毕业设计（论文）-樟树籽蛋白质的提取与分析.doc

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1、武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 1 武夷学院武夷学院 毕业设计毕业设计( (论文论文) ) 樟树籽蛋白质的提取与分析 院院 系系 ：武夷学院 专专业业（班班级级）：生物技术及应用 姓姓名名 ： 学学号号 : : 指指导导教教师师： 职职称称： 讲师 完完成成日日期期：2011 年 6 月 3 日 武夷学院教务处制武夷学院教务处制 樟树籽蛋白质的提取和分析 樟树籽蛋白质的提取与分析樟树籽蛋白质的提取与分析 摘要：摘要：植物蛋白的提取方法有等电点法 、离子交换法 及超滤法、乙醇沉淀蛋 白法等 本实验采用了乙醇沉淀蛋白,其优点是避免蛋白质变性 ,尽可能 减少杂质。本实验采用磷酸盐缓冲

2、液溶解蛋白质再用乙醇为脱水剂破坏 蛋白质胶体质点的水化层，使其沉淀析出进而对樟树籽蛋白进行提取,并 用紫外光吸收法测定蛋白质的浓度,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白 质的相对分子质量，对樟树籽蛋白进行分析 关键词：关键词：樟树籽，蛋白质，提取，分析 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 3 目录目录 1 前言1 1.1 樟树籽简介1 1.2 油类作物蛋白提取方法 1 1.2.1 水相萃取法2 1.2.2 有机相萃取法2 1.2.3 水相酶解法2 1.3 蛋白质分析检测方法3 1.3.1 Folin-酚试剂法(Lowry 法)3 1.3.2 紫外吸收法3 2 材料和方法3 2.1

3、材料 3 2.1.1 实验材料3 2.1.2 试剂3 2.2 器材4 2.3 实验方法4 2.3.1 提取方法4 2.3.2 蛋白质分离方法5 2.3.3 蛋白质的定性5 2.3.4 蛋白质的等电点6 2.3.5 紫外光吸收法测定蛋白质浓度6 2.3.6 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的分子量测定7 3 结果与讨论9 3.1 前处理9 3.2 蛋白质的提取9 3.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法10 4 结论11 参考文献11 致谢13 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 1 1 1 前言前言 1.11.1 樟树籽简介樟树籽简介 樟树属樟科( Lauraceae)植物 ,是一种

4、生长在亚热带地区四季常青的树种 ,在 我国长江以南地区及台湾省有大量种植。樟树籽 ,又名樟犁、香樟子、大木姜 子、樟子等，其氨基酸含量丰富 ,品质优良 ,但是、目前 ,樟树籽除极少量被 采摘入药外 ,大部分均自生自灭 ,没有被很好地利用.由于食物资源供需矛盾的 日益突出 ,开发利用新的蛋白质资源已成当务之急 ,尤其是植物性蛋白质源的 开发利用已成为世界各国解决食物资源匮乏的重要突破口.大豆蛋白、 花生蛋 白的应用已日趋普遍 ,但对樟树籽蛋白的利用还没有引起足够的重视， 樟树( Cinnamomum Camphora)是樟科属的常绿乔木植物 ,高 2030 m。主 要生长在热带和亚热带地区 ,全

5、世界有 45 个属约 2 500 余种 ,在我国有约 20 个属近 430 种 ,其中我国特有的有 355 余种 ,樟树是我国特产珍贵木材和经 济林树种 ,被誉为江南宝树。樟树 34 月开花 ,花小呈绿色或淡黄色 ,长大 约 2 mm ,花被 6 裂 ,椭圆形。花期能散发出淡淡的清香 ,这段时期大约一周 至半月左右。每年 1012 月樟树籽基本成熟 ,但这时的樟树籽很少自行脱落 ,其 果皮依然是与叶面相同的绿色。再往后果皮的颜色逐渐加深 ,到第二年 12 月樟树籽果皮已由绿色逐渐变成棕黑色或黑色。樟树是樟科属的常绿乔木植物 中经济价值最大的树种之一 ,是天然樟脑、芳香油、油脂、优质木材、医药等

