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1、2巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子Ein3的western印迹海南大学毕业论文（设计） 题 目： 巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子 Ein3的western印迹 学 号： 20110101310079 姓 名： 年 级： 11 级 学 院： 农 学 院 系 别： 生 物 技 术 系 专 业： 生 物 技 术 指导教师： S 完成日期： 巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子Ein3的western印迹 摘 要天然橡胶是一种非常重要的工业原料，也是经济建设和国防建设不可缺少的稀缺资源和战略物资，可以说它是现代经济的命脉,还是一种军事和外交资源并且直接关系到国家的经济和政治的稳定。世界上超过90%的天然橡胶是来自巴
2、西橡胶树。因此对巴西橡胶树的研究有着极其重要的经济价值和战略作用。在巴西橡胶研究中发现对树干的机械损伤会对其乙烯途径产生影响，而乙烯的排放量对排胶量有一定的影响，因此我们探究对叶片的损伤是否和对树干损伤一样对其乙烯途径产生影响。此实验通过刮伤叶片后不同时间的处理后提取叶片蛋白，而后通过特异性乙烯抗体的免疫印迹来检测刮伤对其乙烯途径的影响。在此过程中运用三种不同的方法测定叶片蛋白的浓度，并对其准确性进行对比分析。关键词：巴西橡胶、定蛋白、乙烯途径、免疫印迹目录摘要Abstract1前言1.1巴西橡胶及中国橡胶产业介绍1.2巴西橡胶的乙烯途径1.3转录核心调控因子EIN3/EIL11.4本研究的目
3、的和意义2实验器材及试剂配方2.1实验器材2.2、试剂配方3方法步骤3.1材料处理3.2提蛋白3.3定蛋白浓度：3.4十二烷基硫酸钠（SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳3.5蛋白免疫印迹3.6显色鉴定4结果与分析4.1三种方法定蛋白及比较分析1前言1.1巴西橡胶及中国橡胶产业介绍 天然橡胶是经济建设和国防建设不可缺少的稀缺资源和战略物资,它与石油、铁矿石、有色金属并列为四种紧缺型工业原料,在生产地域和产品的性能上具有不可替代的作用。它是现代经济的命脉,还是一种军事和外交资源并且直接关系到国家的经济和政治的稳定。天然橡胶资源的安全对于国家经济的安全甚至国家的安全都具有非常重要的意义。目前我国天然橡胶资
4、源供需缺口日趋扩大、进口依赖性日益增强、自给能力不断下滑等问题的存在,这对于我国经济发展和国防建设是极其危险的。保障我国的天然橡胶资源的安全,事关中国经济的发展和稳定,对世界天然橡胶的安全保障也具有非常重要的意义。1.1.1原产地及我国的主要分布巴西橡胶的原产地在亚马逊河盆地，虽然巴西橡胶生长在整个亚马逊河盆地，但每公顷只能发现与其他树种极端混生少量的几株。经常被认为是扩大种植才引种到其他地方的，但是，病害也是其中很重要的原因。1中国植胶区地处热带和南亚热带地区,水热条件充沛,具有发展橡胶树的一定条件,特别是海南、云南的西双版纳等地,常年基本无霜,年均日照时数达到17 00一2400hr ,年
5、均气温在19.5一23.0,最冷月均温也在15.0以上;年降雨量1500一2500mm,但干湿季节明显,11月至翌年4月为旱季,5月一10月为雨季, 降雨量占全年的60一90%，相对湿度在80%以上,由于中国植胶区位于赤道以北18一24度,大大超过了世界植胶的热带地区(赤道以南10 度至赤道以北15度)的界限,是公认的不宜植胶地,主要问题是台风和低温两大自然灾害,对橡胶树的影响带来了一系列的问题。21.1.2巴西橡胶的分子研究进展 橡胶树的分子生物学在各方面的研究都取得了一系列的成果，但相对于模式植物和粮食等经济作物来说，橡胶树的分子生物学研究起步较晚，研究难度较大，研究明显滞后。目前，对于天
