硕士论文-食用菌病毒的研究.doc

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1、福建农林大学硕士学位论文摘要香菇具独特香味且有多种保健功能，是我国栽培的主要食用真菌之一。但近些年我国大陆部分产区出现了不同程度的香菇病毒病，使香菇的产量和质量受到明显影响，重者绝收，损失严重。本实验结合dsRNA方法和酶法对福建农林大学菌物研究中心收集自不同地方的8个疑似病毒病香菇菌株和61株表现正常的香菇菌株进行dsRNA因子检测。最后发现：采自不同地方的8个疑似病毒病香菇菌株均含有相同大小的dsRNA条带，即：11kb、1.6kb、0.9kb；而61株表现正常的菌株中70%都含有大小数量不同的dsRNA条带，且含有dsRNA条带的菌株中大都有11kb这条带。dsRNA是RNA病毒复制的中

2、间产物，dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常食用菌体内不含有dsRNA， dsRNA的存在在某种程度上反映了体内病毒的存在，因此可以通过提取dsRNA对该类病毒进行检测等方面研究。 通过本试验我们看出dsRNA在香菇中是相对普遍存在的，但它究竟是在香菇的生长发育中起什么作用？考虑到dsRNA的普遍发生及其不明的生物学作用和香菇的经济价值的日益增长，必须提出一种旨在发展无dsRNA的育种用菌株究方案，只有获得了含有dsRNA和不含有dsRNA的同基因菌株，以上的问题才有可能得到解决。因此接下来选取三个疑似病毒病菌株采用挑取菌丝尖端（长度小于0.2mm）的方法进行脱毒。经脱毒后我们发现

3、1.6kb和0.9kb的条带容易被脱除，三个菌种脱毒后都能得到只含11kb一条带的菌株，然而只有一个菌种得到了一株无dsRNA的菌株。我们接下来对脱毒不彻底菌株、彻底脱毒菌株和带毒菌株做了酶活、不同条件下的生物学特性研究。结果发现彻底脱毒菌株和脱毒不彻底菌株在抗逆性方面和酶活明显优于带毒菌株。关键词：香菇病毒 dsRNA技术 尖端脱毒 酶活 生物学特性AbstractWith special aroma and many kinds of health care functions,lentinula endodos is one of main cultivated mushroom in

4、China.while in recent years,various degrees of virus disease were detected in Mainland Lentinula edodes,causing severe influences in yield and quality In this experiences ,sixty-eight Lentinula edodes Strains,including eight suspected of virus disease and sixty-one normal strains,collected in mycolo

5、gical research center of Fujian Agriculture and Forest university were detected by gel electrophoresis patterns and enzyme method.finally we found they all have the same number and size bands in eight suspected of virus disease strains,that is 11kb,1.6kb,0.9kb in size.seventy percent of normal strai

6、ns have various size and number bands,most containing the band in11kb size.Double stranded RNA(dsRNA) occurs during the replication of mushroom virus.these dsRNAs are corresponding to genome of viruses and subviral agents .consequently infected tissues contain virus-specific dsRNAs.since healthy mus

7、hroom produces no dsRNA,purification of dsRNA is useful for virus diagnosis.Through the experiences we draw the conclusion that dsRNA in Lentinula edodes is widely existed. But what function does it have in mushroom development ? Considering its commonly occurred and its unknown biological aspect,al

8、so the increasing economic value of Lentinula edodes,it is important to propose a breeding scheme with no dsRNA in it. Only if we obtain the strain without dsRNAs, can these questions be answered. So we selected three Lentinula edodes strains from eight suspected of virus disease to eliminate virus

9、by picking up 100 hypha tips(less then 0.2mm in length) each.As results, we all gained strains with one dsRNA band(11kb) left in three Lentinula edodes strains, which we called incomplete eliminated strain. But we only got one strain with no dsRNA bands in it ,which we called virus-free strain. From

10、 this we can know ,the virus- elimination rate is very low by this method. Next we studied the enzyme activity and biological characteristics on incomplete eliminated strain, virus-free strain and infected strain,then we found the two former strains were significantly higher than the latter in stres

