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1、双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 双步激光质谱法对动物组织中药物分子的原位检测 专业名称： 光学 申请者姓名：王红磊 导师姓名： 胡勇军摘 要激光光电离作为一种独特的电离技术，已被广泛应用于质谱领域。基于单束激光的基质辅助激光解析(MALDI)质谱分析方法，已成为质谱分析生物大分子的标准方法之一。本文介绍的是另一种新的激光质谱分析方法：与MALDI相比，双步激光质谱法(L2MS)采用两束激光分别完成气化/解析和电离的任务。在双步激光系统中，解析阶段和电离阶段在空间和时间上是相互独立的，这样可以方便的对每一阶段进行单独优化。通过对实验仪器的改进，本论文详细探讨了应用双步激光质谱法对生
2、物组织切片中药物分子的原位探测，并优化相关的实验条件。本文主要包括以下三个部分：1）综述了几种常用的生物质谱方法及其相关的“软”电离方法，重点描述了双步激光质谱法的独特优势和在分析领域的最新进展。2）实验仪器系统：在原有超声分子束光电离质谱装置的基础上，自主搭建一套基于双步激光质谱方法的实验装置。在双步激光质谱系统中较为关键的接口上，采用了进样杆模式。对于固体样品的进样，还自主设计安装了二维平移装置。整套装置包括一套可与质谱真空系统兼容的一维传动杆组件，并与二维平移台配套。组件的末端安装有样品承载平台。整套装置通过手动闸板阀和O型密封圈使真空系统与外界隔绝，可以在保持真空的状态下更换样品。3）
3、应用双步激光质谱方法对生物组织中的药物分子进行了探测研究。实验中选用一种常见的光动力治疗药物亚甲基蓝（MB）作为模型分子，所选用的癌细胞为人体乳腺癌（Hela）细胞。实验结果表明，应用1064 nm的红外激光对纯肿瘤组织样品进行解析，同时用118 nm真空紫外激光对其进行单光子软电离，获得的质谱图背景简单，样品中组织的质谱信号主要来自于组织中的氨基酸或者短肽的碎片，质量数主要在100 Da以下。而预先在活体中注射有药物分子MB肿瘤组织的质谱图中，药物分子MB的质谱主峰为285 Da，出现在质谱图中质量数较高的区域。结果表明：该质谱峰避开了纯组织背景信号较复杂的区域，提高了检测信号的信噪比。在本
4、实验过程中，对两束光之间的延迟进行了优化，结果发现最佳延迟大约在18-35 s。本检测方法最大的特色是原位检测生物组织中的药物分子。经初步推测，其最低检测浓度可达10-6 mol/L以下。关键词：飞行时间质谱；单光子电离；生物组织；亚甲基蓝；原位检测IN SITU DETECTION OF DRUG MOLECULES IN THE ANIMAL TISSUE BY TWO-STEP LASER MASS SPECTROSCOPYMajor: OpticsName: Honglei Wang Supervisor: Yongjun HuABSTRACTAs a particular ioniz
5、ation technology, laser photoionization has been widely used in the field of the mass spectroscopy. MALDI (Matrix assisted laser desorption ionization), where only one laser was used, has become the standard method in the biological mass spectrometry. In this dissertation, a new mass spectrometry is
6、 introduced, i.e., Two-step laser desorption/laser ionization mass spectrometry (L2MS). Comparing this method with MALDI, no matrix is needed to add on the substrate and form a good cocrystallization with the sample. The signal can be optimized by changing the power and wavelength of two lasers inde
7、pendently. In present dissertation, we modify the home-made TOF-MS and optimize the L2MSexperimental condition. We also analyze drug molecules in situ in animal tissue by the introduced method. Detail contents for this dissertation are summarized as follows:(1). A couple of biological mass spectrosc
8、opy and their soft ionization methods are introduced. The unique advantages of L2MS are described and recent applications in analyzing field are reviewed.(2). Experiment instrument system: we build a two-step laser mass spectroscopic system on a home-made time of flight mass spectrometer which equip
9、s a supersonic jet source. The interface for L2MS method is an assembly with a linear transferred pole, which is compatible to the TOF mass spectrometer. An X-Y motion stage was designed to be compatible to the assembly. A sample holder is equipped in the end of the transferred pole. The vacuum is s
10、eparated by a custom made gate-valve and two O-rings. So we can expediently change the sample while keeping the vacuum.(3). We analyze drug molecule in biological tissue by the use of L2MS. We choose one of the common photodynamic therapy drugs methylene blue (MB) and human Hela cells as the model s
11、ystems. In present experiment, the tumor tissue without dosing MB is desorbed by an IR laser and soft ionized by 118 nm VUV radiation. The spectrum displays a variety of the fragments of amino acids and small other materials below m/z 100. For the tumor tissue with MB, the signal of MB m/z 285 is fa
12、r away from the background signal of the tumor tissue. So it can reduce the background interference and improve the sensitivity of detection. The appropriate delay time of two lasers is optimized and is found to fall in the range of 18-35s. For L2MS, the detection of in situ drugs in tissue is one o
13、f the most distinguishing features and the limit of detection (LOD) for this method is estimated to be lower than 10-6mol/L.KEY WORDS: TOF-MS; SPI; Tissue; Methylene Blue (MB)；In Situ目 录第一章 绪 论11.1 引 言11.2 几种常见的生物质谱方法11.3 软电离技术的发展及应用41.3.1电喷雾电离41.3.2 基质辅助激光解吸电离51.3.3 双步激光解析/激光电离7参考文献9第二章 实验系统的改进142.
