棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响_因素的研究硕士学位论文1.doc

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1、分类号： 单位代码：10758 密 级： 学 号：2005107 硕士学位论文 新疆棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响 因素的研究 Study on High Efficiency Plant Regeneration System and the Influence Factors Genetic Transformation of Xinjiang Cotton Varieties in vitro 申申 请请 学学 位位 类类 别别： ： 农农学学硕硕士士 专专 业业 领领 域域 名名 称称： ： 作物作物遗传遗传育种育种 研研究究方方向向： ： 植物植物转转基因技基因技术术 2222

2、新疆棉花器官发生植株再生及遗传转化的研究 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中 不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大 学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对 本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 时间： 年 月 日 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新 疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文 档，可以采用影印、缩印或扫

3、描等复制手段保存、汇编学位论文，允许论 文被查阅和借阅。本人授权新疆农业大学将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。 (保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 时间： 年 月 日 导师签名： 时间： 年 月 日 毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明毕业设计（论文）原创性声明和使用授权说明 原创性声明原创性声明 本人郑重承诺：所呈交的毕业设计（论文），是我个人在指导教师 的指导下进行的研究工作及取得的成果。尽我所知，除文中特别加以 标注和致谢的地方外，不包含其他人或组织已经发表或公布过的研究 成果，也不包含我为获得 及其它教育

4、机构的学位或学历而 使用过的材料。对本研究提供过帮助和做出过贡献的个人或集体，均 已在文中作了明确的说明并表示了谢意。 作 者 签 名： 日 期： 指导教师签名： 日 期： 使用授权说明使用授权说明 本人完全了解 大学关于收集、保存、使用毕业设计（论文） 的规定，即：按照学校要求提交毕业设计（论文）的印刷本和电子版本； 学校有权保存毕业设计（论文）的印刷本和电子版，并提供目录检索与 阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论 文；在不以赢利为目的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 作者签名： 日 期： 学位学位论论文原文原创创性声明性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是

5、本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位学位论论文版文版权权使用授使用授权书权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权 大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论

6、文。 涉密论文按学校规定处理。 作者签名：日期： 年 月 日 导师签名： 日期： 年 月 日 指导教师评阅书指导教师评阅书 指导教师评价：指导教师评价： 一、撰写（设计）过程 1、学生在论文（设计）过程中的治学态度、工作精神 优 良 中 及格 不及格 2、学生掌握专业知识、技能的扎实程度 优 良 中 及格 不及格 3、学生综合运用所学知识和专业技能分析和解决问题的能力 优 良 中 及格 不及格 4、研究方法的科学性；技术线路的可行性；设计方案的合理性 优 良 中 及格 不及格 5、完成毕业论文（设计）期间的出勤情况 优 良 中 及格 不及格 二、论文（设计）质量 1、论文（设计）的整体结构是否

7、符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格 2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格 三、论文（设计）水平 1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格 2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格 3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格 建议成绩：建议成绩： 优优 良良 中中 及格及格 不及格不及格 （在所选等级前的内画“”） 指导教师：指导教师： （签名） 单位：单位： （盖章） 年年 月月 日日 评阅教师评阅书评阅教师评阅书 评阅教师评价：评阅教师评价： 一、一、论论

8、文（文（设计设计） ）质质量量 1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格 2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不及格 二、二、论论文（文（设计设计）水平）水平 1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格 2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格 3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格 建议成绩：建议成绩： 优优 良良 中中 及格及格 不及格不及格 （在所选等级前的内画“”） 评阅教师：评阅教师： （签名） 单位：单位： （盖章） 年年 月

9、月 日日 教研室（或答辩小组）及教学系意见教研室（或答辩小组）及教学系意见 新疆棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响因素的研究 II 教研室（或答辩小组）评价：教研室（或答辩小组）评价： 一、答一、答辩过辩过程程 1、毕业论文（设计）的基本要点和见解的叙述情况 优 良 中 及格 不及格 2、对答辩问题的反应、理解、表达情况 优 良 中 及格 不及格 3、学生答辩过程中的精神状态 优 良 中 及格 不及格 二、二、论论文（文（设计设计） ）质质量量 1、论文（设计）的整体结构是否符合撰写规范？ 优 良 中 及格 不及格 2、是否完成指定的论文（设计）任务（包括装订及附件）？ 优 良 中 及格 不

