本科药学毕业论文(重复率20以下)中药天麻的鉴定以及药理学研究.doc

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1、中药天麻的鉴定以及药理学研究摘要目的:中药天麻具有息风止痉,平抑肝阳,祛风通络的功效,广泛应用于肝风内动、惊痫抽搐,眩晕、头痛,肢体麻木、手足不遂、风湿痹痛等症状。主产于四川、云南、贵州等地,药性甘,平,归肝经。天麻作为临床常用贵重药材之一,近几年野生天麻资源短缺,伪品不断出现,为了更好的区分真伪天麻,天麻的中草药鉴定手段也正在蓬勃发展,从传统的性状鉴别以及显微观察,到紫外光谱、红外光谱、X衍射法、核磁共振、高相色谱法等手段进行理化鉴定,近年新型双向聚丙烯酰胺凝胶电泳、质谱技术、分子生物技术对天麻DNA进行提取,使鉴定技术进入新时代。关键词: 天麻 药理研究 鉴定研究Abstract Obje

2、ctive:The role of Chinese traditional medicine gastrodia elata are to remove the body of the cold,to treatment convulsion and to keep the power of the intrahepatic smoothly。The gastrodia elata widely applied to endogenous liver wind,panic epileptic seizure,dizziness,headache,numbness of limb,hands a

3、nd feet is ineffective and rheumatic arthralgia.Gastrodia elata grow mainly in sichuan, yunnan, guizhou and other regions.It is one of the commonly used in clinical medicine.In recent years, the shortage of resources of wild Gastrodia elata.Its adulterant keep popping up across the country.Identific

4、ation of Chinese herbal medicine means of Gastrodia elata is in constant development-from the trails indentification and microsopic observation of tradition,to physical and chemical indentification with other means by UV,IR,X-Ray Diffraction,NMR ,High chromatography and so on which can better indent

5、ify the authenticity of gastrodia elata.In last few years,the method of extraction of gastrodia elatas DNA with 2D-PAGE,MS and Molecular biological technology that make identification technology into the new period.Keywords: Tianma pharmacological research identification of Chinese medicine一、前言7二、药理

6、研究7 1.天麻的应用71.1肝风内动,惊痫抽搐7 1.2 眩晕,头痛7 1.3 肢体麻木,手足不遂,风湿痹痛8 2.用法用量8 3.现代研究8 3.1化学成分8 3.2药理作用9 3.2.1 抗惊厥、抽搐9 3.2.2 镇痛9 3.2.3 对心血管的影响 10 3.3不良反应10三、天麻的中草药鉴定11 1 .理化鉴定 11 1.1 光谱鉴定11 1.2 色谱鉴定 11 2 .分子生物鉴定 11 2.1.1 RAPD技术 11 2.1.2 天麻的RAPD分析12 2.2.1 SSR技术13 2.2.2 天麻的SSR技术分析 13 2.3.1 AFLP技术 14 2.3.2 天麻的AFLP技术

7、分析 14 3、其他 15 3.1 性状鉴别 15 3.2 显微鉴别 15四:总结16五:参考文献17一、前言 天麻,原名赤剑,神农本草经最初记载,列为上品1,为兰科植物Castrodia elata BL.的干燥块茎。立冬后次年清明前采挖,冬季茎枯时采挖者名“冬麻”,质量优良;春季发芽时采挖者名“春麻”质量较差。采挖后,立即洗净,蒸透,敞开低温干燥。用时润透或蒸软,切片。根据天麻的外部形态特征分为天麻、黄天麻、绿天麻、乌天麻。松天麻和毛天麻6种变型2,常与琼珍灵芝搭配,用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风等症。二、药理研究 1、天麻的应用 1.1肝风内动,惊痫抽搐 本品主入肝经,功能息风止茎