11、s resistance aniquend enzyme activity.Keywords：Lentinula edodes virus;DsRNA technique; Virus elimination technique of hypha tip;Enzyme activity;Biological characteristics第一章 文献综述第一节 食用菌病毒的研究概况食用真菌在我国栽培历史悠久，在世界许多国家也有广泛的栽培。作为世界上最早进行食用菌培育栽植、同时拥有丰富真菌物种资源的国家，中国食用菌产量以年均百分之十五的速度增长，目前年产量已经超过一千四百三十七万吨，占全世界总产

12、量的百分之七十以上1。随着大规模生产的发展，病害问题逐渐受到人们的关注，其中病毒病因为不易辩认或症状时隐时现，对蘑菇(Agaricus bisporus)和香菇(Lentinula edodes)等栽培食用菌的生产已成为一种潜在和现实的危害。早在1950年，法国人sinden和Hauser调查美国宾州蘑菇病害时在双孢蘑菇（agaricus bisporus)切口上发现的一种未曾报道过的新病害，并命名为法兰西病 “La France Disease” 2。英国人Holling等从发病的双抱蘑菇子实体中分离到球状和杆状的病毒样粒子（VLPs），对食用菌中的病毒首次进行了报道，并初步认为蘑菇病害的病

13、原物就是这些寄生在真菌的病毒，得这种病的双孢蘑菇因菌丝大量死亡而产生大面积枯斑，因此又称之为“枯斑病”3。后来Van Griensven证实得枯斑病的双孢蘑菇菌丝并非死亡只是在培养料中长势明显减弱4。到目前为止，相关的研究表明真菌病毒(mycovirus)普遍存在于栽培食用菌的各个类群中，如双孢蘑菇、香菇、侧耳等5,但Sonnenberg, Van Kempen 和Van Griensven,通过对133个野生双孢蘑菇菌株的研究中发现这些野生菌株并没有病毒存在6，Van Zaayen也曾报道大肥菇A.bitorquis的品系对病毒病是相对抗病的7。1.1食用菌病毒的形态 在已知的包括食用菌病毒

14、在内的一百多种真菌病毒中，大多数为直径25-45nm的球状病毒，少数为杆状、短杆状、以及严重感病蘑菇相关的棍棒状颗粒8。在双孢蘑菇中，与法国蘑菇病( La France disease)有关的典型的病毒颗粒有3种：直径分别为25nm和34 36nm的等轴对称颗粒以及19nm50nm的细菌状颗粒9,10。也有把直径为25nm、29nm大小的颗粒分别称为MV1、MV2，把19nm50nm 的称为MV3，直径34或35nm大小的颗粒称为MV4，50nm的称为MV511。日本(1975)报道了侵染香菇的病毒有直径分别为 25nm、 30nm、 39nm和直径分别为30 nm、36 nm、45 nm的二

15、组球状病毒颗粒以及长度及直径不等的杆状病毒12。 在中国栽培的香菇中也有直径分别为28nm、36nm、40nm的球状病毒和20100 200nm的杆状病毒的报道13。Yumi Magae等在金针菇( Flammulina velutipes) 中发现有直径为50 nm的球状病毒颗粒14。在侵染同一种食用菌时，有时病毒的大小和形状也许会稍有差异，可能是由其生长条件的不同所致，也可能是提取方法不同所造成的影响，当然也可能是由一类病毒变异的的不同株系或不同种类的病毒。 1.2食用菌病毒基因组及外壳蛋白特征 虽然有的真菌病毒为dsDNA病毒15，但迄今发现的食用菌球状病毒的基因组大部分是dsRNA，其

16、基因组为一个或多个组分，分别包装在几个病毒粒子中。食用菌病毒中也有少数基因组为ssRNA，如引起双孢蘑菇“La France Disease”的 1750 nm的那种杆状病毒和引起香菇病害的一种球状病毒（潘迎捷等）16。其中引起双孢蘑菇法兰西病的那种秆状病毒的形状、大小、基因组分子量、基因组与病毒粒子的重量比，外壳蛋白分子量都与苜蓿花叶病毒 (Alfalfa mosaic virus，AMV)十分相似，但它们没有血清学关系17。几乎所有包括食用菌病毒在内的真菌病毒都只有一种外壳蛋白，不同病毒的外壳蛋白分子量大小也是不同的，也有报道过具有一种以上的外壳蛋白的病毒，但不能排除在提纯外壳蛋白过程中有