14、1 质谱系统142.1.1 束源室142.1.2 主腔体152.2 双步激光的进样系统172.3 光电离离子源182.3.1 1064nm激光光源182.3.2 118nm真空紫外激光光源182.4 时序控制系统19参考文献21第三章 生物组织中光动力药物MB的双步激光实验223.1 引 言223.2 双步激光实验和结果分析233.2.1 实验材料及实验方法233.2.2 实验条件的验证253.3 实验结果及讨论263.3.1 纯亚甲基蓝样品分析263.3.2 对两束光之间延迟的优化273.3.3 纯生物组织的质谱探测283.3.4 预先给药（MB）生物组织的质谱探测293.3.5 最低检测浓
15、度的初步探究313.4 结 论32参考文献33第四章 全文总结及展望37致 谢39硕士期间发表论文和待发表论文情况4040第一章 绪 论1.1 引 言质谱仪是一种利用电场将不同大小荷质比的粒子区分开的一种检测仪器。世界上第一台质谱仪是于1910年由英国物理学家J. J. Thomson 研制成功，当时的质谱仪只是一种没有进行聚焦的抛物线质谱装置。随着离子光学理论的发展和完善，通过对离子运动轨迹的理论研究，发现适当的电场和磁场组合具有方向和速度聚焦的特性，于是质谱仪的质量分辨能力有了很大程度的提高1。随着激光技术的发展，上世纪70年代开始了激光技术与质谱方法相结合2，最初应用于光电离光谱和分子反
16、应动力学等基础研究领域3,4。随后，分析化学家将该成熟的实验技术应用到分析领域，很快通过与其他分析手段的连用质谱仪作为一种常规且有效的分析手段在有机物质分析、同位素、地球科学、考古学、环境科学、生物医学等方面得到极为广泛的应用。日本学者Tanaka最先提出应用单束激光开展基质辅助激光解析(MALDI)质谱分析方法。随后，该方法便成为生物大分子的主要分析手段。双步激光质谱法应用于质谱分析在上世纪80年代就有报道5,并且近年来在氨基酸和短肽，大气环境污染物多环芳烃(PAHs)，化学添加剂，外太空矿物质以及人类代谢产物等的成分解析上也取得了很大的成就。1.2 几种常见的生物质谱方法近年来，在生物领域
17、通过与其他分析手段的联用，质谱技术得到了大规模的应用和发展。众所周知，质谱已用于研究许多国际最前沿的热点问题，在基因及基因组学、蛋白质及蛋白质组学、生物化学、医药学以及病毒学等研究领域中成为不可替代的有力工具，例如多肽和蛋白质分析，细菌分析、药物的裂解研究以及病毒检测。特别是在大通量、分析速度要求快的生物大分子中，飞行时间质谱（Time-of-Flight Mass Spectrometer, TOF-MS）6成为唯一可以实现的分析手段。在此领域中四极杆质谱、离子阱质谱、离子回旋共振质谱和飞行时间质谱是最常见的几种生物质谱仪。傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪是现代分析科学领域中十分重要的一类仪器
18、，它是根据离子在磁场中会进行回旋运动的特性设计的。傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪可以和多种离子源结合使用，如电子轰击、快原子轰击、基质辅助激光解离、电喷雾、热喷雾等。和电喷雾离子源结合使用时，利用电喷雾电离使分析物带多电荷的特性可以检测几十万甚至上百万道尔顿的大分子。由于此类仪器具有离子俘获功能，所以也很容易实现多级质谱检测。但是该设备也存在有一些缺陷。比如，由于维护超导磁场必须使用大量的液氮，费用较高；离子运动的模式还无法用精确的数学模型加以描述。在气相色谱-质谱（GC/MS）和液相色谱-质谱（LC/MS）的连用中，离子阱是最常用的质量分析器之一。它吸取了各种技术的特长，弥补了彼此间的不足，
19、并及时利用各种学科及技术的最新成就，是极具生命力且比较成熟的一种仪器。就小型离子阱质量分析器而言，它具有很多优点：首先，它的灵敏度较高，适合对环境中的痕量物质进行检测，其次, 与其它类型的小型质量分析器相比, 离子阱质量分析器能够承受较高的压力(0.1 Pa); 离子阱最主要的优点是能够方便地进行多级串联质谱MSn测量。但是，与傅立叶变换-离子回旋共振质量分析器(FT-ICR)和飞行时间质量分析器(TOF)相比, 离子阱质量分析器的分辨率和质量准确度不是很高7。目前常用的质谱仪是飞行时间质谱和四极杆质谱。其中，前者适合于脉冲产生的光电离，而后者更适合于连续产生的离子流。四极杆质谱可以作为分析仪