8、,且味甘质润,药性平和。故可用治各种病因之肝风内动,惊痫抽搐,不论寒热虚实,皆可配伍应用。如治小儿急惊风,常与羚羊角、钩藤、全蝎等息风止茎药同用,如钩藤饮(医宗金鉴);用治小儿脾虚慢惊,则与人参、白术、白僵蚕等药配伍,如醒脾丸(普济本事方);用治小儿诸惊,可与全蝎、制南星、白僵蚕同用,如天麻丸(魏氏家藏方);用治破伤风痉挛抽搐、角弓反张,又与天南星、白附子、防风等药配伍,如玉真散(外科正宗)。 1.2 眩晕,头痛 本品既息肝风,又平肝阳,为治眩晕、头痛之要药。不论虚证、实证,随不同配伍皆可应用。用治肝阳上亢之眩晕、头痛、常与钩藤、石决明牛膝等同用,如天麻钩藤饮(杂病证治新义);用治风痰上扰之眩

9、晕、头痛,痰多胸闷者,常与半夏、陈皮、茯苓、白术等同用,如半夏白术天麻汤(医学心语);若头风攻注,偏正头痛,头晕欲倒者,可配等量川芎为丸,如天麻丸(普济方)。 1.3 肢体麻木,手足不遂,风湿痹痛 本品又能祛外风,通经络,止痛。用治中风手足不遂,金谷疼痛等,可与没药、制乌头、麝香等药配伍,如天麻丸(圣济总录);用治妇人风痹,手足不遂,可与牛膝、杜仲、附子浸酒服,如天麻酒(十遍良方);若治风湿痹痛,关节屈伸不利者,多余秦艽、羌活、桑枝等祛风湿药同用,如秦艽天麻汤(医学心悟) 2、用法用量 内服:煎汤,3-10g;或入丸、散、研末吞服,每次1-1.5g。 3、现代研究 3.1化学成分 天麻中含量较

10、高的主要成分是天麻甙(gastrodin),也称天麻素,其化学组成为对-羟甲基苯-D-吡喃葡萄糖甙(p-hydroxymethylphenyl-D-glucopyranoside);另含天麻醚甙(gastrodioside),其化学组成为双-(4-羟苄基)-醚-单-D-吡喃葡萄糖甙bis-(4-hydroxybenzyl)ether-mono-D-glucoyranoside。又含对-羟基苯甲基醇(p-hydroxybenzyl alcohol),对羟基苯甲基醛(p-hydroxybenzaldehyde),4-羟苄基甲醚(4-hydroxybenzyl methylether),4-(4-羟

11、苄氧基)苄基甲醚4-(4-hydroxybenzyloxy)-benzyl methyl ether,双(4-羟苄基)醚bis(4-hydroxybenzyl)ether,三4-(-D-吡喃葡萄糖氧基)苄基枸橼酸酯tris-4-(-D-glucopyranosyloxy)benzylcitrate,parishin。又含香草醇(vanillyl alcohol),枸橼酸(citric acid),枸橼酸甲酯(methyl citrate),琥珀酸(succinic acid),棕榈酸(palmitic acid),-谷甾醇(-sitosterol),胡萝卜甙(daucosterol),蔗糖(s

12、ucrose)。初生球茎含有一种抗真菌蛋白以及几丁质酶(chitnase),-1,3-葡聚糖酶(-1,3-glucanase)。还含有具增强免疫作用的天麻多糖以及多种微量元素,其中以铁的含量最高,氟、锰、锌、锶、碘、铜次之。从新鲜天麻中分离得到酚性成分:天麻甙,对-羟基苯甲醇,对-羟基苯甲醛,3,4-二羟基苯甲醛(3,4-dihydroyxbenzaldehyde),4,4-二羟基二苯甲烷(4,4-dihydroxydiphenyl methane),对-羟苄基乙醚(p-hydroxybenzyl ethyl ether),4,4-二羟基二苄醚(4,4-dihydroxydibenzyl et

13、her),4-乙氧基甲苯基-4-羟基苄醚(4-etho-xymethylphenyl-4-hydroxylbenzyl ether),三4-(-D-吡喃葡萄糖氧基)苄基柠檬酸酯,对-乙氧甲基苯酚(4-ethoxymethylphenol) 3.2药理作用 天麻水、醇提取物及不同制剂,均能使小鼠自发性活动明显减少,且能延长巴比妥钠、环己烯巴比妥钠引起的小鼠睡眠时间,可抑制或缩短实验性癫痫的发作时间,天麻还有降低外周血管、脑血管和冠状血管阻力,并有降压、减慢心率及镇痛抗炎作用,天麻多糖有免疫活性。3.2.1 抗惊厥、抽搐 在实验小鼠皮下注射天麻素,发现天麻素可与戊巴比妥钠、水合氯醛及硫喷妥钠等的相