6、然橡胶的生物合成途径虽有一定的了解，与橡胶树合成相关的一些基因也相继克隆，并研究它们的一些基本功能，但所报道克隆的cDNA大都用异源同类基因从巴西橡胶树构建的cDNA文库获取，从巴西橡胶树克隆的新基因不多，难以从整体水平上解释胶乳再生的分子机制，此外橡胶树死皮病发生的分子机理的相关研究也有待深入。另外，分子标记技术在橡胶育种中的应用的研究，橡胶树的遗传转化体系完善的研究力度都有待进一步的加大。31.1.3我国橡胶的产业发展我国橡胶产业发展的战略定位是“巩固”、“提升”、“稳定”、“发展”。按照全国天然橡胶优势区域布局规划，科学合理地开展植胶生产，不断巩固现有产业基础。目前应做好做足现有生产技术
7、执行和胶园管理工作，深刻理解领会橡胶树栽培技术规程和割胶技术规程，结合实际情况，制定更为细致可行的实施细则，力争做到科学合理，稳步推进我国植胶业发展提升。41.2巴西橡胶的乙烯途径1.2.1乙烯的生物合成及其在植物生命活动中的作用在所有的维管植物生命活动中乙烯都是通过杨氏循环合成的，即S-腺苷甲硫氨酸被ACC合成酶所催化形成乙烯前体1-氨基环丙烷羧酸（ACC）。ACC被其氧化酶催化形成乙烯、HCN和二氧化碳。ACC合成酶（ACS)和ACC氧化酶是乙烯合成的关键所在。5 乙烯对植物的代谢调节是贯穿其整个生活周期的。首先，在种子萌发期，乙烯可以促进下胚轴膨胀变粗，使其容易破土而出；乙烯还对陆生植物
8、茎的延伸有着抑制作用，可以使树干变得更粗以抵抗大风的侵袭，而对半水生植物茎的生长有很强的促进作用；它还可以帮助水淹植物维持生命，还可以抵抗病菌对植物的侵袭；其次，在植物成熟期，乙烯可以影响植物的性别分化并促进其果实成熟；乙烯在叶片和花的衰老中亦起到重要的作用。乙烯最重要的生物学反应是黄化胚芽的三重反应：即茎杆的偏向水平生长、下胚轴膨胀变粗和顶端钩状芽弯曲的加剧。51.2.2植物伤害乙烯的产生切割、碰撞和擦伤等均可引起植物组织、器官的乙烯释放量的增加，这种增加释放的乙烯称之为伤害乙烯。6橡胶的割胶也是一种机械伤害，因此，橡胶割胶后会产生大量的伤害乙烯，增加了依稀的释放量。7除此之外，物理压力、昆
9、虫或微生物的侵袭、化学处理、辐射、干旱和极端温度等也能刺激植物组织产生乙烯。对巴西橡胶树木质器官进行的锤击实验结果表明，巴西橡胶树木质器官遭到机械创伤后与离体的组织器官一样，会产生伤害乙烯。81.3转录核心调控因子EIN3/EIL1乙烯途径信号转导的下游事件是发生在细胞核内的基因转录调控，由植物特有的核蛋白EIN3/EIL1所介导，EIN3是一个乙烯反应的正调控因子。9大部分与乙烯相关的生物学过程都通过核心转录因子EIN3/EIL1调控下游的靶基因来实现的。EIN3 编码一个由628个氨基酸组成的转录因子. EIN3/EIL1可以划分为3个基本的结构域: DNA 结合结构域(80-359aa)
10、、二聚体化结构域(113-257aa)和C 端.101.4本研究的目的和意义 2实验器材及试剂配方2.1实验器材 -20度冰箱、-80度冰箱、研钵、量筒、试剂瓶、烘箱、气浴锅、分析天平、各个量程的移液枪、通风橱、电泳仪、转膜仪、灭菌锅、制冰机、摇床、1.5ml试管、2.0ml试管、50ml离心管、微波炉、镊子、剪刀、培养皿、各个规格的枪头、离心机、分光光度计、真空干燥仪2.2、试剂配方（1）Esen fixing buffer (蛋白固定液） 异丙醇 25% 乙酸 10% 去离子水 65%（2）Esen staining buffer(蛋白染色液） 0.1% coomassie brillia
11、nt blue G250 dissolved in Esen fixing buffer（3）Protein extraction buffer(蛋白提取液） Tris-cl ph6.8 62.5mm Glycerin 20% SDS 2% Bromphend blue a little -merkapto ethanol 1%（4）SDS-PAGE 凝胶 10% 7ml 40% Acrylamid 1.75ml 1.5M Tris-cl ph8.8 1.9ml 10% SDS 70l 10% APS 70l ddH2O 3.25ml TEMED 7l 4% 2.5mll 40% Acryla