10、及格 三、三、论论文（文（设计设计）水平）水平 1、论文（设计）的理论意义或对解决实际问题的指导意义 优 良 中 及格 不及格 2、论文的观念是否有新意？设计是否有创意？ 优 良 中 及格 不及格 3、论文（设计说明书）所体现的整体水平 优 良 中 及格 不及格 评定成绩：评定成绩： 优优 良良 中中 及格及格 不及格不及格 （在所选等级前的内画“”） 教研室主任（或答辩小组组长）：教研室主任（或答辩小组组长）： （签名） 年年 月月 日日 教学系意见：教学系意见： 系主任：系主任： （签名） 年年 月月 日日 III 摘 要 棉花作为世界性重要的经济作物，由于其生长发育期恰好与各种自然灾害的

11、频发季节相重叠， 因此对棉花品种性状的要求就显得更为复杂，而传统的棉花育种方法发展到今天，面临着种质资源 贫乏、远缘杂交困难等问题，这就使棉花品种与有益性状的结合，尤其是高产、优质、多抗性状的 有机结合十分困难。利用遗传工程技术对棉花品种进行改良的研究越来越受到广大科学研究者的关 注。然而目前棉花生物技术的发展仍然存在着很多障碍，如棉花体细胞胚胎发生的基因型依赖性、 棉花组织培养的低效性（耗时、耗工） 、基因转化技术的复杂性（难重复，转化率低）和转基因棉 花农艺性状的变异等等，这些问题已经成为棉花生物技术、棉花功能基因的验证和棉花相关基因克 隆等研究领域的障碍和瓶颈。 针对上述存在的诸多问题，

12、本研究以四种不同的新疆棉花栽培品种为试验材料，探讨棉花上胚 轴离体培养高效再生植株体系的建立及农杆菌介导遗传转化中的主要影响因素，为培育新种质奠定 基础。取得的主要研究结果如下： 1 对供试的四个材料的上胚轴进行处理，采用6-BA和NAA的激素组合，进行多芽诱导，随着6- BA浓度的提高，有部分玻璃化苗的出现。经过筛选，选取6-BA 0.3mg/L + NAA 0.01mg/L为最佳芽 诱导激素组合。 2 对供试的四个材料的上胚轴进行处理，采用KT和NAA的激素组合，进行多芽诱导，以KT 0.05mg/L + NAA 0.01mg/L组合可获得高的多芽诱导率，但诱导出的多芽长势不均，且多芽诱导

13、率 低于6-BA和NAA的激素组合。 3 将诱导出的多芽切成单芽后来诱导生根，在供试的6种生根培养基中， 1/4MS + IBA 10mg/L 对再生芽的生根效果最好，生根率可达86.7%。以上胚轴为外植体，对棉花建立了操作比较简单， 系统变异小，遗传稳定性好，周期短，不依赖基因型的高效直接再生植株方法。 4 全面考察了影响外植体遗传转化频率的多种因素，包括预培养时间、浸染时间、共培养条件、 恢复培养条件以及乙酰丁香酮（AS）浓度等。结果表明：预培养35天的上胚轴在添加100mg/L乙 酰丁香酮的农杆菌重悬液中浸染15 min后共培养2天，经过3天的恢复培养之后用包含50 mg/L卡那 霉素和

14、800 mg/L头孢霉素的筛选培养基进行筛选是较为理想的遗传转化条件。 5 经卡那霉素筛选已经获得抗性小植株，取抗性植株叶片在紫外光激发下显示出绿色荧光,初 步表明GFP基因存在于抗性植株中。 关键词：关键词：棉花；上胚轴及斩首上胚轴；直接器官发生；植株再生；遗传转化 新疆棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响因素的研究 IV ABSTRACT Cotton is an important economical crop all over the world. Requirement for cotton varities characters is complicated, because p