14、互作用,对抗咖啡因所致的中枢兴奋作用,使戊巴比妥钠催眠剂量的睡眠时间明显延长。天麻素通过血脑屏障后,以最高速度在脑组织中降解,降解后的产物天麻苷元作为脑细胞Bz受体的配基,作用于r氨基丁酸/Bz受体,来实现镇静、抗惊厥抽搐的中枢抑制效应。3 3.2.2 镇痛郑周燕4将天麻注射液注入眩晕病人体内,95.56%的总效率表明,天麻素可降低血压,减小外周阻力,扩张微血管及其小动用来增加微循环血流量,使大脑大脑皮质兴奋与抑制过程达到平稳,缓解眩晕、头痛。若肌肉注射天麻液,治疗头痛、头晕、睡眠障碍的脑外伤综合征,有效率为达97%5。通过电击鼠尾法证明5g/kg的天麻有显著镇痛作用,可提高痛阈,而热板法则对

15、小鼠的痛阈值无明显影响,扭体法证实镇痛作用与剂量有关,且高剂量的作用显著6。 3.2.3 对心血管的影响 将天麻注射液(1g/kg)进行颈外静脉注射,可扩张麻醉大鼠肠系膜动脉管径,使其血流量加快,1ml剂量后发挥作用,15min时到达最大值,小静脉作用不明显7。天麻素可改善动脉血管顺应性,降低外周血管阻力,降低由血管顺应性导致的高血压;其可影响冠状动脉血流量,对抗由肾上腺素引发的缩血管效应,预防血栓形成,改善微循环障碍。天麻素可以抑制毛细血管通透性,影响炎症早期渗出,减少急性心肌梗死后的细胞坏死,降低心肌耗氧量,促进心肌细胞的能量代谢,保护心肌细胞。 3.3不良反应 天麻及天麻制剂偶有过敏反应

16、及中毒的发生。如头晕、恶心、胸闷、皮肤丘疹伴瘙痒等,个别会出现面部或全身浮肿,甚至脱发现象。不仅单用天麻会发生这类反应,有的人口服天麻粉引起荨麻疹药疹;口服天麻丸引起过敏性紫癜;肌注天麻注射液致过敏性休克;大剂量炖服天麻致急性肾功能衰竭及昏迷等,天麻蜜环菌糖衣片后,同样会出现对天麻过敏的症状。8对天麻的副作用或使用禁忌,古人早有认识。如本草纲目云:“久服天麻,遍身发出红丹。”本经逢原也云:“天麻性虽不燥,毕竟风剂,若血虚无风,火炎头痛、口干便闭者,不可妄用。”清代名医吴仪洛更是直言:“血液衰少及非真中风者忌用”。现代药理实验证明:天麻有一定毒副作用,天麻中毒剂量是40克以上,中毒潜伏期是16小

17、时。天麻中毒解救的方法为:早期催吐,洗胃;出现过敏性反应及肾功能衰竭时,可对症处理。三、天麻的中草药鉴定 1 理化鉴定 1.1 光谱鉴定 用傅里叶变换红外光谱仪对天麻进行鉴定,建立红外光谱图谱,发现野生天麻、家种天麻及天麻伪品的红外光谱图特征明显,根据峰型及其位置可轻易区分真伪品。而峰谱位置和吸光度比可用来区别野生冬天麻和野生春麻、野生天麻和家种天麻,天麻的不同级别也可用谱峰吸光度比进行区分。Budzikiewicz等9在利用紫外光谱鉴别天麻的真伪时,发现190500 nm范围内具有较强的特征性,可更好地区分天麻及其伪品。袁卫梅等10通过FI-NMR波谱仪测定8种来源不同的天麻特征总提取物(C