6、 类的重要资源 ,其木材、根、叶、果实皆含精油 ,以往主要是对根、茎、叶进 行利用与加工 ,近年来对樟树籽的利用研究增多 ,发现其核仁含脂肪油 ,含油 率高达 40 %以上。油脂中脂肪酸组成以 C10、 C12 脂肪酸为主 ,占 90 %左右。 樟树籽 ,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟树籽呈扁球形 ,直 径大约 59mm ,每千粒重大约是 200 g,果皮肉质薄 ,能散发出芬芳的清香。 我国很早就将樟树籽作为药物用于治病 ,并认为樟树籽有驱风散寒、行气止痛 之功效。癸酸(C10)已应用于医药行业合成鱼腥草素等消炎药 ,主要含有癸酸 (C10)的樟树籽脂肪油已被试制成碳酸甘油脂 ,用于

7、治疗脂肪代谢紊乱病症 ,并 能降血脂及胆固醇。 1.21.2 油类作物蛋白提取方法油类作物蛋白提取方法 油类作物蛋白营养价值和功能特性已被广泛接受，但国内外仍没有工业化 产品。由于油类中抗营养因子的存在，过去很长一段时间内，油脂工业只注重 樟树籽蛋白质的提取和分析 2 油类作物榨油，忽略了油类作物蛋白的利用，造成植物蛋白资源的浪费。当今 世界蛋白资源供求日趋紧张，所以，各国学者们开始转向油类作物蛋白的研究。 目前，从油类作物中提取蛋白质的方法主要有以下几种。 1.2.11.2.1 水相萃取法水相萃取法 水相萃取法是采用不同水相将菜籽蛋白提取，再分离(常用等电点法)，得 到菜籽分离蛋白或者是通过

8、水相将菜籽饼粕中硫苷、植酸、可溶性糖等非蛋白 组分溶出，获得菜籽浓缩蛋白的方法。常用的水相有：水、稀酸、稀碱、NaCl 溶液、六偏磷酸钠溶液等。刘大川等人(2005 年)以脱皮脱脂双低菜籽粕为原料， 在 pH 值 11，同液比 1：12，浸提温度 50下，用 NaOH 溶液浸提 4 次，每次 35 min，得到产品的蛋白含量 8612，蛋白得率 2435。金晶等人(2009 年) 选用双低菜籽粕为原料，采用超声微波辅助水相法，在超声频率 40 kHz，功率 50 w，微波功率 73 w，料液比 1：28，时间 8 min 下，提取 3 次，获得蛋白含 量为 8365的产品，蛋白得率 3876。

9、水相萃取法工艺简单、成本低，但 蛋白得率不高，易污染环境。蛋白得率偏低的主要原冈是菜籽蛋白组成复杂， 相对分子量差异大，使得菜籽蛋白溶解曲线不能形成“U”型，而出现 2 个或多 个等电点区域。 1.2.21.2.2 有机相萃取法有机相萃取法 采用醇、酮等有机溶剂提取菜籽饼粕中植酸、多酚、残油、色素等组分， 制取菜籽浓缩蛋白的方法。曾晓波等人(2001 年)以双低脱壳菜籽饼粕为原料， 采用丙酮浸提法，在丙酮体积分数为 78。85，NaCI 质量分数为 7，pH 值 为 4.0 下提取，所得浓缩蛋白的蛋白质质量分数为 70，产品色浅味淡，功能 性质较好，可用作食品添加剂。金青哲等人(2006 年)

10、I 以双低菜籽为材料， 采用超声波辅助乙醇浸提法，在超声频率 20 kHz，功率 100 kW，乙醇体积分数 为 70，液同比 35：1 的条件下，提取 3 次，每次 20 min，所得浓缩蛋白蛋 白质量分数大于 60，氨基酸平衡，硫苷、植酸、单宁等抗营养因子含量低。 有机相萃取法具有产品色泽好，脱毒率高等优点，但工艺复杂，成本高，易引 起蛋白变性，影响蛋白营养效价。 1.2.31.2.3 水相酶解法水相酶解法 水相酶解法是在水相萃取法基础上，增加了酶水解过程，以提高菜籽蛋白 收率和品质的方法。常用的酶有：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和木 瓜蛋白酶、风味蛋白酶、果胶酶、纤维素酶和半纤维素

