplasmic reticulum stress in the rats substantia nigra intervened by shujinjiedu TangAbstractPurpose:Probing t
4、he adjusting effect of shujinjiedu Tang to the gene expression of the protein in the conduction of stress signal of substantia nigra dopaminergic neurons endoplasmic reticulum in the model rats infected by parkinsons disease.Methods:6-OHDA is injected into the substantia nigra of rats to make the mo
5、del rats. The normal SD rats are used as the blank control group. Also, the rats that are successfully modeled are divided into six groups, such as the modeling group, the western medicine treatment group, the little, medium and large dose treatment groups with shujinjiedu Tang. RT-PCR method is use
6、d to analyze the expressions of CHOPmRNA, XBP-1mRNA in the substantia nigra of each experimental group, and the expression conditions of every indicator is detected in each group.Results:1. The expression of CHOPmRNA: between the 14th day and the 60th day after the shujinjiedu Tang is used, the expr
7、ession of CHOPmRNA shows a descending tendency with the increasing of the time. Moreover, at the following five moment, such as 14th day, 21st day, 30th day, 45th day, 60th day, the expression of CHOPmRNA is lower than that of the western medicine treatment group and the modeling group, which has ce
8、rtain statistical significance. And the expression of CHOPmRNA in blank control group is lower than that of the other groups at the above five moments.2. The expression of XBP-1mRNA: between the 14th day and the 60th day after the shujinjiedu Tang is used, the expression of XBP-1mRNA shows a increas
9、ing tendency with the increasing of the time. Moreover, at the following five moment, such as 14th day, 21st day, 30th day, 45th day, 60th day, the expression of XBP-1mRNA is higher than that of the western medicine treatment group, the modeling group and the blank control group, which has certain s
10、tatistical significance. Conclusions:1. The expression of the pro-apoptotic factor CHOPmRNA can obviously been constrained by shujinjiedu Tang when the endoplasmic reticulum is over stressed. Therefore, the shujinjiedu Tang have some constraining effect to the dopaminergic neurons apoptosis.2. The e