18、GE)的1H-NMR指纹图发现对羟基苯甲醇和天麻苷,在经光谱解析和文献数据比较后,能鉴定其结构,实现了天麻1H-NMR的指纹图解析1112秦海林等9秦海林,赵天增,都恒青,等.核磁共振波法鉴定天麻及其伪品J.中药材,1994,17(6):23-24.。则在NMR波谱仪测定天麻1H-NMR指纹图,运用核磁共振氢谱法为中药的鉴定寻找到理论和依据,得到参照及其相对标准图谱。 梁惠玲等13的EI-MS法发现真品天麻的主要成分对羟基苯甲醇的衍生物的甲醇提取物指纹特征性强,存在(m/z124)基峰及其进一步的裂解碎片峰(m/z107和m/z95)。为天麻真伪鉴别提供了可靠依据。 1.2 色谱鉴定 石上梅等

19、14运用HPLC指纹图谱鉴定发现此方法灵活有效。而袁敏等15采用裂解高分辨气相色谱法对天麻真伪品分析比较后,发现特定条件下的中药材拥有各自不同的裂解色谱图,为鉴别提供依据。 2 分子生物鉴定 2.1.1 RAPD技术 近几年应用较为广泛的一种遗传标记,随机扩增多态性DNA标记(RAPD),是在PCR的基础之上建立的,以10个左右碱基单链随机引物为基础对全部DNA进行PCR扩增,用以检测多态性。其检验技术不仅快速、有效、灵敏度高而且操作简便,在遗传连锁图谱的构建、指纹图谱的绘制品种品系、种质资源的遗传多样性以及分类研究和绘制目标性状基因连锁图等一系列领域中的应用较为广泛。16172.1.2 天麻

20、的RAPD分析 邹佳宁等18曾利用RAPD分析对贵州省同一产地的野生与栽培天麻鉴别,其中野生天麻采集于贵州省遵义县到瓮安县山区乌天麻地上茎的新鲜样品;栽培天麻采集于同一地点的经药农栽培数代后的野生乌天麻新鲜地上茎样品。PCR扩增引物及相关试剂为上海生工及华美生物公司所赞助)。天麻做为名贵的中草药之一,野生天麻资源的采挖已不能满足巨大的市场需求,因此天麻的人工栽培方法成为如今重要的研究方向。经过多方面的研究努力,取得了一定的研究成果,栽培天麻已成为市场商品的主要来源。可经数代繁殖后的天麻的药用价值及其产量都较原野生天麻呈明显退化现象。19为探寻原因,从天麻基因水平上着手探讨同一产地野生与栽培天麻

21、的区别。试验采用30个随机引物,依次对野生与栽培天麻的DNA进行RAPD扩增,研究发现了6个多态性强、重复性好的随机引物,其引物对野生天麻和栽培天麻的RAPD扩增位点分子量为2002500。经分析很容易发现同一产地的野生与栽培天麻基因组DNA有明显差异(差异系数40%60%)。但同一药农栽培的同一代天麻的RAPD扩增差异并不大。因此,经过数代栽培的野生天麻与栽培天麻的基因型态会发生显著的变异。 筛选RAPD特异引物为合理有效的利用天麻资源和寻找优质种质资源进行优良的遗传育种提供了科学依据,也为天麻的分子生物学鉴定研究奠定了一定基础。基于PCR反应基础上的标记技术,反应了多态性,在影响反应的各种

22、因素的同时也影响了RAPD的扩增效果。20通过对PCR反应体系的研究,反复试验和筛选优化对dNTP,引物,Mg2+,TaqDNA聚合酶、模板DNA的浓度等影响RAPD的扩增效果,建立一套适合于天麻的RAPD反应体系,扩增出的条带强弱明显、清晰明了、扩增产物数量大重复性好,为DNA分子水平研究天麻的演化、分类、鉴别、种质资源的研究奠定了基础。212.2.1 SSR技术由Zietkiewicz在SSR标记的基础上提出的简单序列重复间区(ISSR)DNA标记技术,是20世纪90年代中期发展起来的一种新型的分子标记技术。22通常为1618个碱基序列,由24个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基。利