12、mid 250l 1M Tris-cl ph6.8 630l 10% SDS 25l 10% APS 12.5l ddH2O 1.90ml TEMED 5l（5）Loading buffer(上样缓冲液） SDS 10% w/v Glycerol 20% v/v Tris-cl ph6.8 0.02mM Bromphend blue 0.05% w/v -merkapto ethanol 10mM（6）Staining buffer(蛋白胶染色液） Methanol(甲醇） 91ml Acetate(冰醋酸） 18.4ml coomassie brilliant blue R250 0.8g
13、H2O 91ml Distaining buffer I(蛋白脱色液） Methanol 50% Acetate 10% H2O 40% Distaining buffer II(蛋白脱色液） Methanol 30% Acetate 10% H2O 60%（7）TBST buffer Tris-cl ph7.5 50mM Nacl 150mM Tween-20 0.1%3方法步骤3.1材料处理 在温室中选取两株长势良好且叶片健康的巴西橡胶树，在两株橡胶树上各选取6片叶龄相、无虫咬痕的幼嫩叶片并标记。每片叶片都用镊子在其正反两面进行刮伤，刮伤完成之后两株各取一片用铝箔包裹保存于-80度冰箱。后
14、面分别隔1h、4h、6h、12h、24h从两株橡胶树上取叶片铝箔包裹并标记后保存于-80度冰箱。取叶片的时间分别为2014年3月18日9点、10点、13点、15点、21点、次日9点。（处理叶片及取叶片过程中必须戴手套操作且镊子需经过严格消毒）3.2提蛋白 取处理过的低温避光保存的叶片放入-20度预冷的陶瓷研钵中加入液氮沿一个方向快速研磨，待其研磨成粉末状时加入蛋白提取液继续研磨一定时间后，吸取沉淀装入2ml试管中，然后放入95度气浴锅中高温加速提取蛋白10min。提取完成后称其重量配平后在14000rpm的离心机中离心10min，离心完成后用移液枪吸取上清液于1.5ml试管中保存于-20度冰箱
15、。其他几个时间处理按此步骤提取蛋白并-20度保存。3.3定蛋白浓度：3.3.1Bradford法 Bradford 法属于染料结合法, 即考马斯亮蓝G-250 在酸性溶液中呈红棕色,与蛋白质结合后转变为蓝色, 颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。Bradford 法法测定蛋白浓度的范围为31 .25 2 000 g/mL。影响Bradford 法的主要因素有甘油、乙酸、去污剂和一些碱性缓冲系统。13.3.2CBA法 BCA 法的测定原理为蛋白质价铜离子还原成亚铜离子, 后者在碱性溶液中与BCA 结合生成紫红色络合物。BCA 法标准蛋白浓度设置在20 1 000 g/mL 时r 值仍大于0.998。影
16、响BCA 法测蛋白的主要因素有蔗糖、NH+4、尿素、EDTA。尿素和-巯基乙醇会干扰BCA 法的测定, 所以BCA 法不适于含有尿素和-巯基乙醇的变性液中蛋白含量的测定。23.3.3Esen method（1） 在高通量蛋白定性滤纸上画出1cm1cm的方格。（2） 配置浓度梯度为0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml的牛血清蛋白液，并准备0h、1h、4h、6h、12h、24h的样品蛋白液。（3） 在格子中心用移液枪滴加5l牛血清蛋白和蛋白样品，每个浓度和样品各两个格子，待其自然干燥。（4） 干燥后置于培养皿中，加入配置好的Esen fixing buffer在
17、摇床上固定蛋白5min。（5） 弃去蛋白固定液后加入Esen staining buffer在摇床上染色15min。（6） 染色后取出用开水冲洗两次，每次10min。（7） 待其风干后用剪刀沿染液边缘剪下放入2ml试管中,加入0.5%的SDS溶液1.5ml，放入55度气浴锅中煮1h。（8） 取恢复室温后的液体1ml在分光光度计中测OD612。（9） 记录数据并做标准曲线（相似度R0.99才能根据标准曲线进行蛋白浓度的计算。 3.4十二烷基硫酸钠（SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳3.4.1分离胶灌制 按照试剂配方配置10%分离胶7ml，按电泳槽说明书组装凝胶电泳模具, 用移液枪吸取10%分离胶溶液,
