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1、硕士猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析2009硕士学位论 文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析二九 年 六 月 硕士学位论文猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析学科专业 预防兽医学 指导教师 教授 副研究员 论文答辩日期 学位授予日期 答辩委员会主席 论文评阅人 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明学位论文原创性声明本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮助的个人和集
2、体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名： 年 月 日学位论文使用授权说明本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即：本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容；按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。请选择发布时间：即时发布 解密后发布（保密论文需注明，并在解密后遵守此规定）论文作者签名： 年 月 日导师签名： 年 月 日猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析中文摘
3、要脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus, EMCV）属于微RNA病毒科（Picornaviridae）、心病毒属（Cardiovirus）的成员，可引起猪的以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。针对猪EMCV VP3/VP1基因序列设计并合成一对特异性引物，以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品，建立了检测EMCV核酸的SYBR Green I real-time PCR方法。该方法线性关系好，标准曲线的相关系数达到0.991；敏感性高，初始模板的检出下限为1101拷贝/L，比常规PCR方法高100倍；特异性强，与其它猪源病毒均不发生交
4、叉反应；重复性好，组内与组间的变异系数均小于3%。应用所建立的方法对临床29份可疑病料进行检测，结果1份为阳性。将该份疑似病料上BHK-21细胞，并对其进行特性鉴定，确诊为EMCV，命名为EMCV-GXLC，设计5对引物，采用RT-PCR技术扩增EMCV分离株基因组完整开放阅读框（ORF）序列，应用3-RACE和5-RACE技术扩增分离株的3-UTR和5-UTR，分别进行扩增片段的克隆和测序。结果表明，EMCV-GXLC株基因组全长7 725 nt，编码区为6 879 nt，编码2 292个aa，将该株全基因组上传NCBI，GenBank登录号：FJ897755。应用分子生物学软件对EMCV-
5、GXLC全基因组核苷酸及推导氨基酸序列进行了序列比对和同源性分析。全基因组比对结果表明，分离株与来源于广西的FJ604852、FJ604853，北京的DQ464062，河北的DQ464063，韩国的DQ517424、EU780148、EU780149等猪源EMCV分离株的同源性较高，达99.5%以上。各个片段推导的氨基酸同源性分析显示，非结构蛋白比结构蛋白保守；在非结构蛋白中，3D蛋白最为保守，2A相对变异较大，预示EMCV的诊断引物可以基于3D基因；在结构蛋白中，VP2蛋白相对保守，VP1蛋白同源性最低、变异性较大，适合用于分子流行病学的调查。VP1蛋白有两个潜在的N-糖基化基序，分别为N2
6、9QT和N62QT，VP1是表位最多的区域，预测有9个可能的表位；VP2和VP3共有6个潜在的N-糖基化位点。3-UTR和5-UTR二级结构分析显示，FJ897755与来源于韩国的DQ517424相似度最高。进化树分析显示，结构蛋白与全基因序列的系统发育进化树相近，且不同结构蛋白基因序列之间的系统发育进化树结构也类似，在分析EMCV分离株的进化关系时，可以使用VP3/VP1基因来绘制系统发育进化树。关键词：猪脑心肌炎病毒；荧光定量PCR；分离；测序；全基因组；进化分析ISOLATION AND GENOMIC SEQUENCE ANALYSIS OF PORCINE ENCEPHALOMYOC
7、ARDITIS VIRUS GUANGXI STRAIN英文摘要Encephalomyocarditis virus (EMCV) is a member of the genus Cardiovirus of the family Picornaviridae, it is clinically characterized by encephalitis, myocarditis or inflammation around cardiac muscles.A pair of primers was designed according to the sequence of the VP1
8、gene of EMCV and a real-time PCR assay based on SYBR Green I for detection of EMCV was established. The assay had a good linear relationship between initial templates and Ct values, and the correlation coefficient of the standard curve was 0.991. Also, it was highly sensitive and had a detection lim
9、it of 1101 copies/L of initial templates, which was 100 times more sensitive than the conventional PCR. Moreover, it was highly specific and had no cross-reaction with other porcine viruses. Finally, it was highly reproducible and had a coefficient of variations less than 3 percent for both intra- a
