梨花粉水孔蛋白初探 毕业论文.doc

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1、1 梨花粉水孔蛋白初探梨花粉水孔蛋白初探 目目 录录 摘要 .3 关键词 .3 英文摘要 .3 英文关键词 .3 一、实验材料与试剂配制方法 .3 （一）实验材料 .3 （二）主要试剂及配制方法 .4-5 二、实验步骤及方法 .5 三、实验中遇到的问题及解决办法 .5 （一）PEG4000 药品用量问题5 （二）每一份花粉培养皿中培养液体积的问题 .5 （三）关于花粉发后离心所需要的转速问题 .5 （四）关于荧光显微镜的使用方法 .5 （五）关于染色剂选择的问题 .5-6 （六）关于培养温度和渗透压问题 6 (七) 关于花粉涂抹的问题6 （八）关于封片的一些问题 .6 （九）关于花粉的选择问题

2、 6 四、 实验结果分析与讨论 6 五、 参考文献 6-7 致谢 .7 2 梨花粉水孔蛋白初探梨花粉水孔蛋白初探 摘要：摘要：梨花粉在不同渗透压下萌发率和花粉管长度会发生变化，在半抑制条件的渗透压下，水孔蛋白的 抑制剂和激活剂处理花粉培养基，会影响花粉萌发率及花粉管长度。在半抑制条件下，在培养基中加入 适当浓度的抑制剂会降低萌发率，花粉管长度变短，适当浓度的激活剂会提高花粉萌发率及增加花粉管 长度，说明水孔蛋白的活性在一定程度上影响花粉的萌发率和花粉管长度的伸长。本文通过荧光显微镜 观察花粉萌发实验，发现其中一些问题，并举出一些解决办法。 关键词：关键词：水孔蛋白； 梨；花粉萌发率；花粉管长度

3、；荧光标记 Abstract: the pear flower powder in different osmotic pressure and pollen tube length under germination ratio can produce change, in half of the conditions of the inhibition osmotic pressure, the hole of the inhibitors and activate protein processing agent pollen culture medium, can affect pol

4、len germination rate and pollen tube length. In the half inhibit conditions, with appropriate in culture of the concentration of the inhibitors reduce germination rate, pollen tube length are short and the appropriate concentration activation agent can improve the pollen germination rate and increas

5、e the pollen tube length, the protein that hole activity in the impact on pollen germination rate and elongation of pollen tube length. This article through the fluorescence microscope Observe pollen germination experiment, find some of these issues, and given a some solutions. Keywords: water holes

6、 protein; Pear; Pollen germination rate; Pollen tube length; Fluorescent marker 很早以前,人们认为水分是以自由扩散的方式进出细胞的,后来注意到动植物的一些器官、 组织具有独特的水分运转能力，例如: 动物的红细胞和肾上皮细胞,它们运输水分的速度远 非只凭扩散运输所能解释的,人的肾脏细胞平均每昼夜要过滤180L的水，植物在种子萌发及 花粉管伸长时要伴随着由体积增大而发生的水分快速吸收,这些现象均使人们猜测是否有介 导水分运输的孔道存在。20世纪90年代初,Wayne 等指出在植物的质膜上存在着水分运输通 道。1992年

7、Preston等第一次分离出具有水分运输特性的蛋白CHIP28( channel- formingprotein of 28 ku) ,它是红细胞质膜内在蛋白,在质膜上形成水分选择性运输通道, 1997年被基因组命名委员会重命名为AQP1。AQP1 的发现,掀起了人们分离、鉴定水孔蛋白( 亦称水通道蛋白) 的高潮。短短几年内,人们已在细菌、酵母、动物、植物中分离出许多水 孔蛋白同源基因。在植物中第一个水孔蛋白TIP是由Maure 等于1993 年从拟南芥中分离出来 的。TIP的cRNA 在爪蟾卵母细胞( Xenopus oocytes) 中的异源表达,证明它具有水分运输特 性,属于植物水孔蛋白

8、中的液胞膜内在蛋白(Tonoplas-t membrane intrinsic protein,TIP)。 植物质膜内在蛋白( Plasma membrane intrinsic protein, PIP)也是在拟南芥中首次发现 的，Kammerloher 等( 1994)用拟南芥根质膜内在总蛋白产生的多克隆抗血清来免疫筛选( immunoscreening) 拟南芥根cDNA文库, 得到了几个阳性克隆, 经鉴定为植物质膜水孔蛋白。 水孔蛋白与1984 年Gorin 等从牛晶体纤维( bovine lens fiber)细胞膜中分离到的MIP 基因(Major intrinsic protei

9、n)具有很高的序列同源性和结构相似性, 因此将它们同归于 MIP 家族,分子质量在26 29 ku 之间, 在生物膜中形成水通道并携助水分跨膜运输的膜内 在蛋白。绝大多数水孔蛋白形成水的选择性通道, 但也有一些水孔蛋白同时也可运输小分子 中性亲水溶质。 一、实验材料与试剂配制方法一、实验材料与试剂配制方法 （一）实验材料 本实验用梨品种丰水和翠冠花粉为试材，采自江苏省农业科学研究院梨园。成 熟的花药采下包裹于称量纸中置密闭的硅胶瓶中常温干燥 1 d 后置- 20 冰箱中保存备用。 3 （二）主要试剂及配制方法 1.花粉培养 花粉培养基：（母液一：浓缩十倍） MES(g) 蔗糖（g）硼酸（g）硝