18、 沿隔板缓慢加入模具内中, 避免产生气泡,当加入的溶液至前玻璃板2cm 时即可停止.轻轻在分离胶溶液上加入一层15mm的去离子水层,这使凝胶表面平整.等待1530min，待凝胶聚合. TEMED要在注胶前再加入，混合后快速注胶.注胶过程一次性完成, 避免产生气泡。3.4.2浓缩胶灌制 按照试剂配方配置4%浓缩胶2.5ml，用移液枪吸取浓缩胶溶液缓慢加入分离胶上面,直至凝胶溶液将要到达前玻璃板的顶端,插入梳子,凝胶聚合时间约30 min,然后小心拔出梳子,将凝胶放入电泳槽内,接好电极,将电泳缓冲液加入电泳槽中，要求凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液中.需同时放置两块制好的胶,一块用考马斯亮蓝进行染
19、色后脱色观察对照，另一块则进行转膜后的免疫印迹。3.4.3制备样品和上样 把-20度保存的已经确定蛋白浓度的6组不同处理的蛋白样品按10g的上样量吸取一定量于1.5ml试管中并标记，按照试剂配方配置一定量的上样缓冲液，在各个样品中加入等体积的上样缓冲液混匀后在95度气浴锅中煮10min。在凝胶的左边第一个孔中各加入6l的双色预染宽分子量蛋白Marker。用来转膜杂交的凝胶从左到右第3、4、5、7、8、9孔中分别用移液枪加入10g处理时间为0、1、4、6、12、24h的样品至孔底部，另一块染色观察的胶从左到右第2-8孔分别上样10g处理时间为0、1、4、6、12、24、24小时叶片蛋白样品。3.
20、4.4电泳 打开电泳仪，将电流调至15mA，等加入溴酚蓝上样缓冲液的样品跑完浓缩胶浓缩成一条粗线进入分离胶后将电流调至30mA进行蛋白的分离，待溴酚蓝跑的距离胶底部0.5-1cm时关闭电源停止跑胶。3.4.5染色与脱色 电泳完成后将两块胶分别拆下去掉浓缩胶后在其右上角切去一小块胶以确定胶的正反面。然后一块胶进行染色脱色，另一块胶进行转膜及后续工作。配置含0.8g考马斯亮蓝R250的蛋白染色液200ml，将胶放入玻璃皿中后加入蛋白染色液侵没整块胶，然后放在低转速的摇床上染色1.5h。染色完成后将胶从染色液中取出放入另一玻璃皿中并加入脱色液I在低转速摇床上脱色30min，弃去脱色液，加入脱色液在相
21、同转速的摇床上脱色过夜。3.5蛋白免疫印迹（1）取胶：电泳完成后将胶取下后用去离子水冲洗。（2）平衡：将胶放入转移液中在摇床上平衡以除去SDS。（3）PVDF膜：剪和胶大小相当的PVDF膜，将膜放入100%的甲醇 中浸泡10min，然后将膜放入转移液中浸泡10-20min。（4）装板：装板顺序：黑板海绵三层滤纸胶PVDF膜三层滤纸海绵白板。装板全过程在盛有转移液的培养皿中进行，滤纸之间以及滤纸和PVDF膜要赶走所有的气泡。然后将夹板放入转移槽中，黑板相对黑极，白板对白极(正极）。 （5）转膜与验证：将组装好的转移槽放入冰盒的冰上，电流调到70mA左右开始转膜，1.5-2h后转膜停止。转膜完成后
22、的凝胶取下浸入含0.8g考马斯亮蓝R250的蛋白染色液中，在低转速的摇床上染色1.5h。染色完成后将胶从染色液中取出放入另一玻璃皿中并加入脱色液I在低转速摇床上脱色30min，弃去脱色液，加入脱色液在相同转速的摇床上脱色过夜。第二天观察经过染色脱色后的凝胶上是否还有条带，以确定转膜是否成功。（6）交联和封闭： 将膜取出后，先用去离子水清洗，然后入1TBS中浸洗5min，再加入0.2%戊二醛的TBS中交联45min。 将膜放入1 TBS中漂洗，除去固定交联剂，5min/次，2次。 封闭糖基：浸入高碘酸钾溶液中在暗处封闭1h。 TBS漂洗5min，加入含10%的脱脂奶粉的TBS封闭液在4度的环境下
23、封闭过夜。（7）一抗孵育与清洗： 一抗孵育：将膜从封闭液中取出浸入用封闭液稀释1000倍的一抗Ein3中，放入摇床，在37度60rpm下孵育2-3h。 一抗清洗：用含0.05%（v/v）的tween-20的封闭液室温下清洗3次，每次20min。（8）、二抗孵育与清洗： 二抗孵育：将清洗掉一抗的膜浸入用封闭液稀释2000倍的二抗羊抗兔中，放入摇床，在37度60rpm下孵育2-3h。 二抗清洗：用1TBS摇床清洗3次，每次20min。3.6显色鉴定二氨基联苯胺（DAB）是过氧化物酶的生色底物，在过氧化氢存在的情况下失去电子从而呈现出颜色的变化和积累，形成浅棕色不溶性的产物。用来检测过氧化氢酶的活性