15、hases of its growth and development nicely was consistent with seasons of high frequency of various natural disaster. The conventional breeding proposal is faced with spareness of germ plasm resource and trouble of remote ancestorscrosses, which make good characters combination be greatly inconvenie

16、nce, especially traits of high yield, good quality and muti-resistance to diseases and insects. So more and more scientific researchers pay attention to the study on improving cotton by genetic engineering technology. But many obstacles still exist in development of cotton biology at present, for ex

17、ample somatic embryogenesis of cotton is genetype-dependent, tissue culture of cotton is low efficiency (take time and energy), genetic transformation technology is intricate (repeatness and transformation are low), and variation of transgenic cottons agricultural traits is complex, and so on. These

18、 questions have become hindrance and choke point of cotton biology, validatation of cotton function gene and cotton relative gene clone. As the problems narrated above, The paper deal with four different varieties of Xinjiang cotton, Study on high efficiency plant regeneration system and the influen

19、ce factors genetic transformation of Xinjiang Cotton Varieties in vitro.The primary research results are as follows. 1 The research deal with four different varieties of Xinjiang cotton, epicotyls act as the explants in vitro.The explants were cultured on four different shoot inducement culture medi

20、ums. In the culture medium of MSB + 6-BA 0.3mg/L + NAA 0.01mg/L had the highest ratio of producing multiple shoots. But when the concentration of 6-BA is added,the vitrification phenomenon is pricked up. 2 The research deal with four different varieties of Xinjiang cotton, epicotyls act as the expla

21、nts in vitro.The explants were cultured on four different shoot inducement culture mediums.Among the different shoot inducement culture mediums, In the culture medium of MSB + KT 0.05mg/L + NAA 0.01mg/L had the highest ratio of producing multiple shoots.But the ratio of producing multiple shoots are

22、 all lower than the compounding of 6-BA and NAA.The growth instance of multiple shoots is disproportion. 3 Rooting was induced in 1/4MS added 10 mg/L IBA is the best than any other rooting culture mediums,and its ratio can reach 86.7% Shoot induction of cotton epicotyl is genetype-independent, the r

23、esults were not appeared much difference between these cultivars. It is showed that multiple shoots induction was not under the control of different genotype.The plant regeneration system is high efficiency, short cycle and maneuverable. 4 The agrobacterium-mediated gene transformation procedure was

24、 discussed in detail. The factors, including precultivation time, immersion time, cocultivation periods and concentration of acetosyringone (AS), The optimized transformation protocol was obtained when epicotyl explants precultured for 35 days on regeneration medium were immersed into the diluted Ag

25、robacterium suspension containing 100mg/L AS for 15 min and then were co-cultured for 2 days with Agrobacterium and were finally subcultured on V selection medium after reinforcing cultivation for 3 days on the regeneration medium containing 800 mg/L cefotaxime and 50mg/L Kan. 5 From treated epicoty

26、l by agrobacterium-mediated transformation,resistant plantlets have been obtained after kan resistance screeningUnder irradiation of UV,the leaf of resistant plantlets were primary inspected,the green fluorescence could be observed from the leaf of resistant plantlets. Key words: Cotton(Gossypium hi

27、rsutum L. and G.barbadense L.); epicotyl and decapitated epicotyl explant; direct organogenesis; plant regeneration; genetic transformation 新疆棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响因素的研究 VI 目 录 第一章 文献综述 1 1.1 植物组织培养理论基础、应用及发展概况.1 1.2 植物基因工程概述、应用及发展概况.5 1.3 棉花组织培养植株再生研究进展.6 1.4 遗传转化研究在棉花育种上的应用11 1.5 GFP 报告基因的检测19 1.6 本研究