11、xpression of the molecular chaperones XBP-1mRNA can obviously been promoted by shujinjiedu Tang in the conduction path of the unfolded proteins response signal. Therefore, the shujinjiedu Tang can protect the neurons.3. The dopaminergic neurons in the substantia nigra of the rats infected by the par
12、kinsons disease can be protected by shujinjiedu Tang via interfering its stressing of the endoplasmic reticulum.Key words:shujinjiedu Tang; stressing of the endoplasmic reticulum; CHOP; XBP-1目 录引言.1研究背景.31 西医对帕金森病的认识.31.1 PD的临床表现.31.2 PD的病理变化.31.3 PD的病因及发病机制. .31.3.1 遗传因素. .31.3.2 环境因素. .41.3.3 神经系统
13、老化. 41.3.4 氧化应激及自由及损伤. .41.3.5 兴奋性毒性作用.41.3.6 细胞凋亡.51.3.7 免疫功能变化.51.3.8 内质网应激.51.4 PD的现代治疗方法.71.4.1 药物治疗.71.4.2 细胞移植治疗.81.4.3 外科手术治疗.82 中医对帕金森病的认识.82.1 历代医家对颤证的描述.82.2 颤证的病因病机.92.3 颤证的辨证治疗.102.3.1 用针刺、灸法调理经络治疗.102.3.2 中药辨证施治.103 疏筋解毒汤药理研究.11实验研究.141 实验材料.141.1 实验试剂.141.2 实验仪器. 141.3 实验设计和技术路线.152 PD
14、模型大鼠的制备.172.1 实验动物分组.172.2 实验原理.172.3 模型制备.172.4 灌胃、取组织.183 RT-PCR分析CHOP、XBP-1的表达.193.1 主要试剂配制.193.2 引物序列设计.203.3 实验步骤.203.3.1 总RNA的提取.203.3.2 总RNA逆转录为cDNA.213.3.3 PCR扩增.213.3.4 电泳.223.4 实验结果.233.4.1 分析方法.233.4.2 疏筋解毒方对PD大鼠黑质CHOPmRNA表达的影响.233.4.3 疏筋解毒方对PD大鼠黑质XBP-ImRNA表达的影响.263.5 结论.303.6 讨论.31参考文献.3
15、2致谢.36疏筋解毒汤干预PD大鼠黑质内质网应激的实验研究引 言帕金森病(Parkinson，s Disease，PD)是一种常见于中老年的神经系统变性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态障碍为主要特征1。此外病人还可出现慌张步态、面具脸、小字征、吞咽因难、自主神经功能障碍和痴呆等表现。1817年英国医生James Parkinson首先描述了PD的一系列特殊症候群。本病目前尚无彻底治愈的方法，是目前医学还未能攻克的顽疾。据流行病学调查发现，其发病率有逐年增高并向高龄移动的趋势，我国帕金森病患病率约为160/10万2，在55岁以上的人群中患病率达到1，由此推算我国的患病人数约为
16、500-700万。最新调查显示：我国65岁以上人群中患病率达到1.7，接近美国2.1的患病率。由此可见，对帕金森病的防治具有重要的现实意义。近年来现代医学对帕金森病的研究取得了显著的进展。在PD发病机制上公认的学说有自由基学说、线粒体功能异常、兴奋性神经毒性作用、细胞凋亡、神经胶质细胞的免疫调节机制、内质网应激等。其中内质网应激是目前研究的热点。在PD治疗方面，临床上常用的药物有多巴胺补充剂、抗胆碱能药、抗组织胺药物、多巴胺受体激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、儿茶酚一氧位一甲基转移酶抑制剂、神经营养剂等。其中左旋多巴(L-dopamine ，LD)为治疗PD的首选药物，是目前检验治疗效果的“金标准
17、”，但该药无法阻止病程的进展，而且应用4-5年后效果明显下降，同时部分病人会出现“剂末”和“开关”现象，以及运动障碍、精神异常等多种严重副反应。除药物治疗外，临床上还采用立体苍白球切开术、外科立体定向丘脑外侧核损毁术、干细胞移植术等外科治疗方法。虽然部分手术病例疗效较好，但手术可能出现严重并发症，远期疗效不稳定且费用昂贵，胎儿黑质脑移植因需要多个胎脑在全球开展此方法较为困难。中医对本病的认识可以追溯到黄帝内经，并经后世医家的逐步完善已经形成较为系统的理论体系，疗效也得到了众多学者的认可。中医认为本病病位在筋或脑，基本病机为肝风内动，筋脉失养，总属本虚标实。本虚责之于肝肾不足、气血阴精亏虚、髓海