24、时灵敏度高且特异性好。二氨基联苯胺（DAB)是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，所得产物为不溶于水、醇和二甲苯的棕色沉淀物而被广泛用于蛋白免疫印迹。取二氨基联苯胺40倍浓缩液、双氧水40倍浓缩液、TBS40倍浓缩液各一滴于2ml试管中，加入2ml的去离子水震荡使其混合均匀。然后用移液枪加到二抗孵育后的PVDH膜上，在摇床上显色10-30min。最后观察显色后的PVDH膜。4结果与分析4.1三种方法定蛋白及比较分析4.1.1Esen method 定蛋白浓度（1）OD612数据记录表Protein probeOD612 wert1OD612 wert2averageBSA（mg/ml）0.
25、250.0640.0720.0680.50.1060.0880.0971.00.1530.1430.1482.00.2210.2350.228Sample 0h0.1560.1580.157 1h0.1720.1660.169 4h0.1790.1950.187 6h0.1500.1500.150 12h0.1670.1630.165 24h0.1750.1630.169（2）标准曲线（3）样品蛋白浓度（OD612值代入y=0.090x+0.050）样品蛋白浓度(g/l)上样量(l)0h1.198.41h1.327.64h1.526.66h1.119.012h1.281.824h1.327.6
26、4.1.2Bradford法定蛋白浓度（1）Bradford数据记录表Protein probeBradford wert1Bradford wert2averageBSA（mg/ml）0 000 0.020.1220.1120.117 0.040.1800.1820.181 0.060.2700.2880.279 0.080.3310.3250.328 0.100.4100.4000.405Sample 0h4.895.014.95 1h5.035.075.05 4h5.895.815.85 6h4.514.394.45 12h5.455.455.45 24h5.114.995.05(2)标
27、准曲线（3）样品蛋白浓度（OD值代入y=3.615x+0.045）样品蛋白浓度(g/l)上样量(l)0h1.367.351h1.387.254h1.616216h1.228.1912h1.506.6724h1.387.254.1.3BCA法定蛋白浓度（1）BCA数据记录表Protein probeBCA wert1BCA wert2averageBSA（mg/ml）0.250.4960.4900.493 0.50.7770.7790.778 1.01.1811.2391.210 2.02.1232.0972.110Sample 0h1.1631.1411.152 1h1.2591.2731.2
28、66 4h1.7701.7341.752 6h1.0230.8250.924 12h1.5091.5571.533 24h1.2431.1971.220(2)标准曲线（3）样品蛋白浓度（OD值代入y=0.911x+0.293）样品蛋白浓度(g/l)上样量(l)0h0.9410.631h1.079.354h1.606.256h0.6914.1912h1.367.3524h1.029.804.1.4重复实验比较分析三种定蛋白的方法所用到的牛血清蛋白和样品蛋白是在同一条件下保存的同一试管中取得的，因此其蛋白浓度理论上应该是相等的，但是从三种方法的结果来看，不同方法所得的结果有一定的差距。首先，配置的