11、酶等。刘志强等人(2004 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 3 年)旧以双低油菜籽为原料，采用水相酶解法，并用纤维素酶和果胶酶复合酶 (质量比为 3：1)作为酶制剂，在固液比 l：5，酶用量 30 U/g 下，酶解 100 min，再经超滤分离菜籽蛋白，经干燥所得产品蛋白得率达 823。产品安全 性能良好，异硫氰酸酯和嘿唑硫烷酮均未检出。张霜玉等人(2009 年)以“中双 7 号”脱皮油菜籽为材料，采用水相酶解法，在料液比为 l：5，加酶量为 2，pH 值 38，50下酶解 4 h，所得水解蛋白产品的得率为 8250。水 相酶解法有利于蛋白溶出，提高了蛋白得率，改善了蛋白功能特

12、性，减轻饼粕 中抗营养冈子对人体及动物的毒害作用，同时具有降低残油率，增加蛋白产品 保藏性能等优点，但该法存在蛋白水解后产生苦味的问题。 1.31.3 蛋白质分析检测方法蛋白质分析检测方法 1.3.11.3.1 Folin-Folin-酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry 法法) ) 蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与 Folin-酚试剂起氧化还原反应。 反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试 剂中的 Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二步：蛋白质-Cu2+复合物中所含的 酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。该 呈色反应

13、在 30 分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋 白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根 据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100g） 在 500nm 波长处进行测定，含量低时(5-25g)在 755nm 波长处进行测定。最后 根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。 Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于 5g 即可测 得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。 1.3.21.3.2 紫外吸收法紫外吸收法 大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使 蛋白质在 2

14、80nm 的紫外光区产生最大吸收，并且这一波长范围内的吸收值与蛋 白质浓度的成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。 紫外吸收法可测定 0.1-0.5mg/ml 的蛋白质溶液，此操作简便，测定迅速， 不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，此法在蛋白质的制备中广泛应用。 2 2 材料和方法材料和方法 2.12.1 材料材料 樟树籽蛋白质的提取和分析 4 2.1.12.1.1 实验材料实验材料 樟树籽干燥 70 摄氏度 24 小时，备用。 2.1.22.1.2 试剂试剂 石油醚（C.P.，沸程 3060） ，磷酸氢二钠（分析纯 AR） ，磷酸二氢钠 （分析纯 AR） ， 氯化钠（分析纯 AR

15、） ，95%乙醇（分析纯 AR） ，Tris （分析纯 AR） ，浓盐酸（分析纯 AR） ，SDS（分析纯 AR） ，甘油（分析纯 AR） ，溴酚蓝 （分析纯 AR） ，-丙烯酰胺（分析纯 AR） ，巯基乙醇（分析纯 AR） ，甲醇（分析 纯 AR） ，考马斯亮蓝 R-250（分析纯 AR） ，冰醋酸（分析纯 AR） 2.22.2 器材器材 FZ102 型植物粉碎机，索氏提取器，离心机，紫外分光光度计，垂直电泳槽， 电泳仪，微型凝胶电泳装置（宁波宏耀电泳科技有限公司）；水浴锅； Eppendorf 管；微量注射器（50l 或 100l）。 2.32.3 实验方法实验方法 2.3.12.3.1

16、提取方法提取方法 1) 将样品在 80100电热鼓风干燥箱内烘去水分，一般烘 4h，烘干时 要避免过热。样品颗粒不宜太大，一般要在研钵中研碎样品。 2) 准备工作：将恒温水浴锅的水温事先加热（80） 。务必保证提取管和 烧瓶内干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内 120烘干。 3) 折滤纸斗：取一张 11cm 的滤纸，折成筒状，再将其一端折起来封死， 便做成了滤纸斗。 4) 称样：先将数粒樟树籽在碾钵中用碾锤彻底捣碎作为实验样品。参照实 验设备和器材，将滤纸斗在电子天平上称重，然后用药勺取 10g 样品 装入滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死；防止样品泄出滤纸斗。 调整滤纸斗的高度，使其