17、外壳蛋白降解的可能。迄今为止，食用菌中发现的病毒外壳蛋白都是由病毒基因组编码的。接下来就在栽培食用菌中目前已经发现的病毒的基因组情况做一下详细阐述。1.2.1 蘑菇病毒 X( mushroom virus X，MVX) 关于蘑菇病毒X最初的报道是1996年在英国的一个蘑菇栽培农场，之后在英国各地至少有十五家农场有相似症状报道，主要症状为在蘑菇覆土后菌丝不生长，产生大量不同形状和大小的秃斑，之后不出菇或是长出畸形菇，严重影响了蘑菇的产量和质量，宾夕法尼亚州立大学通过改进的凝胶电泳技术在发病的菇中提取到了新的dsRNA条带18。而后Gaze et al又报道了从菌株发病位点提取了6条dsRNA条带

18、，而健康的蘑菇中是不含有的19。人们推测这些dsRNA条带是由病毒引起的，并把这种几乎发生在全世界范围内的新病毒统一称作蘑菇病毒X(MVX)。MVX的dsRNA多达26条：B1到B23和三个野生型杂合dsRNAs（BH1到BH3），基因组大小从640bp到20.2kb20。其中B23是最小的片段，可能是与B3连接在一起的，并与板栗疫病毒有极高的相似性。现已证明四个分子量较低的片段(B18, 2.0 kb;B19, 1.8 kb;B22, 0.8 kb和B23, 0.6kb）是与白色蘑菇的褐变有关的，但在不同样品的dsRNA出现的频率的也不一样，不同的样品中的dsRNA带型也不样21。从病毒的d

19、sRNA的数量和大小以及图谱上来看，可能不只是一种病毒。相比之下BH1到BH3这三个杂合野生型片段通常无症状的样品中发现，可能它们单独时存在不会引起病害。 其它的23个dsRNA都是与蘑菇病症状有关的。但研究表明蘑菇的那些症状并非是单一病毒侵染引起的，而是多种病毒混合侵染时才表现处严重症状。 1.2.2双孢蘑菇杆状病毒(mushroom bacilliform virus, MBV) 蘑菇杆状病毒形状为19 x50nm的杆状颗粒，基因组为单分体单链正义RNA， 长度为4kb21,22。MBV也与“La France disease” 有关，能够导致减产，但是MBV具体的致病机制还不十分的清楚。

20、MBV的序列已经测定， 包括 4个阅读框， 各自编码20,000、73,000、47,000、22,000分子量的多肽23。MBV阅读框的组成和通过基因推测的氨基酸序列与植物病毒很相似，特别是与黄症病毒组(1uteovimses)的亚组II和南方菜豆花病毒组(sobemoviruses)24。MBV在5末端有VPg蛋白，所谓的VPg蛋白，是正链病毒RNA末端的与RNA共价连接的蛋白质，该蛋白由病毒编码，在植物病毒常见，如黄症病毒科。VPg蛋白可能与病毒RNA的复制有关，有些病毒VPg是侵染必需的，主要与RNA的合成的起始有关。 1.2.3双孢蘑菇病毒(Agaricus bisporus vir

21、us) 在双孢蘑菇中，通常认为与典型的“La France disease”有关的病毒的dsRNA有9个，大小在0.8和3.8 kbp之间，按基因组的大小分别将他们分为大、中、小三个类别， 其中大的类别中有5个( L1，3.6 kbp；L2， 3.0kbp；L3，2.8kbp；L4，2.7kbp；L5，2.5kbp)，中等类别中有2个( M1，1.55 kbp；M2，1.3kbp)，小类别中有2个(s1，0.9kbp；s2，0.8kbp)。其中M1、M2和L3被报道与双孢蘑菇法兰西病密切相关，S3是由M2内部发生断裂而形成，在研究的大量病菇中只是偶尔被发现25。但是这些dsRNA究竟是被各自包