28、的目的和意义19 第二章 材料和方法 21 2.1 试验材料21 2.2 试验方法21 第三章 结果与分析 .29 3.1 上胚轴外植体的多芽诱导29 3.2 不同激素组合对多芽诱导的影响32 3.3 培养基中添加 IBA 对生根的影响34 3.4 培养条件对棉花遗传转化的影响35 3.5 GFP 基因的检测39 3.6 讨论40 第四章 结论 42 本研究论文创新点 43 参考文献 44 附录缩略词表 50 VII 致谢 51 个人简介 52 1 第一章 文献综述 棉花（Gossypium hirsutum L. and G.barbadense L.）是重要的经济作物。世界上约 有 60

29、多个国家种植棉花。我国是世界上最大的棉花生产国和消费国，在农业生产及整 个国民经济中棉花具有重要的作用。目前，我国棉花种植地区依据其不同的生态类型 可划分为三大棉区，即西北内陆棉区、长江流域棉区和黄河流域棉区。新疆隶属西北 边陲，西北内陆棉区主要就是指新疆棉区1。棉花喜温好光，温度和光照对纤维成熟度 和强度影响很大。新疆作为我国特大型的优质商品棉基地，由于自然条件得天独厚， 越来越显示出其重要性。自 90 年代以来，新疆棉区的棉花种植面积和棉花产量都在迅 速增加，现在新疆棉花种植面积占全国 1/5，棉花总产量占 1/4，对保证我国棉纺工业 的原料供应，改善棉花供求关系发挥着重要作用2,3。如今

30、新疆棉花生产既是新疆的重 要经济支柱，也是稳定国家棉花供应的重要保障。然而，因为长期以来在品种之间杂 交使其遗传变异越来越狭窄，而且周期较长，常规遗传育种方法在改进棉花品质、产 量和抗性方面已不再像过去那样有效。为了加快育种速度，利用高新技术，将抗蚜虫 基因、抗黄萎基因、抗旱基因、抗盐碱基因构建转化到棉花品种中的研究越来越受到 科学研究者的关注。植物组织培养技术是植物生物技术的重要组成部分，既为基因工 程提供理想的受体材料，又为常规的植物改良程序提供了一种新的手段，从而使很多 传统方法难以解决的问题迎刃而解，在生产实践中有着重要应用前景4。同时，.随着 基因工程技术的发展，植物组织培养又为植物

31、遗传转化奠定坚实技术基础，对培养抗 病虫害、抗逆、高产、优质的作物新品种正发挥着巨大潜力和作用，其应用必将使作 物育种工作在原有传统技术基础上进一步朝着精确化、高效化的方向发展5。 1.1 植物组织培养理论基础、应用及发展概况 1.1.1 植物组织培养的概述 植物组织培养（Plant tissue culture）是以细胞生物学、遗传学、植物生理学等学 科为基础，在人为控制的条件下，把植物的器官、组织、胚胎、细胞或原生质体置于 无菌的环境中，供给它们足够的营养物质，同时给予适宜的环境，使它们得以生存和 发展的一种培养方法。由于培养的对象大多是脱离植物母体的外植体，培养的器皿一 新疆棉花高效再生

32、体系建立及其遗传转化影响因素的研究 2 般是在试管内，所以植物组织培养也叫离体（体外）培养（culture in vitro）或试管培 养（culture in test-tube）6,7。 作为植物生物技术支柱之一的植物组织培养技术，其历史可以追溯到 Schleiden（1938）和 Schwann（1939）的细胞学说，甚至可以推前到 1902 年 Haberlandt 发表关于植物叶肉细胞培养的研究开始，至 20 世纪 60 年代，植物组织培养 技术得到了迅猛的发展，形成了比较完整和成熟的体系。目前，这一技术已成为一门 精细的实验科学，所建立的成套标准操作程序已在实践中得到广泛应用，特别