17、放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处。将 装好样品的滤纸斗放在电子天平上称重，两质量之差即为样品的质量。 5) 提取：首先安装好烧瓶，并调整其高度，使其刚好能浸入水浴锅中的水 中。将装置 6) 从水浴锅的水中取出，继续安装提取管，把装有样品的滤纸斗放入提取 管内，向提取管中缓缓倒入石油醚直至液面达到虹吸管上弯头部，正好 虹吸一次；再向提取管中倒入石油醚，使其液面达到第一次液面的一半。 用乳胶管将冷凝管与自来水管相连，将冷凝管安装到提取管上，检查一 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 5 下，确保所有接口均对接完好（不漏气，不打滑） 。轻轻打开自来水 （冷凝用） ，将索氏提取仪整个装

18、置放入恒温水浴锅中加热提取（水温 80左右） ，请观看软件中的视频索氏提取仪的安装 。提取时间 22h，约虹吸 10 次以上，记录每次虹吸所需的时间和虹吸次数。附注： 若要将样品的粗脂提取完全，提取时间至少为 12h 以上。由于实验时间 的限制，我们的提取率只能达到 80左右。 7) 回收石油醚：提取 2h 后，当石油醚在提取管中的液面即将达到虹吸管 的上弯头处时，从水浴锅中取出索氏提取仪装置，室温冷却 510min； 取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中 的石油醚会虹吸而流入回收瓶中，达到回收的目的。再装上平底烧瓶， 继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴

19、下，表明平底烧 瓶中的石油醚已经蒸干。注意：必须蒸干后才能放入干燥箱烘干，否则 会引起火灾。取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚 8) 称量粗脂质量：将平底烧瓶放入 120的电热鼓风干燥箱中烘 15min， 取出冷却后称重（须戴手套，以免烫伤） 。再将平底烧瓶用洗涤剂洗净， 于 120的电热鼓风干燥箱中烘干（约 15min） ，取出冷却后称重，两者 的质量之差就是粗脂的质量。 9) 计算 样品粗脂的含量（%）=（粗脂的质量/样品的质量）*100% 10) 将上述去脂烘干的样品置于烧杯中，加入 ph 为 7.2 的磷酸盐缓冲夜 100ml 浸提 2h 2.3.22.3.2 蛋白质分离方法蛋白质分离

20、方法 将浸提液均匀倒入两个离心管使两管质量相同，对称放入离心机中，调整 离心机 4000 转 5 分钟，将上清液倾入烧杯，加晶体 NaCl 少许（加速沉淀并使 沉淀完全） ，待溶解后再加入 95%的乙醇 100ml 混匀。观察有无沉淀析出 将所得溶液离心，获得沉淀，用 1% NaCl 溶液溶解定容于 250ml 容量瓶中， 备用。 2.3.32.3.3 蛋白质的定性蛋白质的定性 蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋 白质的所含氨基酸不完全相同，颜色反应也不同。颜色反应时一些常用的蛋白 质定量测定的依据 2.3.3.1 黄色反应 樟树籽蛋白质的提取和分析 6 蛋白质分

21、子中含有苯环结构的氨基酸（酪氨酸、色氨酸） 。遇到硝酸可硝化 成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝基衍生物。取一试管，置所 提取的蛋白质溶液 10 滴及浓硝酸 34 滴，加热，冷却后再 10%NaOH 溶液 5 滴， 观察颜色变化, 2.3.3.2 茚三酮反应 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH3 和醛，水合茚 三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚 三酮分于和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜 pH 为 57，同一浓度的蛋白 质或氨基酸在不同 pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。操作方 法： (1)取 1 支试管加入蛋

22、白质溶液 1 毫升，再加 0.5 毫升 0.1茚三酮水溶液， 混匀，在沸水浴中加热 12 分钟，观察颜色 (2)在一小块滤纸上滴一滴 0.5的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一 滴 0.1的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察 2.3.42.3.4 蛋白质的等电点蛋白质的等电点 在等电点时，其溶解度最小。可调节蛋白溶液的 pH 值使其达到蛋白质的等 电点，获得蛋白沉淀。 实验步骤： 取同样规格的试营 4 支,向以上试管中各加样品蛋白的醋酸钠 溶液 1 毫升,加一管,摇句一管.此时 1,2,3,4 管的 pH 值依次为 1,3,5,7 观察其 混浊度.静置 10 分钟后,再观察其混浊度.最混浊的