23、用锚定的微卫星DNA作为引物,检测两个SSR(简单重复序列)之间一段短DNA序列的多态性。并以真核生物基因组的广泛SSR序列,设计出多种与SSR序列相结合的PCR引物,对相邻较近、方向相反的两个SSR序列之间的DNA区进行扩增。SSR标记不仅可以用作探针,也可分析基因组的多态性,根据两端特异序列设计引物通过扩增基因组中的重复序列位点。SSR实验重复性好,结果可靠性强,检测的是单一多等位基因位点,微卫星为共显性遗传,并具有位点转化性特点。因其技术操作简单、多态性丰富,目前,种质资源鉴定、遗传多样性的研究、分子生物遗传连锁图构建、目标性状基因的标记等开始大量使用SSR标记技术。23中药植物体的遗传

24、结构以及影响因子的研究,对植物资源的利用、保护及其遗传基因的后续改良具有重大意义。2.2.2 天麻的SSR技术分析 我国野生天麻分布较广,同时,野生天麻又是濒危中草药物种,这种种状况必然导致天麻的遗传多样性的不同。研究分析23份贵州野生天麻的种群遗传多样性,获得约72%的多态位点,发现野生天麻的遗传进化中基因组发生了丰富的变异,这和上述野生和栽培天麻亲缘关系的RAPD分析结果有相似之处。24天麻的丰富的遗传多态性的一个重要原因是因生长环境和地理分布的不同所致。野生天麻在自然选择的长期积累中进行了丰富的遗传变异,遗传组成也十分复杂多样,且不同生态地区的野生天麻品种之间的遗传差异更是大大不同。因此

25、,杂交育种天麻应尽最大可能的选择生态类型较大的育种材料,以模拟原生态环境的育种方式为主,通过天麻群体内部的个体移栽来提高群体内部的基因交流,对种子的繁殖方式进行人为推广,尽最大可能保护基因及遗传多样性,使更多理想型的性状组合在杂交后代出现,培育出更多更好的天麻新品种。2.3.1 AFLP技术天麻物种内部具有极其丰富的遗传多样性,各种品种间的差异较大,特别是栽培的天麻质量往往低于野生天麻,有效成分含量的差异也极其明显。针对以上情况,从分子水平出发研究各类天麻的亲缘关系,在基因水平上为各类天麻物种的鉴定提供依据变的十分必要。上世纪90年代发展起来的扩增片段长度多态性(amplified fragm

26、ent length polymorphisms, AFLP)是检测DNA多态性的新方法。其基本原理为在基因组总DNA酶切后经PCR进行选择性扩增,因为材料的DNA酶切片段存在差异,便产生了扩增产物的多态性,且该技术灵敏度高、稳定性好、可靠性高、多态性丰富、不易受环境影响等特点,因此该技术在多态性研究、物种演化、品种鉴定、分子遗传图谱的构建等方面具有独特的优势。2.3.2 天麻的AFLP技术分析 谢渊25等为合理利用野生天麻种质资源、进一步系统选育,及研究野生天麻种质资源,以11份天麻种质资源为试材,在进行大量试验的基础上通过了对该技术每个环节进行研究,选择合适的条件,构建供试天麻的AFLP指

27、纹图谱,同时对AFLP分析过程中DNA提取、酶切、连接、预扩增、引物筛选、选择性扩增、电泳和银染等多种因素进行分析,得到优良的AFLP体系,并且这些品种的指纹图谱也呈现出来,P-GGAPM-GT拥有清晰明了的扩增带45条的引物构建的指纹图谱。经过试验研究发现,由于AFLP分析对反应条件非常敏感,所以要想获得可靠稳定的指纹图谱,我们必须严格控制实验条件,特别是在天麻DNA的提取过程中,必须要清除杂质用来获取高纯度DNA。 总之,AFLP分析技术是目前构造DNA指纹图谱的一种理想技术,其技术稳定可靠,多态性强,检测效率高,分辨率高,在今后天麻研究领域中具有广阔的运用空间。在对其他天麻种质遗传变异的

28、分析和研究中仍然可以发现,天麻多态性比较高26,天麻的种内存在着很多的遗传多样性,从DNA水平上来说明天麻有着地域性,表明道地药材在栽培地域上的局限性及重要性。AFLP技术对天麻种质资源的鉴定、良种选育、保护、优质天麻的可持续发展等方面都具有着很重要的意义。27283 其他 3.1 性状鉴别 呈长椭圆形,扁缩而稍弯曲,长412 cm,宽26 cm,厚0.53 cm。一端有红棕色芽苞(冬麻,俗称鹦哥嘴),或残留茎基或茎痕(春麻);另一端有自母麻脱落后的圆脐形瘢痕,习称“肚脐眼”。质坚实,半透明,不易折断,断面较平坦,角质样,有光泽,内心有裂隙,嚼之发脆有黏性。邓恒青等29对天麻环节纹进行观察,记