29、标准浓度的牛血清蛋白液做标准曲线时，Esen method和BCA法测得的牛血清蛋白相同浓度的OD值接近，而Bradford法把牛血清蛋白稀释了20倍左右后所得OD值与另外两种方法相差很大，说明稀释过程中操作不当引起了浓度的误差。相对于BCA法而言，Esen method和Bradford法所得样品的OD值比较接近，且各个处理的浓度变化差异也相差不大。重复实验所得数据表明Esen method的重复性好，两次实验得出的蛋白浓度比较接近，而另两种方法两次实验的结果差异较大，说明Esen method在定植物蛋白浓度时比BCA法和Bradford法精确。本实验主要采用的就是Esen method定
30、蛋白浓度，用BCA法和Bradford法可以更好地验证Esen method的精确性，同时也可大致确定所提取的橡胶叶片蛋白的浓度。4.2SDS-PAGE分离结果和转膜后验证通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳所得的凝胶染色脱色后与双色预染宽分子量蛋白Marker的说明书中的条带大小进行比对得出橡胶叶片总蛋白的大小介于40kD-55kD之间。从显色的明暗程度来说，0h、1h、6h、12h的比较明显，而4h的比较暗，而且24h的观察不到蛋白的存在。4.3免疫印迹的显色结果 观察显色后的PVDF膜，可以看到在5.讨论 1EP阿姆利,王科.巴西橡胶的过去和将来J.云南热作科技,1980,04:60-
31、68.2蒋菊生,王如松.中国热带北缘橡胶种植生态工程A.中国科协2004年学术年会海南论文集C.:,2004:5.3黄炎,郭庆水,徐立新,陈守才.巴西橡胶树的分子生物学研究进展J.安徽农业科学,2008,02:442-445+456.4祁栋灵,王秀全,张志扬,黄月球.中国天然橡胶产业现状及其发展建议J.热带农业科学,2013,02:79-87.5潘延云,郭毅,赵军峰,孙大业.乙烯在植物中的信号转导J.浙江大学学报(农业与生命科学版),2003,04:101-108.6Reid, M. S. and pratt, H. K. Effects of ethylene on potato tuber
32、 respiration. Plant Physiol. 1972, 49: 252-2557范思伟,杨少琼.巴西橡胶的乙烯生理学J.热带作物研究,1991,03:69-77.8杨少琼,黎仕剑.机械创伤和巴西橡胶树的应激乙烯生成及其对排胶量的影响J.热带作物研究,1982,04:11-13.9Chao Q, Rothenberg M, Solano R, et al. Activation of the ethylene gas response pathway in Arabidopsis by the nuclear protein ETHYLENE-INSENSITIVE3 and re
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34、n of PqqC/ D which produces pyrroloquinoline quinine J .Biochem Biophys Res Commun , 2007 , 354(1):290-295 .2Springer A L , Ramamoorthi R, Lidstrom Marye E .Characterization andnucleotide sequence of pqqE and pqqF in Methylobacterium extorquensAM1 J .J Bacteriol , 1996 ,178(7):2154-2157.。致 谢本论文是在翟金玲
35、副教授的悉心指导下完成的。从论文选题、试验设计到论文的撰写等过程，翟老师都付出了大量的时间和精力。长期以来，翟老师不仅在实验过程中帮助我，在我有疑惑时给予细心的指导，让我学会了很多实验的方法和技术，还在学习和生活上给予我关怀和鼓励。翟老师以认真、负责、严谨的教学态度让我受益匪浅。在此向翟金玲副教授致以衷心的感谢和崇高的敬意。此外，我要特别感谢黄惜教授和生物技术研究所的各位老师长期以来对实验相关环节的耐心指导和热心帮助。另外，还要感谢王启超师兄、范玉龙师兄等师兄师姐在我实验出现困难时的帮助和对此实验的支持。最后，我要感谢大学里所有教导我的每一位老师和关心过我的每一位同学同学，感谢在背后默默支持我的家人，感谢你们在我学习和成长过程中给予的巨大帮助和鼓舞。