18、空虚，标实见于风、热、痰、瘀、毒，可单独为患，或相兼致病，迁延日久，最终导致脑髓不充、筋脉失养而发病。发病初期以邪实为主，多由痰热交阻，血瘀内停，风阳内动所致。中后期往往属于本虚标实，虚实夹杂，以虚为主。治疗依据辨证论治的中医基本原则，常用的方法有益气养血、培补肝肾、清热化痰、平肝熄风、理气活血等法。专方治疗是目前较受关注的方法，并且已经取得一定的进展。疏筋解毒汤以大多数患者常见的基本证候阴血亏虚、虚风内动为依据，又结合现代中医所认识到的毒损脑络可导致帕金森病的病理机制，立法处方，经过课题组多年临床应用和前期的实验观察，证明该方可滋肾阴、养肝血、活血祛瘀、息风止颤、疏筋解毒，对轻、中度帕金森患
19、者有较好的疗效，并且能减轻患者服用西药的毒副作用。为进一步揭示本方治疗帕金森病的机制，本实验通过研究疏筋解毒汤对细胞内质网应激的干预作用，从分子生物学水平揭示该中药处方治疗帕金森病的机理。本课题是在导师王亚丽教授精心指导下完成的，课题来源于国家自然科学基金项目（课题编号：30973829），得到了该项目基金的资助，保障了实验的顺利完成。 研究背景1西医对帕金森病的认识1817年英国医生James Parkinson首先提出并系统描述本病，经过近两个世纪的研究，帕金森病的临床特征及部分病因、发病机制已经被逐渐发现并阐明，治疗方法也有一定的进展。1.1 PD的临床表现PD的临床表现较为复杂，是由于
20、基底节病变而导致的锥体外系症状。常见的典型症状有：静止性震颤：典型表现呈“搓丸样”动作，常为多数患者的首发症状，静止时出现或更加明显，故名为静止性震颤。肌强直：典型表现为“铅管样强直”和“齿轮样强直”。运动迟缓：动作缓慢、笨拙，并进行性加重。可呈现“面具脸”。姿势步态障碍：典型表现为“冻结”现象及“慌张步态”。1.2 PD的病理改变PD病理改变主要在黑质、纹状体、尾核和壳核，主要病理学特征是脑黑质纹状体多巴胺能神经元变性坏死，以及残存的多巴胺神经元中出现路易小体(Lewy bodies，LB)、泛素（Ubiquibin）、突触核蛋白（-synuclein）。多巴胺神经元变性、坏死，导致黑质纹状
21、体多巴胺分泌不足，多巴胺与乙酰胆两种神经递质平衡失调，当多巴胺能神经元少于正常数量的50，多巴胺分泌量降低至正常量10-30时，影响锥体外系的正常功能，患者开始出现临床症状。黑质纹状体多巴胺神经递质水平低下是PD发生的最主要机制之一。1.3 PD的病因及发病机制PD的病因和发病机制尚未明确，目前医学领域较为有依据、得到大多数学者认同的观点有如下几个方面：1.3.1 遗传因素 目前认为约10的帕金森患者有家族史，且已经有6个与家族性帕金森病相关的基因被克隆，分别命名为PARK1-6。已经证实-synuclein（PARK1）、PARK2基因突变呈常染色体显性遗传，-synuclein基因突变后，
22、其异常表达可导致多巴胺神经元变性和凋亡，且其表达产物是路易小体的主要成分。1.3.2 环境因素20世纪80年代学者发现神经毒性物质1-甲基-4苯基1、2、3、6-四氢吡啶（1-methy-4pheny-1，2，3，6-tetrahydro-pyridine，MPTP）可诱发人类出现典型的帕金森病临床表现。MPTP无神经毒性，具有很高的亲脂性并极易通过血脑屏障，选择性地积聚在黑质周围，并被单胺氧化酶B（MAO-B）转变为强毒性的MPP(1-methy-4pheny-1，2dihydropyridiniumion)，后被多巴胺转运体（dopamine transporter，DAT）摄入黑质多巴胺
23、神经元内，抑制线粒体呼吸链复合物I(Complex I)的活性，耗竭胞内ATP储备，引起多巴胺胞质内再分布，增强多巴胺依赖性氧化应激3，促进自由基过度生成，导致多巴胺能神经元变性坏死。环境中除草剂和一些杀虫剂以及部分工业毒素有着与MPTP类似的结构，如百草枯4、联二苯杀虫剂、鱼藤酮、柴油机废气成分等，并通过类似的机制导致多巴胺神经元变性坏死而发病。1.3.3 神经系统老化PD主要发生于老年人，小于40岁人群很少发病，65岁以上人群中帕金森病的发病率为1.7%，45岁以上人群中发病率为0.4%，平均发病年龄是55岁5。资料显示30岁以后随年龄增长，黑质DA能神经元呈退行性变，DA递质逐年减少，酪
24、氨酸羟化酶及多巴脱羧酶活力逐年降低，存留的神经元内出现特征性路易小体6。提示衰老与帕金森的发病有关。1.3.4 氧化应激及自由基损害细胞在氧化代谢过程中会产生自由基和其他含有过氧化氢的活性氧物质(reactive oxygen species，ROS)。ROS在PD发病中发挥重要作用，它可以激活p38促分裂蛋白激酶和c-Jun氨基端激酶(JNK)，引起细胞色素C从线粒体中释放，从而导致一系列活性因子如Caspase-9等的裂解，并最终激活下游的Caspase-3，最后引起细胞凋亡7。多巴胺在代谢过程中经单胺氧化酶B(MAO-B)作用产生过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子和羟自由基（OH-）。H2