22、裹在病毒颗粒中，还是有不同的组合，或者是9个dsRNA片段被包裹在同一中病毒颗粒中，还不是十分的清楚， 但是从病毒颗粒的大小来看( 直径为3436nm)，所有的dsRNA不像是被包裹在同一种颗粒中，更像是包裹在不同的颗粒中，这些颗粒有相似的密度。依赖于dsRNA片段的大小，各种dsRN A不同的组合，或者一个、多个的单个dsRNA的拷贝，被包装起来。dsRNA的5个推测序列只有依赖于RNA的R NA聚合酶( RdRp)与现存的数据库中的蛋白有相似性，与全病毒( totiviruses )和分体基因病毒( partitiviruses ) 最为相似。然而，“La France disease ”

23、等轴颗粒病毒( La France isometric virus，LIV)被认为是近期的起源，因为它的密码子与其寄主双孢蘑菇所用的不同25。根据它的基因组的性质以及RdRp序列的相似性，可能是起源于双分体基因组病毒， 通过重组等方式增加额外的基因进化而成的。 这些额外的基因是病毒传播和致病性所必需的。在不同来源的样品中，病毒dsRNA的序列是有一定变化的。1.2.4糙皮侧耳病毒I ( Pleurotusostreatus virusI；PoVI) 糙皮侧耳病毒 I的基因组有两个片段，dsRNA1和ds RNA2，长度分别为2296和2223bp。推测的氨基酸序列与两分体病毒科相似，其中 ds

24、RNA1编码RdRp， dsRNA2编码衣壳蛋白。提纯的病毒颗粒直径为2830nm。dsRNA1的3末端和5末端的非翻译区，长度分别为78nt和97nt；dsRNA2的3UTR和5UTR分别为114nt和198nt，系统发育分析 ( phylogenetic analysis)发现属于两分体病毒的分枝26。 1.2.5平菇球形病毒( oyster mushroom spherial virus ) 平菇球形病毒与顶死病( Die back disease)有关，病毒颗粒的直径为27nm，基因组为正义单链RNA，长度为57 8 4 kbp；衣壳蛋白的分子量大约为285kDa。分析基因组可知有7个

25、阅读框 ，ORF1有RdRp和旋转酶，ORF2编码衣壳蛋白，其它的阅读框所推测的氨基酸序列与已知的没有明显的同源性。病毒的5末端没有帽子结构，3末端有polyA尾巴27。 1.2.6金针菇病毒( Flammulina velutipes virus )金针菇(Flammulina velutipes)病毒的基因组是dsRNA，分成两个片段，大小为 1.8kbp和1.9kbp。dsRNA不在细胞核和线粒体中，在细胞质中。病毒颗粒的直径为50nm。基因组是从菌体提取出来的，菌体来自于自发变为褐色的子实体，dsRNA的量很少，不容易从菌丝体中提取28。 1.2.7香菇病毒（Lentinula edo

26、des virus）目前在香菇体内已发现的病毒都是球状病毒，大小在25nm到45nm,基因型多为dsRNA。因为大多为潜隐性病毒，所以尚未引起重视。潘迎捷等人发现的一个会引起菌种退化的球状病毒，经提纯裂解后得到它的基因型为ssRNA，分子量为2.38 106,其外壳蛋白分子量为33,000道尔顿 。香菇病毒病主要发生在菌丝体的营养阶段，其主要症状是菌丝生长减弱和菌丝体在培养料中的退化，在子实体发育的生长阶段也有表现，主要症状是畸形菇的比例增加，产量减少，并会引起菌种退化 29 。第二节 食用菌病毒的起源、复制与传播2.1食用菌病毒的起源 关于病毒进化，有三种理论经常涉及。这些理论包括病毒起源于

27、细胞内退化的寄生物，起源于细胞内核酸和来自生命以前的自我复制的RNA分子 30 。单基因组病毒常被认为是起源于自我复制的细胞内mRNA，是因为它们明显的古老起源， 简单的基因组，与RdRp的同源性和有效的利用寄主的蛋白。细胞内的mRNA( 如编码依赖于RNA的DNA聚合酶) 可能通过得到一个复制的起始点而获得自我复制的能力。假设这种自我复制的mRNA能获得编码衣壳蛋白的基因，这样就产生了一个简单的正链RNA病毒。正链RNA的复制涉及到了负链RNA这个中间体的合成，因此，dsRNA病毒可能起源于正链RNA病毒。另一方面， 涉及反义 R N A合成的细胞翻译的调控机制，也能导致dsRNA的合成。单