10、酸钙（g）水（ml） 2.9350.000.050.1550.00 激活剂 -巯基乙醇:(取六支试管分别标记 100%、10%、1%、0.1%、0.01%、o.oo1%对应加入 母液 -巯基乙醇逐级稀释加入) 抑制剂氯化汞：（配置 10mmol/L、1mmol/L、0.1mmol/L、0.01mmol/L、0.001mmol/L） PEG4000+PEG6000 配置 11 份。 （母液二） PEG4000(g)PEG6000(g) 水（ml） 5.000.187518 花粉培养编号培养皿 111 1234567891011 母液 一 2.5ml + +母液 二 + +- 巯基 乙醇 100%

11、2 .5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二 + +- 巯基 乙醇 10%2. 5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二 + +- 巯基 乙醇 1%2.5 ml 加 水定 容至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二 + +- 巯基 乙醇 0.1%2 .5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二 + +- 巯基 乙醇 0.01% 2.5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二 + +- 巯基 乙醇 0.001 %2.5m l 加 水定 容至 25ml 母液 一 2.5m

12、l + +母液 二+ +氯 化汞 10mmo l/L2. 5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二+ +氯 化汞 1mmol /L2.5 ml 加 水定 容至 25ml 母液 一 2.5ml + +母液 二+ +氯 化汞 0.1mm ol/L2 .5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +氯化 汞 0.01m mol/l 2.5ml 加水 定容 至 25ml 母液 一 2.5ml + +氯化 汞 0.001 mmol/ L2.5m l 加 水定 容至 25ml 2.荧光显微观察主要试剂配制方法 50%甘油分析纯 40ml:量筒分别量取 20ml

13、 PIPES 和甘油，将两种液体在试剂瓶中混匀既得所 需溶液。4冰箱保存待用。 4%多聚甲醛（用 50mMPipes 试剂配制）分析纯 50ml:计算得配制 50ml 的 4%多聚甲醛溶液所 需多聚甲醛质量为 2g，分析天平称取 2g 多聚甲醛加入 45ml 蒸馏水在水浴锅中将其溶解，将 溶液转移入 50ml 容量瓶中加蒸馏水定容至 50ml 混匀既得所需溶液。4冰箱保存待用。 磷酸缓冲液（PBS） PH 7.4 200ml:磷酸缓冲液由磷酸二氢钾和氢氧化钠配制，分析天平 称取 1.36g 磷酸二氢钾加入 79ml0.1mol/l 氢氧化钠中溶解，将溶液转移入 200ml 容量瓶中 加蒸馏水定

14、容至 200 ml 混匀既得所需溶液。4冰箱保存待用。 染色液的配制：染色液用的 缓冲液配制，其中加入终 4 浓度质量比的二甲基亚砜，终浓度的乙二醇二乙醚二胺四乙酸 ，终浓度质量体积比的蔗糖，再加入终浓度的异硫氰酸荧光素 标记的鬼笔环肽； 二、实验步骤及方法二、实验步骤及方法 取出在-20下保存的丰水花粉，放在室温下 2 小时，取出培养皿，在编号一至十一的培养 皿中均匀的涂抹花粉，放入 20培养箱中进行培养，设置一组对照组 12（没有添加激活剂 或者抑制剂，且在正常渗透压下） 。 1. 在花粉培养一小时后，用移液器分别取出 1ml 培养基液体，放入标记好的 1.5ml 离心管， 编号 1h1、

15、1h2、1h12。 2用离心机进行离心，转速设置为 8000，时间 4min，用移液器小心吸尽培养液。 3.固定：将花粉在 4%多聚甲醛固定液中室温固定一小时。 4.分别重复步骤 13 将 2h-7h 的花粉固定。 5.洗涤：用 50mMpipes 缓冲液洗两次，每次十分钟 6.用 PBS 缓冲液冲洗一次，10min 7.染色：将花粉在染色液中黑暗处理 0.51h 8.封片及封边：以 50%甘油封片，透明指甲油封边，荧光显微镜(Zeiss，Axiovert 40 cel) 观察，采集图片。 三、三、实验中遇到的问题及解决办法实验中遇到的问题及解决办法 1.PEG4000 药品用量问题 由于花粉

16、培养基中配置所需要的 peg4000 的量比较大，如果直接加入，所购买的药品 量不够，因此，通过和指导老师交流找到了解决办法，在刚开始配置花粉培养母液时不加入 peg4000，等到最后一步配制花粉培养最终培养基时加入，每一份仅需 5g，这样大量减少了 其使用的量，既避免了浪费，又可以使实验继续进行下去。 2.每一份花粉培养皿中培养液体积的问题 第一次做的时候，取花粉培养液进行离心时，取到第四个小时之后，培养皿中培养液 基本减少完毕，不能够继续做剩下的第 5、6、7 小时的花粉离心固定，因此通过计算，通过 增加花粉培养液体积，最终每次培养用 25ml 培养液。经过实践可以得到 17 小时的，并且