23、一管的 pH 即为样品蛋白的等 电点. 2.3.52.3.5 紫外光吸收法测定蛋白质浓度紫外光吸收法测定蛋白质浓度 蛋白质组成中长含有酪蛋白和色氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光 280nm 波 长处有最大吸收峰，一定浓度范围内其浓度与吸光度成正比，故可用紫外分光 光度计通过比色来测定蛋白质的含量。 由于核酸在 280nm 波长处也有光吸收，对蛋白质测定有一定的干扰作用， 但核酸的最大吸收峰在 260nm 处。如同时测定 260nm 的光吸收，通过计算可以 消除其对蛋白质测定的影响。因此如溶中存在核酸时必须同时测定 280nm 及 260nm 的吸光度，方可通过计算测得溶液中的蛋白质浓度。 操作步骤

24、 在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 7 理盐水为对照，测得 280nm 和 260nm 两种波长的吸光度（A280nm 及 A260nm）。 将 A280nm 及 A260nm 波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。 C = 1.45A280nm 0.74A260nm 式中C：蛋白质质量浓度（mg/ml）； A280nm：蛋白质溶液在 280nm 处测得的吸光度； A260nm：蛋白质溶液在 260nm 处测得的吸光 本法对微量蛋白质的测定既快又方便，它还适用于硫酸铵或其他盐类混杂 的情况，这时用其他方法测定

25、往往较困难。 为方便起见对于混合蛋白质溶液，可用A280nm 乘以 0.75 来代表其中蛋白 质的大致含量（mg/ml）。 2.3.62.3.6 SDSSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白质的分子量测定蛋白质的分子量测定 2.3.6.1.实验试剂配制 2mol/L Tris-HCl (pH8.8):取 24.2g Tris, 加 50ml 蒸馏水，缓慢的加 浓盐酸至 pH8.8（约加 4ml） ；让溶液冷却至室温，pH 将会升高，加蒸馏水至 100ml。 1mol/L Tris-HCl (pH8.8):取 12.1g Tris, 加 50ml 蒸馏水，缓慢的加 浓盐酸至 pH6

26、.8（约加 8ml） ；让溶液冷却至室温，pH 将会升高，加蒸馏水至 100ml。 10% (w/v) SDS: 取 10g 的 SDS，加蒸馏水至 100ml。 50% (v/v) 甘油: 取 50ml 100%甘油，加入 50ml 蒸馏水。 1% (w/v) 溴酚蓝:取 100mg 溴酚蓝，加蒸馏水至 10ml，搅拌,直到完全 溶解，过滤除去聚合的染料。 A 液-丙烯酰胺储备液（配制含 30% (w/v) 丙烯酰胺和 0.8% (w/v) 甲 叉双丙烯酰胺的溶液 100ml）在通风柜中操作，取 29.2g 丙烯酰胺，0.8g 甲叉 双丙烯酰胺，加蒸馏水至 100ml，缓慢搅拌直至丙烯酰胺粉

27、末完全溶解，用石 蜡膜封口，可在 4存放数月。 B 液-4分离胶缓冲液：取 75ml 2mol/L Tris-HCl (pH8.8)，加入 4ml 10% SDS, 加 21ml 蒸馏水，混匀，可在 4存放数月。 C 液-4浓缩胶缓冲液:取 50ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入 4ml 10% SDS, 加 46ml 蒸馏水，混匀，可在 4存放数月。 10%过硫酸铵：取 0.5g 过硫酸铵，加入 5ml 蒸馏水，可保存在密封的管 内，于 4存放数月。 电泳缓冲液：取 3g Tris，14.4g 甘氨酸，1g SDS，加蒸馏水至 1L, pH 樟树籽蛋白质的提取和分析