28、基因组病毒也可能起源于它们的祖先ssRNA通过减少生存所不必要的基因而形成的。双分体病毒可能起源于单基因组病毒，通过把它们的基因组分成两个dsRNA片段，各自编码CP蛋白和RdRp。所以，食用菌病毒最原始的起源应该是自我复制的细胞内的mRNA，通过获得生存所需要的必需基因而形成ssRNA病毒；通过上述的机制进一步的进化成单基因组 dsRNA病毒，最后形成双分体病毒。 2.2食用菌病毒的复制 分子水平上病毒的复制严格定义是基因组核酸拷贝数的增加，RNA病毒的复制过程一般都以单链RNA为模板，在RNA聚合酶RdRp的指导下进行新的互补RNA链的合成，而不经过DNA阶段（反转录病毒除外），因此，在R

29、NA病毒的复制过程中均会有dsRNA产生，即复制型dsRNA，复制型RNA的负链在RdRp作用下，进一步解离为单链，并以此合成大量子代dsRNA，此时的形式称为复制中间体。Sriskantha等从感染La France Disease的双孢蘑菇孢病毒孢子抽提液中测出依赖RNA的RNA聚合酶的活性比对照组来自健康蘑菇孢子抽提液中该酶的活性高15倍，并测出这个RNA聚合酶对放线菌素D、鹅膏蕈碱和利福平敏感，从而证实它是依赖于RNA的RNA聚合酶，而不是依赖DN A的RNA聚合 酶。 该酶在体外的复制产物在低离子浓度时对RNAase A敏感说明该产物为ds RNA。 电泳结果表明 ，这个ds RN

30、A与病毒中抽提出的dsRN A的条带位置一样，因此认为这个RNA 聚合酶在体内可能为基因组dsRNA的复制酶 31。此外，食用菌病毒以外的真菌病毒半保留及全保留复制的模式也为食用菌病毒研究提供了有益的参考。目前的复制研究还仅限于体外研究，体内研究的开展有待实验技术的进一步提高。从目前已发现的食用菌病毒中， 基因组不管为单链的还是双链的，其推测的阅读框编码的蛋白质几乎都有衣壳蛋白和RdRp，当然有一些还没有深入研究。我们可以设想病毒的复制，即产生子代，需要聚合酶合成子代的基因组， 基因组需要病毒颗粒的包被，因此衣壳蛋白和RdRp应该是不可缺少的，当然也有裸露的dsRNA。因此，在单基因组病毒和双

31、分体病毒中，许多病毒只保留他们生存所必需的基因，即RdRp和衣壳蛋白(Cp)，然后充分地利用寄主的蛋白。寄主的细胞能进化到并维持病毒特定的复制水平，这种水平低于病毒可达到致病的水平。这就是为什么真菌病毒侵染寄主后表现为潜在性和无症状性， 是与寄主共进化、适应的结果 。正是真菌病毒的这种性质， 赋予了它特有的复制模式。根据匐枝青霉病毒聚合酶的研究发现，该聚合酶能催dsRNA复制， 复制后的产物是dsR NA，且不释放，从而产生了有两个分子的dsRNA病毒颗体。复制是半保留性的，分两个阶段进行：(1) 转录中新合成的链使dsRNA中的一条链分开，并成为两条链的其中一个；(2)以这条分开的ssRNA

32、链为模板合成dsR NA， 这种复制不同于呼肠孤病毒的复制。另外一种可能的复制模式是非同步的复制，即转录中新合成的链，使dsRNA中的一条链分开，而移开的链从亲本颗粒中释放出来， 然后包被于衣壳蛋白中并形成新生的子代病毒颗粒体， 在病毒颗粒中， 此链作为模板合成dsRNA。至于裸露的dsRNA的复制，有待于进一步的研究。 2.3食用菌病毒的传播 食用菌病毒可以通过分生孢子、担孢子、菌丝的营养繁殖，菌丝融合而传播。其中担孢子传播是最重要的途径。早在1972年就已通过电镜观察到双孢蘑菇担孢子中的病毒粒子 。病毒的这种传播方式给通过切断病毒传染途径来控制病毒传播带来很大困难。在蘑菇中，有亲和性的异性