10、nd inter-assay. One EMCV strain was isolated from the clinical tissue samples orignated from pig farms in Guangxi by using BHK-21 cells. This isolate was designated EMCV-GXLC（GenBank accession No. FJ897755），and identified using IFA. The virus particles with diameter of 27 nm were observed by immune
11、electron microscopy (IEM). Five pairs of primers were designed and five overlapping cDNA fragments covering the complete open reading frame (ORF) within BJC3 and HB1 were amplified using RT-PCR. The 5-rapid amplification of cDNA ends (RACE) and 3-RACE were employed to amplify the 5-untranslated regi
12、on (UTR) and 3-UTR of the RNA of the viruses. The sequences of RT-PCR-generated cDNA fragments from EMCV-GXLC viruses were assembled. The complete genomes of EMCV-GXLC consisted of 7 725 nucleotides, and possessed a large ORF with a size of 2 292 amino acids. The homology of the genomic nucleotide s
13、equences and the predicted amino acids were aligned and analyzed among EMCV-GXLC and other EMCV strains available in GenBank. The results showed thatKEY WORDS: encephalomyocarditis virus (EMCV)；real-time PCR；isolation； sequence；genome；phylogenetic analysis目录中文摘要I英文摘要II目录III插图和附表VI插图清单VI附表清单VII缩略词表VI
14、II1.文献综述11.1EMCV基因组结构11.1.1EMCV衣壳蛋白及其功能21.1.2EMCV非结构蛋白P2和P331.1.3EMCV 5-UTR结构与功能31.1.4EMCV 3-UTR51.2EMCV诊断技术51.2.1病毒分离51.2.2抗体检测方法51.2.3抗原检测方法61.3EMCV的流行情况及流行特点61.3.1流行情况61.3.2流行特点71.4EMCV的公共卫生学意义81.5研究内容与技术路线91.5.1研究内容91.5.2技术路线102.猪脑心肌炎病毒SYBR Green I real-time PCR检测方法的建立错误！未定义书签。2.1材料与方法错误！未定义书签。2
15、.1.1病毒与引物错误！未定义书签。2.1.2主要试剂错误！未定义书签。2.1.3试验用溶液配制错误！未定义书签。2.1.4主要仪器设备错误！未定义书签。2.2方法错误！未定义书签。2.2.1质粒标准品的制备错误！未定义书签。2.2.2Real-time PCR反应条件的优化错误！未定义书签。2.2.3Real-time PCR标准曲线的制作错误！未定义书签。2.2.4Real-time PCR的敏感性试验错误！未定义书签。2.2.5Real-time PCR的特异性试验错误！未定义书签。2.2.6Real-time PCR的重复性试验错误！未定义书签。2.2.7Real-time PCR的初
16、步应用错误！未定义书签。2.3结果与分析错误！未定义书签。2.3.1质粒标准品的制备错误！未定义书签。2.3.2Real-time PCR反应条件的优化错误！未定义书签。2.3.3Real-time PCR标准曲线的制作错误！未定义书签。2.3.4Real-time PCR的敏感性试验错误！未定义书签。2.3.5Real-time PCR的特异性试验错误！未定义书签。2.3.6Real-time PCR的重复性试验错误！未定义书签。2.3.7Real-time PCR的初步应用错误！未定义书签。2.4讨论错误！未定义书签。2.4.1荧光定量PCR检测方法的建立错误！未定义书签。2.4.2荧光定
17、量PCR反应特点错误！未定义书签。2.4.3影响荧光定量PCR反应的因素错误！未定义书签。2.4.4荧光定量PCR反应的优缺点错误！未定义书签。2.5小结错误！未定义书签。3.猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列测定错误！未定义书签。3.1材料错误！未定义书签。3.1.1病料收集错误！未定义书签。3.1.2主要试剂错误！未定义书签。3.1.3试验用溶液配制错误！未定义书签。3.1.4主要仪器设备错误！未定义书签。3.2方法错误！未定义书签。3.2.1病毒的分离错误！未定义书签。3.2.2病毒的RT-PCR鉴定错误！未定义书签。3.2.3EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA）错
18、误！未定义书签。3.2.4EMCV-GXLC株TCID50的测定错误！未定义书签。3.2.5分离株的全基因组扩增、克隆与测序错误！未定义书签。3.3结果与分析错误！未定义书签。3.3.1EMCV病毒的分离错误！未定义书签。3.3.2EMCV-GXLC株的RT-PCR鉴定错误！未定义书签。3.3.3EMCV-GXLC株间接免疫荧光抗体试验（IFA）错误！未定义书签。3.3.4EMCV-GXLC株TCID50的测定错误！未定义书签。3.3.5EMCV-GXLC株基因片断的RT-PCR扩增结果错误！未定义书签。3.3.6EMCV-GXLC株各个基因片段的克隆、测序及序列拼接错误！未定义书签。3.4讨