33、是在快 速繁育名贵花卉、果木、树木、蔬菜、药用植物和农作物等方面都已取得了显著的经 济效益和社会效益。植物组织与细胞培养技术（细胞工程） 、重组 DNA 技术（基因工 程）构成了植物生物技术的主体。从应用上来看，可以分成两个方面：一类是与遗传 改良直接有关的技术（原生质体培养与融合、染色体工程、基因工程等） ；另一类是与 繁殖有关的间接的技术（如微体繁殖） ，它们对作物育种都有着重要作用。最近植物组 织培养在植物生物技术研究方面所展示的成就为弥补作物育种常规技术的某些局限性 提供了非常值得重视的机会和可能性8-12。 1.1.2 植物组织培养的基本理论 植物组织细胞培养的理论基础是建立在细胞学

34、说和细胞的全能性的概念上。植物 细胞的全能性（totipotancy）是指植物的每个细胞具有该植物的全部遗传信息和离体细 胞在一定培养条件下具有发育成完整植株的潜在能力。在植物的生长发育中，从一个 受精卵分裂到产生具有完整形态和结构机能的植株，这是该受精卵具有该物种全部遗 传信息的表现。同样，植物的体细胞也是从合子的有丝分裂产生的，也具有全能性， 即具备着遗传信息的传递、转录和转译的能力。在一个完整植株上，某部分的体细胞 只表现一定形态、行使一定的功能，这是由于它受到具体器官或组织所在环境的束缚， 但其遗传潜力并没有丧失；一旦脱离其原来的器官或组织影响，如处于离体状态，在 一定的培养条件下，就

35、可能表现出全能性，并发育成完整植株。经过科学家的数十年 不断努力，现在已经完全证实了植物细胞的全能性。其中 50 年代，F. Skoog，F. C. Steward 及其他的一些学者确定了植物组织生长所必须的营养成分，设计了许多适合各 种植物组织培养的有效配方，如 MS、 B5 、N6 、SH 等，使植物的外植体培养在适宜 的培养基上形成脱分化而待分化的细胞团愈伤组织，Skoog 等人又证实了改变培养 3 基中的植物生长调节物质（生长素和分裂素）相对浓度可使烟草愈伤组织分化出苗或 根。Steward 等人发现了胡萝卜愈伤组织在液体悬浮培养下会形成体细胞胚，其发育阶 段与合子胚相似，最后形成小植

36、株。此后又证实了胡萝卜单一的细胞亦具有这种能力。 这些研究结果都是细胞全能性经典例证13,14。 1.1.3 植物组织培养再生植株途径及方式 尽管已确立了植物细胞全能性的理论，但实践上，全能性表达的难易程度在各种 植物，甚至在同一植物，同一组织的不同细胞之中都有很大的差别。一般来说，较易 表达全能性的细胞可有 3 类：受精卵、发育中的分生组织细胞和雌雄配子体及单倍体 细胞。在绝大多数的情况下，植物细胞全能性的表达要经过一个从分化状态到脱分化 的愈伤组织的中间形式，然后进入再分化和再生的阶段，但也有的在植物组织中直接 发生脱分化和再分化的过程，而不需经历愈伤组织的中间形式。所谓脱分化就是指使 已

37、分化的组织（细胞分裂已停止）在适当的培养条件下恢复细胞分裂活性，从已分化 的状态转变成未分生状态。愈伤组织即为典型的脱分化的组织。脱分化的组织或细胞 在一定的条件下有可转变为各种不同细胞类型的能力，这一过程即称为再分化。因此， 培养的植物组织或细胞可以通过诱导根、芽等器官形成，或通过体细胞胚发生途径， 两条途径经历或不经历愈伤组织中间形式而实现植株再生15-18。由此植物组织培养再 生植株的过程可概括为： 体细胞胚发生植株再生途径：通过体细胞胚发生再生完整植株。 直接体细胞胚发生再生植株方式（不经历愈伤组织阶段）： 外植体 体细胞胚 完整植株 间接体细胞胚发生再生植株方式（经历愈伤组织阶段）：