33、菌丝融合也是一个重要的传播途径。通过菌丝融合，病毒可以从带毒菌丝传到健康无毒菌丝上。当带毒蘑菇收获后，残留在培养基质中的菌丝也可以和新种植的蘑菇的菌丝融合，使后者带毒。但是，食用菌不同种之间的不亲和性可以在一定程度上阻止这种传播。在食用菌病毒中虽有报道蚤蝇(Megaselia halterata) 摄取纯化病毒液后，可以以很低的效率将病毒传播到无毒寄主上 ，但不能将病毒从带毒寄主传播到无毒寄主。至今还没有发现食用菌病毒的介体能直接而有效地传播。蘑菇病毒发生的程度与感染病毒的种类及感染的时间有密切关系。在大多数情况下，是几种病毒的混合感染，这对生产的危害最大。食用菌病毒的不能通过机械摩擦方法接种

34、给实验研究带来了很大困难。但可采用原生质体融合的办法来克服寄主不亲和性和寄主细胞壁坚而厚的障碍，是传播病毒的可行实验方法。与其它真菌病毒一样，食用菌病毒通常以几种病毒混合侵染的方式侵染寄主，这类病毒的寄主专一性较强32。这类病毒侵染的一个显著特点是寄主感染后具有潜隐性33。在大多数情况下，不管一种还是几种病毒同时侵染一个寄主时，并不对寄主造成明显的危害，被侵染的寄主也无症状表现。有人推测，这种情况是因为病毒感染的时间不同或是寄主体内病毒浓度较低的表现，这种潜隐性通常是由于寄主体内病毒浓度较低的表现，但也有实验表明，不管有或无症状表现的寄主在同等条件下抽提出的病毒量相同。病毒的侵染也能引起寄主表

35、现一定的症状，如在香菇中，病毒的侵染出会引起大面积病害，主要症状是：在菌丝的营养生长阶段菌丝长势减弱，出现各种不同的花斑和缺刻，培养料中大部分菌丝退化，有些出现大面积烂筒；在子实体生长阶段菌柄伸长弯曲而菌盖很小，菌柄膨大而菌盖很小，有的甚至不出菇或寥寥几朵，生长缓馒，略带黄，袋装菌块上形成秃斑，有时产生不正常的孢子，使香菇的产量和质量受到明显影响，重者绝收，损失严重 。在栽培蘑菇中，同一种病毒病的症状也可因寄主生长环境，培养条件不同而变化，例如 La France Disease，Waterystape，Die-back disease等，都是对同一种病毒病的描述。虽然在一般条件下病毒对食用菌

36、表现隐性侵染但却对某些寄主有一定致病性。病毒致病性和潜隐性的表现可能取决于寄主的基因型和外界条件34。如感染球状病毒的香菇菌丝25下比健康不带病毒的菌丝生长缓慢而在温度较低的条件下袋装菌块上形成的秃斑能重新长出菌丝，并形成子实体。受病毒感染的食用菌对其他病原菌的抵抗能力明显下降，特别易再受细菌或霉菌感染 。2.4 食用菌脱毒相对植物病毒来说，食用菌病毒方面的研究很少，因此关于脱毒的研究也还处在刚刚起步阶段，而且多数是借鉴植物脱毒病毒技术。茎尖脱毒技术现在已广泛应用于大蒜，马铃薯等植物中，并取得了理想的结果。其主要原理就是在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性高，竞争抑制了病毒的复制。而在食用菌生长中

37、分裂最旺盛的部位就是尖端菌丝，因此我们推测通过挑取尖端菌丝也应该能获得脱毒菌株。第三节 dsRNA的来源及其在食用菌检测中的应用一般情况下，在正常的生物组织体内的RNA（包括mRNA、tRNA、rRNA）是来自该生物基因组DNA转录过来的有着局部双螺旋结构的单链线形分子，对外界因素较敏感。dsRNA是大部分RNA病毒（除逆转录病毒如艾滋病病毒HIV及乙肝病毒HBV等），在复制过程中都需要经过的阶段，甚至有些病毒的基因组本身就是dsRNA形式，大部分dsRNA是RNA病毒存在的表现。RNA病毒复制过程中产生的dsRNA通常是特异对应于病毒基因组的，即单链RNA病毒的dsRNA的分子量大小为其基因