19、论错误！未定义书签。3.4.1关于EMCV的分离错误！未定义书签。3.4.2关于EMCV的鉴定错误！未定义书签。3.4.3关于EMCV-GXLC株全基因的扩增错误！未定义书签。3.5小结错误！未定义书签。4.猪脑心肌炎病毒广西株(EMCV-GXLC)全基因组分子特征分析错误！未定义书签。4.1材料错误！未定义书签。4.1.1本研究所用EMCV分离株信息错误！未定义书签。4.1.2分子生物学分析软件错误！未定义书签。4.2方法错误！未定义书签。4.2.1基因组结构分析错误！未定义书签。4.2.2序列比对错误！未定义书签。4.2.3结构蛋白基本特征、表位预测及二级结构错误！未定义书签。4.2.4系
20、统进化分析错误！未定义书签。4.3结果与分析错误！未定义书签。4.3.1EMCV-GXLC株的基因组组成和结构分析错误！未定义书签。4.3.2EMCV各基因片段同源性分析错误！未定义书签。4.3.3EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分析错误！未定义书签。4.3.4EMCV-GXLC株 VP1分子特征错误！未定义书签。4.3.5EMCV-GXLC株 VP2、VP3分子特征错误！未定义书签。4.3.6EMCV-GXLC株 5-UTR二级结构预测错误！未定义书签。4.3.7EMCV-GXLC株 3-UTR二级结构预测错误！未定义书签。4.3.8EMCV系统发育进化树绘制错误！未定义书签。4.4讨
21、论错误！未定义书签。4.4.1EMCV-GXLC株基因组序列比较错误！未定义书签。4.4.2EMCV-GXLC株的变异特点错误！未定义书签。4.4.3EMCV-GXLC株VP1的抗原性错误！未定义书签。4.4.4病毒基因组的系统发育进化关系错误！未定义书签。4.5小结错误！未定义书签。5.结论11附录12附录1：SYBR Green I real-time PCR用重组质粒测序结果12附录2：SYBR Green I real-time PCR重复性试验数据12附录3：EMCV-GXLC株第1 5代细胞毒TCID50测定结果56附录4：EMCV-GXLC株全基因组序列58致谢63攻读学位期间发
22、表论文情况64申明65参考文献66插图和附表插图清单图1- 1 EMCV 基因组结构和多聚蛋白裂解图2Fig. 1-1 Organization and polyprotein of the genome of EMCV2图1-2 近年来EMCV全球流行情况7Fig. 1-2 The recent global epidemic of EMCV7图21 PCR扩增产物错误！未定义书签。Fig. 2-1 Product of PCR错误！未定义书签。M. DNA Marker DL2 000；1. PCR产物错误！未定义书签。M. DNA Marker DL2 000；1. PCR produc
23、t错误！未定义书签。图22重组质粒鉴定错误！未定义书签。Fig. 2-2 Identification of the recombinant plasmid错误！未定义书签。图23 SYBR Green I real-time PCR的扩增曲线(A)、熔解曲线(B)错误！未定义书签。Fig. 2-3 Dynamic curve(A) and melting curve(B) of SYBR Green I real-time PCR错误！未定义书签。图24 SYBR Green I real-time PCR的标准曲线错误！未定义书签。Fig. 2-4 Standard curve of SY
24、BR Green I real-time PCR错误！未定义书签。图25 SYBR Green I real-time PCR特异性试验错误！未定义书签。Fig. 2-5 Specificity assay of SYBR Green I real-time PCR错误！未定义书签。图31 EMCV在BHK-21细胞上产生的细胞病变错误！未定义书签。Fig. 3-1 CPE of EMCV in BHK-21 cells错误！未定义书签。图32 EMCV-GXLC株3D基因片段的RT-PCR鉴定错误！未定义书签。Fig. 3-2 Identification of 3D gene of EMC
25、V-GXLC strain错误！未定义书签。图33 EMCV-GXLC株的间接免疫荧光抗体试验鉴定结果错误！未定义书签。Fig. 3-3 IFA identification of EMCV-GXLC strain in BHK-21 cells错误！未定义书签。图34 EMCV-GXLC株基因组各片段扩增结果错误！未定义书签。Fig. 3-5 The amplified fragments the genome of EMCV-GXLC strain by RT-PCR错误！未定义书签。图41 EMCV-GXLC株的序列信息错误！未定义书签。Fig. 4-1 Sequence informa
26、tion about EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。图42 EMCV-GXLC株基因组组成简图错误！未定义书签。Fig. 4-2 The genome organization diagram of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。图43 EMCV-GXLC株与EMCV参考毒株VP1蛋白氨基酸序列比对错误！未定义书签。Fig. 4-3 Alignment of the predicted amino acid sequences for VP1 of EMCV错误！未定义书签。图44 EMCV-GXLC株 VP1蛋白特性预测错误！未定义书签。Fig.4-4
27、 Prediction on antigen sites and some characters of VP1 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。图45 EMCV-GXLC株 VP2和VP3氨基酸序列错误！未定义书签。Fig. 4-5 Predicted amino acid sequences of VP2 protein and VP3 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。图46 EMCV-GXLC株 VP2蛋白特性预测错误！未定义书签。Fig. 4-6 Prediction on antigen sites and