17、 还有足量的剩余。 3.关于花粉发后离心所需要的转速问题 刚开始参照花粉荧光标记实验中提到低速离心，用的四 40rpm，30s。但是离心下来之 后基本上没有发现明显的沉淀，通过询问老师，又加长了离心的时间和次数，40rpm，5min 三次，结果发现，沉淀的效果仍然不明显，于是我又查阅了一些资料将知道问题出在转速的 问题上，于是我将转速调到了 120rpm，80rpm，60rmp。最终发现 120rpm 的效果最明显， 80rpm 的效果也很不错，但是在 120rpm 时沉淀物不够纯净。因此最终确定了离心的转速 80rpm。 4.关于荧光显微镜的使用方法 1打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达

18、到最亮点。 2用低倍镜白光观察，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中央。 3选择合适的激发光和滤光片。 4观察。 使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观 察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标 本时，必须用无荧光的特殊镜头油； 5.关于染色剂选择的问题 参照文献一开始选择了染色剂为 trtitcpholloidin，在实际实验进程中，又无法找到 5 其母液具体的配制方法，因此最终选择放弃，后来又查阅了南京农业大学张绍铃等的专利 一种梨花粉及花粉管微丝骨架的荧光标记方法选择了其染色液配制方法。在药品的购买 的过程当中，知道其 0.1mg 药品需要的价格为 3000，所要的花费太大，因此没有购买。

19、6.关于培养温度和渗透压问题 培养温度的选择是根据刘静等学姐梨花粉水孔蛋白初探中的花粉培养对照实验得出 的结论 20为其最适培养温度，0.5 mmol/L 聚乙二醇时，萌发率为正常情况下的一半。顾 本实验对丰水花粉选择的温度为 20，半抑制渗透压为 0.5mmol/L 的聚乙二醇。 7.关于花粉涂抹的问题 由于要进行离心处理，且所需要移取多，因此，在前两次实验，花粉量过少，导致离心 观察花粉浓度不够，所以在涂抹的时候应该涂抹整个培养液表面。 8.关于封片的一些问题 免疫荧光要注意避光，因为它是激光激发，需要在暗室里进行。封片后最好立即去拍照， 实在不行，可以选择抗猝灭的封闭液，貌似 invit

20、rogen 有，不过不便宜！可以选择在 4 度 避光保存，时间 24h 之内拍照最好。 9.关于花粉的选择问题 一开始取的是南农的材料，是 2010 年的，因此在开始的实验过程出现了一些花粉萌发率 低甚至没有萌发的情况，后来，指导老师又去采取了新的花粉，实验效果显著，萌发率，明 显提升。 四、实验结果分析与讨论四、实验结果分析与讨论 花粉落到柱头上以后，开始进行水合萌发花粉管，花粉的萌发率和花粉管的伸长与梨自 交的效率有着直接的关系。花粉随时间的积累萌发率逐渐升高，花粉管长度也是逐渐增长， 一般在 6 h 左右达到稳定状态，但期间也会有起伏变化，因为有些花粉管出现破损情况，且 花粉管破损率随时

21、间增加而增高。 培养基中含有 20%聚乙二醇，控制花粉萌发情况，不同浓度的聚乙二醇可以调节培养基 中渗透压。当花粉萌发率是正常渗透压情况下的一半时即为半抑制状态。在半抑制状态下渗 透压中培养加入不同浓度的水孔蛋白的激活剂 -巯基乙醇和抑制剂氯化汞，抑制剂抑制花 粉的萌发，而激活剂促进花粉的萌发。 水孔蛋白抑制剂降低水孔蛋白活性，降低水的通透性，花粉萌发率降低。花粉管长度减 小。水孔蛋白激活剂可以提高水孔蛋白活性，增加水的通透性，花粉萌发率增加，花粉管长 度增加。本实验通过水孔蛋白抑制剂和激活剂处理梨花粉细胞，表明水孔蛋白抑制剂和激活 剂会影响花粉的萌发情况，花粉细胞水孔蛋白活性被抑制，花粉萌发

22、率降低；而水孔蛋白活 性恢复，花粉萌发率也随之恢复。这些结果初步表明：AQPs 可能参与了梨花粉萌发和花粉管 伸长的过程。 五参考文献五参考文献 1 徐国华,张绍玲,张超英,陈迪新.梨自花与异花授粉后花粉胞内游离Ca2+分布的变 化.植物生理与分子生物学学报 ,2003,29(2):97-103 2 王春雷,张绍铃.荧光标记在植物花粉管构造及生长特性研究中的应用.西北植物学 报,2007,27(2):0407-0413 3 冯启荣,康白.水孔蛋白的功能调节及与药物的关系 .药品评价, 2004 , 1 (2) : 141-143 4 程天印,刘洵. 水孔蛋白与生理学理论的更新 .邵阳学院学报

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