20、器，也可以作为滤质器，用于对一定荷质比离子的选择。但四极杆质谱所能覆盖的质量分析范围不大，难以对于大质量分子以及团簇分子研究，也不能对所研究的离子进行能量分析。此外，四极杆质谱的流通率大概在百分之十左右，一次只能检测分析某一质量的离子，大大的降低了工作效率。近几年来，随着技术的革新飞行时间质谱（TOF-MS）在分辨率上有了质的飞跃（优于104），逐渐成为质谱仪家族中发展前景最好的仪器8-10。飞行时间质量分析器的基本原理：荷质比不同的离子通过加速区加速，获得相同的动能K后进入一段长度为L 的无场飞行区，离子由于荷质比不同，而获得不同的飞行速度，荷质比小(大)的离子速度快(慢)，那么通过一定距离
21、L的飞行后，将先后到达检测区被检测。离子的飞行时间T与其荷质比有一一对应关系，因此可以根据离子不同的飞行时间T来区分和确定其荷质比信息。与其他类型的质谱仪相比，飞行时间质谱有以下特点：1. 分析速度快: 单次测量可以得到被分析体系的质谱全图。对于自由飞行距离为1m的直管飞行时间质谱仪，当加速电压为2000V时，完成质量数300左右的成分测量仅需20微秒左右的时间。2. 灵敏度高: 可检测10-18克的样品。3. 可测量范围大，理论上被测物质的质量数不受限制。4. 结构简单易于制造和使用。常见的有直管飞行时间质谱以及反射式飞行时间质谱。直管飞行时间质谱仪主要由直管飞行时间质谱仪主要由离子源区、
22、自由飞行区和离子探测器三部分组成。对新生离子施加一个快速的脉冲的外电场，使正离子向负极方向飞行。在电场中加速的电荷数相同的粒子，获得的能量相同，于是其飞行速度不同。 在经过一定的飞行距离后，其到达探测器的先后不同。得到离子飞行时间谱后即可反推出各种质量数离子的分布。但是直管飞行时间质谱仪的质量分辨率仅达到几百左右，在生物大分子和团簇分子研究中仍显得力不从心。在1946-1972年的20多年间一直没有大的发展，分辨率一直徘徊在几百的量级。为了进一步提高仪器的分辨率，B. A. Mamyrin 等人于1973年引入静电反射器制成反射式飞行时间质谱仪，用离子反射器抵消同一荷质比不同初始能量的离子飞行
23、时间的分散，使得TOF-MS的分辨率有较大的突破达到3000。反射飞行时间质谱仪主要由离子源区、漂移区、离子反射器和离子探测器四个部分组成。其工作过程: 光电离产生的离子，经引出电场引至加速区，各种不同荷质比的离子在加速区中经同一电压加速后获得相同的动能， 然后进入漂移区作自由飞行至离子反射器，离子在离子反射器中获得能量补偿后再作自由飞行到达离子探测器表面而被检测到。反射式飞行时间质谱仪与直管飞行时间质谱仪相比，多了一个用于能量聚焦从而提高质量分辨的离子反射器。其主要作用是消除同一荷质比的离子由于初始速度不同而引起的质量分辨下降。因而反射飞行时间质谱仪的分辨率比直管飞行时间质谱的分辨率要高很多
24、，一般都在一千以上，甚至可以达到两万左右。另一项重要的革新则是1987年发明的垂直引入技术，不仅提高离子传输效率还为各种离子源与飞行时间分析器相连提供一个通用接口11。此后伴随着快电子技术、大面积检测器技术、计算机技术和机械加工技术的不断进步，TOF-MS的性能也不断提高。1998年A. F. Dodonov等设计一台垂直引入反射式TOF-MS，其分辨率达到20000以上12-13。该技术的出现使TOF-MS进入一个前所未有的快速发展阶段。1.3 软电离技术的发展及应用上世纪八十年代末，质谱技术得以迅速发展，相继发明了几种“软电离”技术：即电喷雾电离（Electrospray Ionizati
