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1、茶条槭悬浮培养细胞 摘 要：茶条槭悬浮培养细胞经过10%浓硫酸-甲醇提取后，用HPLC 法测定其没食子酸含量。色谱条件为：流动相为甲醇/水（4/6），流速0.5ml/min，Waters C18 MS 柱，检测波长为270nm。实验测得的线性范围为 20.0-100gmL-1（R=0.9996, n=5）。平均加样回收率为99.86%，RSD 为0.09%。样品稳定性、实验的精密度及重复性3者的RSD 均小于1.5%。表明本法是1种测定茶条槭悬浮细胞中没食子酸含量的好方法。关键词：茶条槭；悬浮细胞；液相色谱；没食子酸1引言没食子酸(Gallic Acid, GA)，又称倍酸，5倍子酸，应用范围
2、很广，主要用于药物、染料、墨水制造，也用做食品抗氧剂、防腐剂、金属提取剂、紫外线吸收剂、消毒剂、止血收敛剂、显影剂、化学试剂、泥浆流化剂和葡萄生长剂等。研究表明，以没食子酸为原料制成的药物可使肿瘤细胞的生长抑制或凋亡，还可作为抗氧剂，具有较强的抗氧化作用，在国际医学上，以没食子酸为原料现已合成抗感染药品如4氧普林(TXP)、溴莫普林(BOP)和美替普林(MTP)；脑复清( Exifone),用于治疗老年意识障碍；联苯双脂，用于治疗慢性肝炎；克冠卓、忧心平、心痛平，用于心绞痛、心衰、心肌梗塞恢复期等；通牌酯,用于治疗脑血栓；Troxipide ,用于治疗胃溃疡；克冠酸,用于治疗心肌梗塞；没食子酸
3、锑钠,用于治疗血吸虫；鞣花酸，用于防癌和抗癌3。目前，没食子酸产品供不应求，销售价格在2030万元/。茶条槭（Acer ginnala Maxim ）为槭树科槭树属的落叶灌木或小乔木，树叶中含有没食子酸，本文前期工作已获得大量茶条槭悬浮细胞，并确定其中含有没食子酸，我们用高效液相色谱法测定了茶条槭悬浮细胞中没食子酸含量，实验方法如下。2. 材料与方法2.1 材料茶条槭悬浮培养细胞2.2 仪器德国Waters液相色谱系统（包括600泵、717自动进样器、2487检测器、2996检测器、柱温箱等），Milli-Q Gradient超纯水系统。2.3 药品与试剂没食子酸对照品购自中国药品生物制品检定
4、所，甲醇（色谱纯），浓硫酸。2.4 色谱条件1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金(20060225010)和东北林业大学青年科研基金(07045)的资助。- 2 -色谱柱为德国Waters C18 4.6 mm 250 mm，5m； 流动相为 甲醇：水（4：6）流速:0.5mlmin-1；检测波长: 270 nm；进样量为10l；柱温为25 。2.5 标准品配置精确称取没食子酸标准品0.0050g，置于50ml 容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀。配制成0.1 mgmL-1的标准液。2.6 样品处理精密称定经100目细胞筛筛过的茶条槭悬浮培养细胞干粉末0.1 g，精密加入2 mL10
5、%浓硫酸，2 mL甲醇，超声2min，加入甲醇定溶至5mL，60水浴1h，0.45m滤膜过滤，超声10s，进样。3. 结果3.1 线性关系考察本文在优化色谱条件时，使用C18色谱柱，对流动相甲醇和水的比例以及流速进行了试验，分别采用1：9、3：7、4：63个比例，采用1ml/min、0.8ml/min、0.6ml/min、0.5ml/min流速对没食子酸标样进行处理，结果表明甲醇：水=4：6，流速为0.5ml/min时，色谱保留时间和分离度都比较好。分别取没食子酸对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml，以甲醇定容至5ml容量瓶中，制得不同浓度的溶液(0.02、0.04、0.06、
6、0.08、0.1 mgmL-1)。每次进样10l，按上述色谱条件进行测定对照品峰面积。将上述对照品浓度与相应峰面积进行回归处理，回归方程为:Y=3.37107X + 1.45104，R=0.9996，没食子酸进量在20100gmL-1 范围内样品浓度与峰面积呈良好的线性关系。3.2 精密度试验吸取同1对照品10L，连续进样5次，测得没食子酸峰面积值，结果RSD =1.02%，表明精密度良好。3.3 稳定性试验吸取供试品溶液10L，照上述色谱条件，分别在室温放置0、2、4、8、12、16h后进样，测定供试品溶液中没食子酸峰面积值，结果RSD为1.2%，表明没食子酸峰面积在16小时内稳定。3.4
7、重复性试验取同1样品，共5份，分别按样品制备方法制备，照上述色谱条件测定没食子酸峰面积，结果样品中没食子酸平均含量为18.79mgg-1，RSD=0.18%。表明该法的重复性良好。3.5 加样回收率试验取已知没食子酸含量为13.52 mgg-1的样品，共4份，每份精密称取0.1000g，分别精密加入没食子酸对照品，按照供试品溶液制备成上样溶液。按上述色谱条件测定没食子酸峰面积，计算回收率，结果见表1。由表1可知加样平均回收率为99.86%，RSD=0.09%，说明该法加- 3 -样回收率良好。Tab1 The recovery of gallic acid ( n = 4)sample/mg