25、O2在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)还原型谷胱甘肽(GSH)作用下生成水。由于PD患者黑质内还原型谷胱甘肽水平下降30%60%8，铁水平升高，且MAO-B活性增加，H2O2生成增加且不能清除，在Fe3+存在的条件下生成毒性更强的羟基（OH-），导致黑质细胞的变性死亡。1.3.5 兴奋性神经毒性作用兴奋性氨基酸（EAA）主要包括谷氨酸（Glu）和天冬氨酸（Asp）。如果体内EAA异常增高就会对神经细胞产生兴奋毒性作用。正常情况下，纹状体神经元是由黑质多巴胺神经元的抑制作用和皮质谷氨酸能神经元的兴奋作用协调控制的，由于PD患者黑质纹状体内DA神经元缺失，Glu能神经元活动增强，如Glu释放过多
26、，使Ca2+大量内流，导致神经细胞内Ca2+超载，可触发一系列Ca2+相关的级联反应，即钙离子介导的细胞毒性作用，致使DA能神经元变性和坏死。1.3.6 细胞凋亡细胞凋亡(Apoptosis) 指细胞在接受某种信号或受到某种因素刺激后的一种主动的由基因控制的有序的死亡过程, 也称细胞程序性死亡( programmed cell death ， PCD )。神经系统正常的细胞凋亡能维持神经细胞正常分化、增值和死亡的动态平衡, 又能防御各种致病因素。自由基、神经递质和神经毒素、内质网应激过度等因素，通过多种机制均可导致多巴胺神经元凋亡。研究发现，细胞凋亡是患者DA神经元变性的最后步骤，是黑质神经元
27、变性的主要原因9。1.3.7 免疫功能变化炎症细胞因子可放大和维持炎症和免疫反应，从而激活小胶质细胞启动多巴胺能神经元的损伤。Boka提出了PD患者在黑质一纹状体通路上有与TNF-有关的中枢免疫反应10。Ferrer等研究发现PD患者纹状体抗凋亡蛋白Bcl-2和sFas水平与一些细胞因子的水平呈正相关，说明PD中细胞因子的增多可能与多巴胺能神经元的细胞凋亡有关11。有学者从帕金森患者的脑脊液和血浆中检出抗多巴胺抗体，抗体可以抑制多巴胺神经元的生长。提示免疫系统异常在PD发病中可能起到一定的作用。1.3.8 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)1.3.8
28、.1 内质网应激的产生内质网(endoplasmic reticulum，ER)是很重要的亚细胞结构，广泛存在于真核细胞中，是细胞中蛋白质合成、折叠、分泌、转运的重要细胞器，还参与脂类代谢、类固醇代谢的合成、钙的储存等。当内质网微环境改变时如蛋白糖基化抑制、二硫键生成障碍、钙稳态失衡、氧化应激、缺氧、缺血及某些药物作用等情况下，会影响蛋白质折叠，导致大量未折叠或错误折叠蛋白质不能形成天然构象运输出去而在内质网内堆积，导致内质网处于应激状态，产生ERS。ERS主要包括未折叠蛋白质反应(unfold protein response，UPR)和内质网超负荷反应(endoplasmic reticu
29、lum overload response，EOR)。研究已证明ERS在PD发生发展过程中起关键作用。1.3.8.2 ERS的保护作用在未产生内质网应激的细胞中内质网分子伴侣Bip/GRP78和ER应激感受蛋白IRE1 (inositol-requiring transmembranek inase)、PERK (PKR-like ERkinase) 和ATF6（即三条未折叠蛋白反应相关通路的分子伴侣）在胞内结构域结合以使它们保持非活性状态12。未折叠蛋白反应时，大量未折叠及错误折叠的蛋白在内质网中积聚，导致Bip被激活，从这些内质网应激感受器分离以帮助蛋白质折叠13。结果是释放出的IRE1和
30、PERK会进行二聚化、低聚化，接着是反式自身磷酸化，而后活化，从而激活未折叠蛋白反应的三条通路：IRE1通路：活化后的IREI具有核酸内切酶活性，对下游靶基因X盒结合蛋白1(X-box bindingprotein-l，XBP-l)进行剪接形成371aa的XBP-l剪接蛋白(XBP-1s) 14；未经剪接的XBP-1mRNA则形成267aa的蛋白(XBP-lu)。剪切后的XBP-l进入细胞核中激活UPR靶基因如伴侣分子GRP78、以及XBP-l本身的转录和翻译。从而促进内质网分子伴侣如GRP78等对蛋白质的正确折叠，同时它也促进了未叠蛋白降解的过程；PERK通路：活化的PERK则介导了eIF2
31、的磷酸化, 磷酸化化后的eIF2在蛋白质翻译的起始阶段将蛋白质的翻译阻断，减少了蛋白质的生成减低了内质网的前负荷；ATF6通路：而ATF6的活化也会促进XBP-1mRNA的剪接以及Bip的表达，从而促进了蛋白质的正确折叠。最终，UPR的三个相互关联的通路一方面通过减弱蛋白质翻译作用，减少蛋白质的合成,减轻早期蛋白生成的负荷和晚期未折叠蛋白的堆积，减轻了内质网的前负荷；另一方面，帮助错误折叠和未叠蛋白质进行正确折叠,并启动内质网降解系统，降解蛋白，降低了内质网的后负荷，维持细胞内稳态而保持细胞的正常功能。1.3.8.3 过度ERS的损害内质网应激程度剧烈时，细胞凋亡分子开始大量出现，促凋亡机制占主导，从而能够独立地诱导细胞凋亡。主要的凋亡途径有以下几条：caspase12途径：是caspase家族成员中ESR致凋亡的特异性介质，位于ER胞浆面, 不依赖于其他通路，cspase12激活后使ERS能够独立地诱导凋亡。C