25、on, ESI）、基质辅助激光解析电离（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI）及本实验要采用的双步激光解析/激光电离（Two-step laser desorption/laser ionization mass spectrometry，L2MS）。这些方法的发明使有机质谱的应用拓展到高极性、难挥发和热不稳定样品的范围，奠定了对生物大分子进行进一步分析的基础。1.3.1电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）电喷雾电离（Electrospray Ionization, ESI）14-15是美国耶鲁大
26、学的Fenn J于1988年发明的一种非常实用且高效的“软”电离技术16，是目前应用范围最广的软电离技术。图 1-1 电喷雾电离的原理图Figure 1-1 The schematic of the electrospray ionization其基本原理：如图11 所示，将溶于极性溶剂中的样品混合液注入喷雾毛细管中，在毛细管与质谱大气压接口采样板之间施加一高电压（25kV），极性溶液在强电场的作用下发生电泳现象，分离溶液中的正负离子，例如在正离子模式下，溶液中正离子向针尖聚积，在强电场的牵引下，针尖处的液体表面向外扩展而形“Taylor锥”，随着Taylor 锥尖处的溶剂挥发和正电荷的聚集增
27、加，过剩的正电荷克服液体表面张力形成小液滴，最终从Taylor 锥体的尖端溅射出来。随着小液滴中溶剂的不断挥发，其体积逐渐减小，电荷密度增加，当液滴中电荷之间的静电斥力大于液滴表面张力的时候，液滴破裂成更小的小液滴，此过程不断重复，样品最终被雾化，形成气相分子离子。影响初始液滴产生的主要因素有：溶液流速、溶液的电阻系数和溶液的表面张力。ESI 软电离技术最大的特点是产生多电荷离子，因此可以在不增加对分析器质量检测上限的基础上，提高对大分子检测的能力，适用于极性且包括稳定性差的有机化合物的测定。电喷雾电离质谱对于高分子化合物的测定由于可以产生多电荷峰，与传统的质谱相比扩大了检测的分子质量范围，同
28、时提高了灵敏度，在pmol数量级的水平或更少的样品监测中，当分辨率1000时刻达到0.005%的精度。由于其较高的灵敏度且可以分析混合物，目前该方法在生物大分子的检测方面有着广泛的应用17-23。同时在生物药学领域也是不可或缺的重要手段，如在糖蛋白、糖肽的糖基化位置以及寡糖组分的测定中都有很好的应用24-26。但对于大分子的蛋白质来说由于要形成非常复杂的多电荷峰，因此分析大分子混合物较为困难，一般只用于分析较纯的大分子化合物，同时溶剂对其分析的影响也非常大。1.3.2 基质辅助激光解吸电离(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization,MALDI）M
29、ALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。19世纪80年代有几个课题组一直在致力于解决利用激光解吸附离子化样品分子难的问题；1987年日本Shimadzu 公司的工程师Tanaka终于取得重大突破，他在大阪一个研讨会上宣布利用基质辅助激光解吸电离（MALDI）方法成功的测定了生物大分子，随后于1987至1988年间发表了两篇论文对此成果进行了报道，当时Tanaka是使用含有细金属粉末的甘油作为基质，虽然这种基质后来并没有得到更好的发展27；紧接着德国的科学家M. Karas和F.Hil
30、lenkamp 利用有机基质（烟碱酸）成功检测了多种蛋白质和寡核苷酸28,29。从此，不断有新的、更高效的基质被报道，例如以多孔硅作为基质，使得MALDI-MS的灵敏度越来越高，应用越来越广泛。该实验仪器主要由两部分组成：基质辅助激光解吸电离离子源和飞行时间质量分析器。MALDI的原理如图1-2所示：用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比与离子的飞行时间成正比 ，检测离子。因此它是一种软电离技术