38、 脱分化 再分化 外植体 愈伤组织 胚性愈伤组织 体细胞胚 完整植株 器官发生植株植株再生途径：培养的植物组织或细胞通过诱导形成根、芽等器官 再生成完整植株。 直接器官发生再生植株方式（不经历愈伤组织阶段）： 外植体 芽或根 诱导芽生根或根长芽 完整植株 间接器官发生再生植株方式（经历愈伤组织阶段）： 新疆棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响因素的研究 4 脱分化 再分化 外植体 愈伤组织 芽或根 诱导芽生根或根长芽 完整植株 直接分化形成器官再生系统具有如下特点：获得再生植株的周期短，操作简单， 因为外植体直接分化出再生植株，省略了愈伤组织诱导培养过程；由于未经脱分化的 细胞直接分化芽，因此

39、体细胞无性系变异小，能较好地保持受体植物的遗传稳定性， 转化的外源基因也能实现稳定地遗传。 1.1.4 植物组织培养技术的影响因素 理论上每一个植物细胞都具有再生成完整植株的能力，即细胞全能性。但在实际 应用中组织的再生受植株基因型、组织来源、生理状态等多种因素的影响。植株的基 因型起决定性作用，不同基因型的植株其再生能力有很大差别，通常幼嫩植株的芽比 成熟植株的再生能力强，这可能是幼嫩植株分生能力旺盛的结果19。外部环境因素： 如培养基种类、盐浓度、琼脂、pH值、生长调节物质、碳水化合物、光照和温度及继 代培养次数等对植株的再生也有很大影响。琼脂浓度一般在0.60.8%，琼脂本身不提 供任何

40、营养，仅起到支持培养物的作用，但琼脂的用量需适当，琼脂浓度过高会使培 养物不能与培养基紧密接触，不能很好的吸收养分而变黄，浓度过低试管苗水势高， 玻璃化现象严重。大多数植物培养基的pH值在6.0，适当的降低pH值可以降低多酚氧化 酶的活性和底物利用率，从而抑制褐变。培养基的pH值还可以通过影响培养物的营养 元素的吸收过程来影响呼吸代谢、多胺代谢与脱氧核糖核酸合成、植物激素进出细胞 等作用，进而直接或间接的影响愈伤组织的形成及形态建成20。组织培养中常用的有 生长素和细胞分裂素两大类。生长素主要促进细胞分裂、诱导愈伤组织产生和促进生 根等，常用的有NAA、IBA和2,4-D。细胞分裂素主要促进细

41、胞分裂、改变顶端优势和 促进芽的分化等，常用的有KT、6-BA、ZT和2-ip等。光周期由植株的生理特性决定， 以16h光照居多，24h或12h光照也有报道。一般来说，光照过强可使多酚氧化酶活性提 高，褐化程度加强；光强低不利于外植体分化；弱光或全黑会促进愈伤组织分化和根 的再生。温度对植株的生长也有一定的影响。温度过高会导致分化芽出现玻璃化苗及 褐化程度严重；低则苗生长缓慢。继代次数对组培苗的生根、外植体褐变和试管苗褐 化等都有一定的影响。处于幼年期的组培苗生根较成年期的组培苗生根容易的多。继 代有利于减轻褐化情况，但继代次数过多玻璃化频率提高21,22。 5 1.1.5 植物组织培养技术的

42、应用及发展趋势 随着对植物组织培养技术的深入研究和广泛应用，现在又发展了更多的、更实用 的技术，这类应用技术主要包括植物转基因技术、原生质体融合技术、植物体外受精 技术、植物快速繁殖技术等。这些技术的建立不论是在植物的品种改良、植物种质保 存、植物突变体的筛选、植物快速繁殖、植株脱毒及植物产品的生产方面，还是在为 植物基因工程创造前提条件等方面都发挥着重要作用20。植物组织培养技术的研究与 应用是生命科学的主要组成部分之一，但是由于植物本身的生长发育机理比较复杂， 再加上植物组织培养技术 的影响因子较多，以及在植物组织培养过程中出现的感受态、 决定作用、外遗传变化、驯化作用等现象的 机理有待探