28、 some characters of VP2 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。图47 EMCV-GXLC株 VP3蛋白特性预测错误！未定义书签。Fig. 4-7 Prediction on antigen sites and some characters of VP3 protein of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。图48 EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的5-UTR二级结构预测错误！未定义书签。Fig. 4-8 Prediction of the 5-UTR secondary structure of EMCV-G
29、XLC strain and reference EMCV错误！未定义书签。图49 部分EMCV分离株的ploy（C）结构域基因片段比对结果错误！未定义书签。Fig. 4-9 Alignment of the nucleotide sequences for ploy(C) of EMCV错误！未定义书签。图410 EMCV-GXLC株与部分EMCV参考株的3 -UTR二级结构预测错误！未定义书签。Fig. 4-10 Prediction of the 3-UTR secondary structure of EMCV-GXLC strain and reference EMCV错误！未定义书
30、签。图411 EMCV 全基因组、ORF核苷酸序列系统发育进化树错误！未定义书签。Fig. 4-11 Phylogenetic trees derived from EMCV complete genome and ORF nucleotide sequences错误！未定义书签。图412 EMCV CCR、VP3/VP1、VP2和VP1核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！未定义书签。Fig. 4-12 Phylogenetic trees derived from four EMCV datasets，i.e. CCR，VP3/VP1，VP2 and VP1 nucleotide seque
31、nces错误！未定义书签。图413 EMCV P2、P3、2A、3D核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！未定义书签。Fig. 4-13 Phylogenetic trees derived from four EMCV datasets，i.e. P2，P3，2A and 3D nucleotide sequences错误！未定义书签。图414 EMCV 3-UTR、5-UTR核苷酸序列绘制的系统发育进化树错误！未定义书签。Fig. 4-14 Phylogenetic trees derived from EMCV 3-UTR and 5-UTR nucleotide sequences错误！
32、未定义书签。附表清单表 21 荧光定量PCR所用引物错误！未定义书签。Table 2-1 The primers of real-time PCR错误！未定义书签。表 22 模板浓度、引物浓度的优化错误！未定义书签。Table2-2 Optimize the concentration of template and primers错误！未定义书签。表 23 SYBR Green I real-time PCR敏感性试验错误！未定义书签。Table 2-3 Sensitivity assay of SYBR Green I real-time PCR错误！未定义书签。表 24 SYBR Gre
33、en I real-time PCR的重复性试验错误！未定义书签。Table 2-4 Reproducibility assay of SYBR Green I real-time PCR错误！未定义书签。表 31 PCR所用引物错误！未定义书签。Table 3-1 The primers for PCR错误！未定义书签。表 32 扩增EMCV-GXLC株全基因组序列所用的引物错误！未定义书签。Table3-1 Primers used for amplification of the complete genome of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。表 33 用于5-R
34、ACE和3-RACE的引物错误！未定义书签。Table 3-3 Primers for 5-RACE and 3-RACE错误！未定义书签。表 34 EMCV-GXLC株细胞毒TCID50测定错误！未定义书签。Table 3-4 Detection the TCID50 of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。表 41 EMCV参考毒株错误！未定义书签。Table 4-1 EMCV reference strains in this study错误！未定义书签。表 42 EMCV-GXLC株基因组结构错误！未定义书签。Table 4-2 The genome organizat
35、ion of EMCV-GXLC strain错误！未定义书签。表 43 EMCV-GXLC株与其他EMCV参考株核苷酸及推导的氨基酸同源性分析错误！未定义书签。Table4-3 Comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequences of the EMCV-GXLC strain with other EMCV strains错误！未定义书签。表 44 EMCV多聚蛋白各基因片段连接处氨基酸分布情况错误！未定义书签。Table 4-4 Putative polyprotein cleavage sites junction
36、predicted amino acid sequences错误！未定义书签。缩略词表缩略词英文全称中文全称aaamino acid氨基酸Ampampicillin氨苄青霉素bpbase pair 碱基对BHK-21Baby hamster kidney cell line乳仓鼠肾细胞传代细胞系cDNAcomplementary DNA互补DNACPEcytopathic effect细胞病变CSFVclassical swine fever virus猪瘟病毒DEPCdiethyl pyrocarbonate焦磷酸二乙酯DNAdeoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸dNTPsd
37、eoxyribonucleoside triphosphate三磷酸脱氧核苷EDTAEthylene diamine tetra acetaticacid乙二胺四乙酸EMCVEncephalomyocarditis virus脑心肌炎病毒FMDVFoot and mouth disease virus口蹄疫病毒IFAindirectimmunofluorescentantibodyassay间接免疫荧光抗体试验IPTG-D-thiogalactopyranoside异丙基硫代半乳糖苷kbkilo base pair千碱基对Lliter升mgmilligram毫克minminute分钟mLmil
38、liter毫升ntnucleotide核苷酸PBSphosphate-buffered saline磷酸盐缓冲液PCRpolymerase chain reaction聚合酶链式反应r/minrevolutions per minute每分钟转数RACErapid amplification of cDNA ends快速扩增cDNA末端RNasinribonuclease inhibitor核糖核酸酶抑制剂RTreverse transcription反转录ssecond秒TCID5050% tissue culture infection dose半数组织（细胞）培养感染量Lmicrolit
39、er微升X 硕士学位论文 猪脑心肌炎病毒广西株的分离及其全基因组序列分析1. 文献综述脑心肌炎是由脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）引起的猪、某些哺乳动物乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的一种急性传染病 Koenen FEncephalomyocarditis virusMIn：trawB.E.，Zimmerman，Allaire S.D., Taylor d.j(Eds.). Disease of swine, 9th Edition. Iowa: Blackwell Publishing Professional, 2006
40、:33l336.。EMCV感染猪只所致病情的严重程度与病毒的毒力和猪只的年龄有关，感染断奶前仔猪可引起致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可达100% Zimmermann A, Nelsen-Salz B, Kruppenbacher J P, et al. The complete nucleotide sequence and construction of an infectious cDNA clone of a highly virulent encephalomyocarditis virusJ. Virology, 1994, 203(2):366372.；而断奶后到成年猪则
41、多呈亚临床感染，偶尔引起死亡；怀孕母猪感染时可引起流产、产死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍症，通常不发生猪只死亡 Christianson W T，Kim H S，Yoon I J，et alTransplacental infection of porcine fetuscs following experimental challenge inoculation wity encephalomyocarditis viruJAm J Vet Res1992，53(1)：4447。1945年，Helwig等 Helwig FC, Schmidt ECH. A filter-passing ag
42、ent producing interstitial myocarditis in anthropoid apes and small animalsJ. Science, 1945, 102(2637):3133.从佛罗里达州一只患急性致死性心肌炎的黑猩猩体内分离得到第一株EMCV。几年后，Dick等 Dick GWA, Smithburn KC, Haddow AJ. Mengo encephalomyocarditis virus: isolation and immunological propertiesJ. Br J Exp Pathol, 1948, 29:547558. 又从一
43、只患脑脊髓炎的恒河猴体内分离得到该病毒。随后相继报道，该病毒可以感染多种动物，包括狒狒、非洲绿猴、松鼠、大象、疣猪、貘、长颈鹿甚至蚊子等 Kissling RE, Vanella JM, Schaeffer M. Recent isolations of encephalomyocarditis virusJ. Proc Soc Exp Biol Med, 1956, 91:148152. , Hubbard, G.B., Soike, K.F., Butler, T.M., et al. An encephalomyocarditis virus epizootic in a baboon
44、colonyJ. Lab Anim Sci, 1992, 42(3):233239.。1958年，巴拿马首次报道EMCV引起了仔猪急性致死性心肌炎 Murnane TG, Craighead JE, Mondragon H, et al. Fatal disease of swine due to encephalomyocarditis virusJ. Science, 1960, 131:498499. 。随后在意大利、希腊、塞浦路斯、比利时、法国、英国等国报道了该病的暴发流行 Gualandi GL, Cammi G, Cardeti G. A serologic survey of encephalomyocarditis virus infection in pigs in ItalyJ. Microbiologica, 1989, 12(2):129132., Paschaleri-Papadopoulou E, Axiotis I, Laspidis C. Encephalomyocarditis of swine in GreeceJ. Vet Rec, 1990, 126(15):364365.。但直到1986年才将EMCV与猪的繁殖障碍性疾病联系起来 Links