29、录野生天麻的家种品1代、家种品3代环节的数目、节距以及节上点数,应用Excel软件进行数理统计分析。为天麻药材品质、规格、等级等的鉴别提供新方法和新依据。30 3.2 显微鉴别 块茎横切面最外层有浅棕色的残留表皮组织,下皮面23列由栓化细胞组成,细胞向切向排列。皮层为十数列多角形细胞,有的含草酸钙针晶束。不具内皮层。中柱大,散在韧皮部维管束,周韧型或外韧型。每束导管两至数个环纹或螺纹非木化。薄壁细胞含多糖类块状物,遇碘液显暗棕色,有的薄壁细胞含草酸钙针晶柬,针晶长至90m。髓部细胞类圆形。鹦哥嘴、环节纹、肚脐痕是天麻药材性状鉴别的三大要点。31 四:总结 由于天麻是一种重要的临床常用中药,因此

30、对其进行科学有效的实验鉴别以及药理学研究具有重大的临床意义。栽培天麻、野生天麻、真伪品在理化鉴定和生物鉴定方面的研究使天麻的鉴定较为容易,随着新技术的不断出现,天麻的鉴定技术也会蓬勃发展。 参考文献1石俊英.中药鉴定学M.北京:中国医药科技出版社,2006:222-2232周铉,陈心启.国产天麻属植物的整理J云南植物研究.1983,5(4):36136.3游金辉,钟裕国.3H-天麻苷元和3H天麻素在小鼠体内分布和代谢J.华西医 科大学学报,1994,25(3);325.4郑周燕.天麻注射液治疗眩晕体会J.中国当代医学,2004,3(11):85.5刘雄.运用传统中医理论、现代药理研究和临床思维

31、学习运用天麻J.内蒙古 中医药,2008,(1):6265 6叶红,等1天麻种子、 种麻及商品麻的药理作用比较1时珍国医国 药,2003,14(9)F0037石汉,等1愈风汤天麻汤防治缺血性中风机理的实验研究1湖北中医杂 志,1995,17(2)518马宏秀,张治祥,天麻的鉴定与药理研究J.陕西中医,2011,32(11); 1534-15449Budzikiewicz H, Djerassi C, Williams DH,et al. Mass Spectrometry of Organic CompoundsM.San Francisco:Hoiden-Day Inc,1967:121.1

32、0袁卫梅,秦海林.天麻、肉桂和牡丹皮的1H-NMR指纹图解析J.河南中医药 学刊,2000,15(4):9-11.11袁卫梅,秦海林.天麻、肉桂和牡丹皮的1H-NMR指纹图解析J.河南中医药 学刊,2000,15(4):9-11.12方涛,朱开贤.用紫外光谱鉴别天麻真伪J.山西中医,1991,7(1):28-29. 13梁惠玲,吴玉,易元芬,等.EI-MS法鉴定中药天麻的真伪J.中草 药,1996,27(6):367-369.14石上梅,孙婕,杜庆鹏,等.天麻药材HPLC指纹图谱的研究J.中国药学杂 志,2005,140(10):739-741.15袁敏,张铬光,曾志.裂解色谱法测定中药指纹科

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36、 traits of maize(Zea maysL.)using an AFLP map,different testers,and cofactor analysis.Theor Appl Genet,2001(102):230-24328Lv B,Zhang L X,Wan Y S,et al.Saturating soybean SSR based genetic linkage map with AFLP markers.Molecular Plant Breeding,2005,3(2) :163-172 29邓恒青,周汉华,童红,等.天麻环节纹的观察比较及数理统计分析J.中国 民间民族医药,2009,18(11):22-2330邓恒青,周汉华,代蕾.天麻显微鉴定拾遗J.中国民族民间医 药,2009,18(13):9.31邓恒青,周汉华,代蕾.天麻显微鉴定拾遗J.中国民族民间医 药,2009,18(13):9. 17

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