43、索研究，还有污染、玻璃化、褐 化和衰败等许多问题没有解决，人们对组织培养的认识还只能算是初步的21,22。 1.2 植物基因工程概述、应用及发展概况 1.2.1 植物基因工程概述 植物基因工程是有目的地将外源 DNA 导入植物，使之整合、表达并能稳定遗传的 技术。具体操作步骤为：通过提取并在生物体外对 DNA 分子进行剪切、拼接、修饰等 获得需要的 DNA 特定片段（目的基因） ；选择基因的合适运载体，使目的基因和运载 体结合得到重组 DNA；将重组 DNA 引入植物细胞并使其增殖；创造条件，使整合目 的基因的植物细胞生长为植物体，进而育成植物优良新种（或新品种）23。用于定向 创造植物新类型

44、的基因工程技术称为植物转基因技术，这一技术打破了生物的种间隔 离，大大扩大了物种之间的基因交流范围，所产生的植物新类型称为转基因植物，这 种遗传物质经过改造的植物在性状、营养和消费品质等方面可以向人类需要的目标转 变。而且，用转基因的方法比常规的杂交育种方法，在育种周期上要缩短 34 年，展 示了植物基因工程在育种上的应用前景24。大量转基因植株的研究表明其在作物育种 上具有以下特点：植物基因工程是在基因水平上来改造植物的遗传物质，更具有科 学性和精确性；定向改造植物遗传性状，提高了育种的目的性和可操作性；大大 地扩展了育种范围，打破了物种之间地生殖隔离障碍，实现了基因在生物界地共用性， 丰富

45、了基因资源；集现代新技术为一体，如 DNA 重组技术、分子杂交技术、细胞培 养技术、基因转化技术、及基因表达调控技术等等，使育种途径进入一个高新技术时 新疆棉花高效再生体系建立及其遗传转化影响因素的研究 6 代25。 1.2.2 转基因植物应用和发展趋势 目前植物转基因技术主要在以下方面得到应用：抗性基因工程，也被称为第一 代植物基因工程。该工程是一项研究最早，技术最为成熟，而且应用规模最大的植物 转基因技术。主要包括抗虫基因工程、抗病基因工程、抗除草剂基因工程以及抗逆 （盐碱、寒、冻、旱）基因工程。如已进入商业化生产的 Bt 转基因抗虫棉、抗草甘膦 大豆、抗虫转基因玉米等等。植物品质改良基因

46、工程。该工程是目前植物转基因技 术研究的一项热点，主要包括植物蛋白品质改良、碳水化合物（如淀粉、糖等）品质 改良；脂肪、维生素品质改良以及后熟品质改良等。有特殊疗效的保健食品、功能 性食品以及治疗性食品。其他方面的应用还有杂种优势新品种的培育、生物反应器生 产药物等26,27。 转基因植物就是人们利用生物技术为了解决人类的粮食短缺、生态环境破坏等 问题对现有生物体进行改造而产生的。与现有的植物物种相比，转基因植物具有更 强的抗病虫能力和抗逆境胁迫能力、更高的产量、更优的营养等优点。自从 1983 年 首次获得转基因烟草以来，至今已有 35 科 200 多种植物转基因获得成功，涉及粮食 作物（水

47、稻、小麦、玉米等）、经济作物（棉花、大豆、油菜等）、蔬菜（番茄、 黄瓜、胡萝卜等）、瓜果（苹果、核桃、甜瓜、等）、牧草（苜蓿、白三叶草等）、 花卉（矮牵牛、菊花、香石竹等）和林木（泡桐、杨树等）28。 转基因植物技术及其产品是当今世界农业生物技术研究与产业化开发的重点和热 点，是我国农业科技革命的核心内容之一，对我国农业科技手段的更新换代以及农业 产业结构的调整具有重要的战略意义29。目前，一些重要有经济价值的转基因植物已 陆续进入大田，并取得了较好的经济效益、社会效益和环境效益，在解决人类所面临 的资源短缺、环境恶化和效益衰退三大难题中显示出越来越重要的作用，为农业的持 续、稳定发展提供了强有力的保障30。 1.3 棉花组织培养植株再生研究进展 1.3.1 体细胞