31、，适用于混合物及生物大分子的测定。MALDI-TOF-MS具有灵敏度高、准确度高及分辨率高等特点，为生命科学等领域提供了一种强有力的分析测试手段，并正扮演着越来越重要的作用。图1-2 基质辅助激光解析电离原理图Figure 1-2 The schematic of MALDIMALDI在生物大分子中的应用更多的是测量分子量，如牛碳酸酐酶、牛胰岛素B链30、胰蛋白酶原31等。由于MALDI对于杂质的忍耐性及其高灵敏度，使其也成为低聚核苷酸分析的有效方法32-33。在生物分子的研究中有关的结构信息也是很重要，MALDI亦可以获得部分结构信息34-35。此外，MALDI对于低聚糖36、人工合成高分子
32、物37-38也可以进行有效的分析。MALDI方法对于生物大分子的探测很有优势，但对于短肽和氨基酸等小分子效果不好，因为MALDI需要在待测样品中人为添加基质，并要求其基质必须与样品形成比较好的共结晶，因此其样品准备的过程较为复杂。此外，在电离过程中基质产生的碎片离子峰极有可能覆盖需要探测的小分子离子峰。1.3.3 双步激光解析/激光电离（L2MS）双步激光质谱法与MALDI质谱方法不同，双步激光质谱法采用两束激光分别完成气化/解析和电离的任务。其基本原理如图1-3所示：在双步激光系统中，解析阶段和电离阶段在空间和时间上是相互独立的，这样就可以对每一阶段进行单独优化。第一束激光为解析激光，其作用
33、是使样品在很短的时间内得以气化，对于热不稳定且难以挥发的物质，此技术极为关键。第一束激光一般采用光子能量较小的红外波段的激光39-40，但为了特殊需要，也有使用紫外激光41。当解析激光照射到承载有样品的基体上时，被吸收的光在瞬间大部转换成热能，并传递给待测样品，使其瞬间气化/解析42。研究表明，短脉冲激光可以在10 ns时间内上升到108 K的高温43，如此快的升温速度，可以避免分子因均匀受热而发生裂解。在解析激光的照射下，在离靶体表面很近 (约1-2 mm) 的范围内将会形成一个体积约1 mm的气团，包含在该气团中的大部分为中性粒子，其中性粒子所占的比例大约是带电粒子的1000倍以上5。经过
34、一定时间的延迟，第二束激光（电离激光）被聚焦并引入到该气团，优化两者之间的延迟时间, 这样可以极大地提高电离的效率，有助于质谱信号强度的增强，被电离的离子随后被引入质谱仪中进行检测。第二束激光可以是紫外光也可以是真空紫外光，真空紫外激光（光子的能量大约为10 ev）可以通过单光子对绝大多数的分子进行“软”电离44，这样可避免碎片的大量产生。图1-3 双步激光质谱法基本原理示意图Figure 1-3 The schematic of L2MS该技术手段有很多优点，其一，因解析激光和电离激光在时间和空间上是分开的，因此可以根据实际的需要很方便的单独优化两束激光的能量和波长；其次，该实验技术所需要的
35、样品量极少，也不需要在待测样品中人为地添加其它的化学物质作为基质，样品准备简单，避免了样品的二次污染。同时对于小分子的探测有其独特的优势，可以避免基质背景峰的干扰。针对该技术，Faccinetto提出了一个阶梯转换（Ladder-switching）模型45，该模型可以指导我们对所使用两束激光的工作条件进行优化。该模型主要内容包括：当解析激光能量保持不变时，随着电离激光（第二束激光）光强的增加，母体离子的信号逐渐增强；当光强继续增加时，母体离子信号便开始减弱，作者的解释是由于过高的能量导致样品发生解离；而当解析激光的能量逐步增加时，出现最佳母体离子信号时所需电离激光的能量呈下降的趋势，作者认为
36、是解析激光能量的增加导致分子更易于被光电离。作者对多个多环芳烃类分子进行了分析研究，结果表明该类分子均遵守这一规律。最近，Zare等详细探讨了该质谱分析方法应用于定性和半定量分析中的各种因素对分析结果的影响46。作者指出：解析激光的能量和波长，电离激光的能量和光束的准直，两束激光之间的延迟时间，基底的特性等均会使信号波动进而对定性和半定量的分析产生较大的影响。其中有些影响很难消除，如解析激光的能量波动和激光束的准直等都会导致结果的不确定性。参考文献1 贾韦韬, 徐国宾, 姚均, 等. 高效液相色谱检测器-高分辨飞行时间质谱仪的研制 J. 质谱学报, 2006, 27: 129-134.2 Mu
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