38、组大小的两倍；并且如果是多分体RNA病毒，则有相应几个组分dsRNA35。所以通过检测食用菌体内的dsRNA，可以来鉴定RNA病毒。1979年Morris和Dodds成功的将dsRNA技术用于植物和真菌病毒的研究36。dsRNA技术的基本方法是将去垢剂、抗氧化剂及鳌合剂的缓冲液和有机溶剂加入充分磨碎的植物组织中，使其变性去除蛋白质，且没有复制的中间体和复制形式的dsRNA被分离出来，样品中的dsRNA和纤维素之间的吸附在15%乙醇的浓度下达到最大，而不是在更高的乙醇的浓度下，即在15%乙醇浓度下，纤维素吸附dsRNA的能力最大。此方法已在植物病毒检测中广泛应用。如稻瘟病菌中双链RNA的检测37

39、，葡萄病毒中dsRNA的检测38，在食用菌中，如在平菇上、双孢蘑菇的应用39。由于dsRNA结构稳定，在高盐的浓度下对RNA酶A有一定的抗性，使得dsRNA技术在提取dsRNA时，有更大的优势，实验要求不是非常严格，快速，方便。第四节 本研究的目的和意义香菇具独特香味且有多种保健功能，是我国栽培的主要食用真菌之一。但近些年我国大陆部分产区出现了不同程度的香菇病毒病，使香菇的产量和质量受到明显影响，重者绝收，损失严重。因为食用菌病毒具有潜隐性特征，所以单从症状观察来检测病毒肯定不能起到好的效果。现已发现的真菌病毒多为RNA病毒，而它们在复制期都产生dsRNA，但正常香菇中是不含有的，而且dsRN

40、A结构稳定，dsRNA技术已广泛应用于动植物病毒的检测中。我们将dsRNA技术引入到香菇病毒的检测中，对实验室部分库存菌株进行检测，探测dsRNA在香菇中的存在程度。之后对带毒菌株进行脱毒，为研究dsRNA在香菇中的作用提供素材。第二章dsRNA病毒的检测 第一节 对疑似病毒病菌株的病毒检测1.1培养基 斜面PDA培养基：200g马铃薯（浸提液）、20g葡萄糖、20g琼脂、pH自然加水至1000ml。液体培养基：20g玉米粉、20g豆饼粉、1%硫酸镁、1%磷酸二氢钾，pH自然加水至1000ml40。1.2试验材料表2.1疑似病毒病菌株Table2.1 The strains be suspec

41、ted of virus disease菌株编号 isolate no. 来源 location 症状 symptomsL0183 一菇农从武汉带来的香菇病菌筒经组织分离获得 香菇覆土后子实体长出后死亡L0065+4 浙江省丽水市林科所应国华提供 子实体长出后出现大面积死亡天达300 河南农大老师提供 确定含有病毒的平菇菌种L0011+14.2 福建南阳村 病菇组织体分离 菌丝退化死亡菌筒流出黄色液体L0011+17 福建南阳村 病菇组织体分离 菌丝退化死亡菌筒流出黄色液体L0011+13 福建南阳村 香菇栽培袋分离 烂筒量90%L0011+11 福建南阳村 香菇栽培袋分离 烂筒量40% L0

42、011+19 福建南阳村 香菇栽培袋分离 正常取样号L0011+10 福建古田 香菇栽培种分离 正常取样号注：11系列为为采自不同农户的同一菌种1.3 主要试剂纤维素粉cellulose购自sigma公司；DNase、RNaseA购自宝生物公司；SDS、EDTA、Nacl、Tris、乙醇、氯仿、苯酚、异戊醇、巯基乙醇等为国产分析纯试剂。1.4 主要仪器电泳仪（北京六一仪器厂，DYY-12型）、凝胶成像系统（上海天能公司，TANON-2008）、超净台、恒温摇床（国华仪器，BA-IEA）、电子天平（Ohaus，10mg/510g）、高压灭菌锅、生化培养箱（上海一恒，LRH-250）、冷冻离心机：