8、control/mg content/mgg-1 recovery/% mean/% RSD/%100 0.0501 16.01501 99.81100 0.1002 18.51288 99.86100 0.1501 21.01804 99.98100 0.2003 23.49701 99.7799.860.093.6 样品测定结果分别称取对照品和供试样品，分别制备成上样溶液，精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液10L，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定,以外标法计算样品中没食子酸含量，测得的没食子酸含量为14.02mgg-1，色谱峰如图1、2。Figure 1 spectrum of cont
9、rolFigure 2 spectrum of sample4. 讨 论没食子酸的测定方法很多，主要有水解法、紫外分光光度法、TLC法和HPLC法。目前已在地稔4、翻白草5、石榴皮6等植物中利用HPLC法测得没食子酸含量，本文建立了用HPLC测定茶条槭悬浮细胞中没食子酸含量的方法，有效的将其与茶条槭悬浮细胞中其它干扰性的成分进行分离，精密度高，准确度高，操作简便、快速，方法实用可靠。能作为诱导茶条槭悬浮细胞高产没食子酸分析的1种有效手段。- 4 -参考文献 Yoshioka K, Kataoka T. Hayashi T, et al. Induction of apop tosis by g
10、allic acid in human stomach cancerKATO III and colon adenocarcinoma COLO 205 cell lines . Oncol Rep, 2000, 7 (6) : 1221-1223. Sakagami H, Satoh K. Prooxidant action of two antioxidant: ascorbic acid and gallic acid J. Anticancer Res,1997, 17 (1A): 221-2243 Pan xia, Utilization and advance of Acer gi
11、nnala, Protection Forest Science and Technology J (防护林科技),2005,67(4):68-724 Li Cai-tang,Song You-xin,Li Jing,et al., Determination of gallic acid in Melastoma dodecandrum Lour1. byHPLC,Journal of jiangxi chinese medicine college J(江西中医学院学报),2005,17(4):375 Zang Ying,Zang Li-mu,Gao Yun-sheng,et al., D
12、etermination of gallic acid in Potentilla discolor Bunge byHPLC, Chin Hosp Pharm J(中国医院药学杂志),2006,26(3):255-2566 ZHou Ben-hong, Liu Chun, Wu Zheng-hua,et al,Determination of gallic acid in Punica granatum L.extraction by HPLC,Chin Hosp Pharm J（中国医院药学杂志）2005, 25(12):1148-1150Content Determination of
13、Gallic Acid in suspension cells ofAcer ginnala by HPLCQi Fenghui, Zhan Yaguang, Dong JieSchool of life science, Northeast Forestry University, Harbin (150040)AbstractA HPLC procedure was established to determin the content of gallic acid in suspension cells of Acerginnala. The separation was perform
14、ed on Waters - C18 column with a mobile phase of methanol/water(4/6) and detected at wavelength of 270 nm. The results showed that the linearity range was20.0-1000gmL-1 (R=0.9996, n =5) and the average recovery of gallic acid was 99.86% , RSD was0.09%. RSD values of sample stablity, precision and repetition were below 1.5%. All these resultsindicated that this preocedure works well.Keywords: Acer ginnala; suspension cell; HPLC; Gallic Acid