28、8 约为 8.3, 也可配制成 10的储备液，在室温下长期保存。 5样品缓冲液：取 0.6ml 1mol/L Tris-HCl (pH6.8)，加入 2ml 10% SDS, 5ml 50%的甘油，0.5ml 2-巯基乙醇，1ml 1%溴酚蓝，0.9ml 的蒸馏水混 匀，可在 4保存数周，或在-20保存数月。 考马斯亮蓝染液：1.0g 考马斯亮蓝 R-250，加入 450ml 甲醇，450ml 蒸 馏水及 100ml 冰醋酸即成。 考马斯亮蓝脱色液：将 100ml 甲醇，100ml 冰醋酸，800ml 蒸馏水混匀 备用。 2.3.6.2.灌制分离胶 组装凝胶模具: 可按照使用说明书装配好灌胶用

29、的模具。对于 Bio-Rad 的微型凝胶电泳系统，在上紧螺丝之前，必须确保凝胶玻璃板和隔片的底部与 一个平滑的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。 将 A 液、B 液及蒸馏水在一个小烧瓶或试管中混合，丙烯酰胺(A 液中) 是神经毒素，操作时必须戴手套。加入过硫酸铵和 TEMED 后，轻轻搅拌使其混 匀(过量气泡的产生会干扰聚合)。凝胶很快会聚合，操作要迅速。小心将凝胶 溶液用吸管沿隔片缓慢加入模具内，这样可以避免在凝胶内产生气泡。 当加入适量的分离胶溶液时(对于小凝胶，凝胶液加至约距前玻璃板顶 端 1.5cm 或距梳子齿约 0.5cm)，轻轻在分离胶溶液上覆盖一层 1mm5mm 的

30、水 层，这使凝胶表面变得平整。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间将会出现一 个清晰的界面。 2.3.6.3.灌制浓缩胶 吸尽覆盖在分离胶上的水后将 A 液、C 液和蒸馏水在三角烧瓶或小试管 中混合。加入过硫酸铵和 TEMED，并轻轻搅拌使其混匀。 将浓缩胶溶液用吸管加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的 顶端。将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确 保梳子齿的末端没有气泡。将梳子稍微倾斜插入可以减少气泡的产生。 凝胶聚合后，小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。将电泳缓冲液加入内 外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。 2.3.6.4.制备样品和上样 将蛋白质样品

31、与 5x 样品缓冲液(20l+5l)在一个 Eppendorf 管中混 合。100加热 2 min10min。离心 1s，如果有大量蛋白质碎片则应延长离心 时间。 用微量注射器将样品加入样品孔中。将蛋白质样品加至样品孔的底部， 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 9 并随着染料水平的升高而升高注射器针头。避免带入气泡，气泡易使样品混入 到相邻的加样孔中。 2.3.6.5.电泳 将电极插头与适当的电极相接。电流流向阳极。将电压调至 200V（保持 恒压；对于两块 0.75mm 的胶来说，电流开始时为 100mA，在电泳结束时应为 60mA；对于两块 1.5mm 的胶来说，开始时应为

32、110mA，结束时应为 80mA。 ） 。 对于两块 0.75mm 的凝胶，染料的前沿迁移至凝胶的底部约需 3040 分 钟(1.5mm 的凝胶则需 40 min50min)。关闭电源,从电极上拔掉电极插头,取出 凝胶玻璃板,小心移动两玻璃板之间的隔片，将其插入两块玻璃板的一角。轻轻 撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上。 2.3.6.6.考马斯亮蓝染色 这种染色方法在单条电泳带中蛋白质最小检出量为 0.1g 的蛋白。通常可 以根据所需要的敏感度来选择是使用考马斯亮蓝染色或银染色。 戴上手套避免将手指印留在电泳凝胶上，将凝胶移入一个小的盛有少量 考马斯亮蓝(20ml 已经足够)的容器内(小心

33、不要将胶撕破)。或将玻璃板连同凝 胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落。 对于 0.75mm 的凝胶，可在摇床上缓慢震荡 5 分钟l0 分钟，对于 1.5mm 的凝胶，则需 10 分钟20 分钟，在染色和脱色过程中要用盖子或封口膜密闭 容器口。弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次。戴手套以避免将双手染色。 加入考马斯亮蓝脱色液(约 50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分 凝胶脱色需要 1h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更 换脱色液并震荡过夜。 根据凝胶中标准品与待测样品的相对迁移率判断待测样品的大致分子量。 3 3 结果与讨论结果与讨论 3.13.1 前处理前处理 粉碎后用烘

34、箱对樟树籽进行干燥时，粉末热时湿度较大冷时结冻成固态， 可以体现樟树籽中油脂含量较高，称量樟树籽 10.002g 索氏抽提得到蛋白和 淀粉的混合物重 7.623g，计算油脂的含量粗脂的含量（%） =2.377/10.002*100%=23.765% 3.23.2 蛋白质的提取蛋白质的提取 樟树籽蛋白质的提取和分析 10 植物蛋白的提取方法有等电点法 、离子交换法 及超滤法、乙醇沉淀蛋白法 等 本实验采用了乙醇沉淀蛋白,其优点是避免蛋白质变性 ,尽可能减少杂质。 本实验采用磷酸盐缓冲液溶解蛋白质再用乙醇为脱水剂破坏蛋白质胶体质点的 水化层，使其沉淀析出进而对樟树籽蛋白进行提取，提取效果好，提取率

35、 蛋白质的颜色反应是检验蛋白质方法简单方便，提取的物质在黄色反应中呈黄， 茚三酮反应呈紫红色，充分证明所提取的物质为蛋白质。 根据蛋白质等电点的测定最终测定蛋白质的在 PH 为 1 时沉淀最为明显,所 以提取的该蛋白质的等电点为 1 蛋白质浓度测定方法有双缩尿法、福林酚试剂测定法、考马斯亮蓝结合 法、紫外光吸收法测定蛋白质浓度本法采用紫外光吸收法测定蛋白质浓度方法 简单方便测得蛋白质的浓度： 计算结果: C = 1.45A280nm 0.74A260nm=3.177mgml 3.33.3 SDSSDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 经过电泳操作得到出产品的图谱，分离胶的浓度为 7.

36、5%，浓缩胶的浓度为 5%。 图 1 电泳图谱（7.5%分离胶，5%浓缩胶） 从图中可以看出，当分离胶的浓度采用 7.5%时，分离效果比较差，而且泳 道中蛋白样品有拖尾现象，因此调整分离胶的浓度。 样品 2样品 1 武夷学院 2008 级生物技术应用专业毕业论文 11 图 2 电泳图谱（10%分离胶，5%浓缩胶） 从图 2 可看出，样品 1 和样品 2 中蛋白质组分得到较好的分离，出现比较 明显的条带，中间所加标准品的量太少，没有显示出条带。从这次的实验结果 可知，樟树籽中蛋白质的分子量大约在 30200 kdal 之间。 4 4 结论结论 通过实验可以得到以下结论： 1) 通过对樟树籽脱脂，

37、然后采用稀盐溶液所得产品通过茚三酮反应证明是 蛋白质，采用醇溶法提取的产品也用该方法证明是蛋白质。提取的蛋白 质浓度分别为：1 3 5 7 9 11 13 ，等电点为 1。 2) 经过初步的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，结果表明提取所得蛋白质的 相对分子质量大约在 30200kdal 范围内。 参考文献参考文献 1 李建武.生物化学试验原理和方法M .北京:北京大学出版社,1994. 2 李刚.生物化学，北京： 科学技术文献出版社，2010. 3 陈钧辉. 生物化学实验（第三版）.科学出版社，2002. 4 李娜，杨涛我国油菜籽产业发展现状及趋势展望J农业展攀，2009(2)：19- 21

38、 5 韩喜秋我国油菜生产现状、问题及对策J现代农业，2003(12)：34-35 6 章绍兵，王璋水酶法从菜籽中提取油及水解蛋白的研究Jl农业工程学报， 2007，23(9)：213-218 7 陈刚，彭建菜籽饼粕抗营养因子研究进展J畜禽 lZ 业，2001(1)：14-16 8 杨国燕，陈栋梁菜籽分离蛋白及菜籽蛋白肽的功能特性研究J食品科学， 2007，28(1)：76-78 9 何忠效.电泳M.143-155,科学出版社,1990 年 10 Galati EM, Monforte MT, Kirjavainen S, Forestieri AM, Trovato A, Tripodo MM (November 1994). “Biological effects of hesperidin, a citrus flavonoid. (Note I): antiinflammatory and analgesic activity“. Farmaco 40 (11): 70912. 11 Loscalzo LM