43、Sigma 3K30冷冻离心机）1.5实验方法1.51菌株的dsRNA检测（1）菌丝收集 将4冰箱保种的香菇菌株接种于试管斜面培养基，转管活化710天，用接种耙耙碎后，接入装有100ml液体PDA培养基的250ml三角瓶中，每个菌株各接3瓶，于25摇床上120rpm/min培养10天，两层纱布过滤，用灭菌水洗去未消耗的培养基，滤纸吸干后，用滤纸包好，直接用来提取病毒粒子或于-20保存备用。（2）菌丝研磨 取30g菌丝在提取缓冲液中(4)充分研磨；提取缓冲液为：2STE (50mMTris,100mM NaC1，lmM EDTA，pH70，1mLg菌丝)，加入等体积的苯酚(1mLg菌丝)，12体

44、积氯仿异戌醇(25：1，05mLg菌丝)，110体积的10的SDS(01mLg菌丝)，110体积的巯基乙醇(01mLg菌丝)。（3）离心 研磨混合液在4下搅拌1小时，然后8000 rmin离心15min，吸取上清，加入无水乙醇，使其终浓度达到16，然后加入1.5g纤维素粉cellulose，混匀后4吸附1h。（4） 过柱 将上述混和液混匀后倒入10mL注射器内(下垫尼龙膜)；用150mL含16乙醇的2STE缓冲液进行洗脱弃去洗脱液，（5） 洗脱 用12ml2STE将纤维素结合的核酸洗脱下来(前2ml弃去)，剩余10ml再过1次柱，收集流下来的液体，加入2倍体积的无水乙醇和110体积的3M/L

45、的乙酸钠(pH60)溶液，-20 下过夜沉淀dsRNA。（6） 离心 4，12000rmin，离心20min， 弃上清，加入05mlSTE溶解沉淀并转移到15 ml离心管中。10000 rmin离心5 min（去除残留的纤维素），将上清转移到15 ml新离心管中，加入110体积3mo1/L NaAc(pH 52)、2倍体积无水乙醇，混匀后，-20过夜。（7） 电泳 4，10 000 rmin离心30 min，弃上清，用70乙醇洗涤沉淀2次，超净工作台上吹干，加入30 mL TE溶解沉淀，然后以平菇病毒的dsRNA作为阳性对照，采用浓度1.0的琼脂糖凝胶电泳，点样量5mL，在紫外灯下观察电泳结果

46、。（8）从凝胶中回收dsRNA 在紫外灯下切出含dsRNA谱带的琼脂糖凝胶，然后利用DNA凝胶回收试剂盒(TaKaRa公司)回收dsRNA，操作方法参照说明书。（9） 酶解41 先用 DNase处理，具体步骤为取10mL dsRNA溶液，依次加入2mL DnaseBuffer，lmL DNase，7mL双蒸水，37水浴120min；经无水乙醇沉淀之后再进行RNaseA处理。盐离子浓度为05mol/L，处理时间60min。1. 5.2差速离心法粗提病毒粒子42(1) 菌丝收集 如2.1.3.1（1）(2)匀浆 取上述菌丝10g，加适量磷酸缓冲液( pH7.0,0.1M/L含0.1巯基乙醇) ，液

47、面以刚没过菌丝为宜。4匀浆3次，每次3分钟。(3)离心，匀浆液在412000r/min离心20min去沉淀。(4)沉淀 上清液加入6%聚乙二醇和3%氯化钠，搅拌均匀后4静置1小时。(5)离心 412000r/min离心20min，收集沉淀沉淀，用上述磷酸缓冲液悬浮，412000r/min离心10min ,去沉淀。(6)上清液经30000r/min4离心2.5小时，收集沉淀，并用上述磷酸缓冲液悬浮，此即为病毒粗提液，可直接进行电镜观察或是-20保存备用。(7) 经磷酸钨负染后至透射电镜观察。1.6结果与分析1.6.1病毒的dsRNA凝胶电泳分析采用1.0浓度的琼脂糖对疑似病毒病进行凝胶电泳分析(图1)表明：除泳道3对照菌中含有四条带以外，其他八个疑似病毒病菌株中含有的dsRNA条带的大小和数量都是相同的，分别为：11kb；1.6kb; 0.9kb，我们初步推测它们可能是被同种病毒感染的。虽含有共同的dsRNA结构，但这些菌株发病症状并不一样，泳道1的菌株表现为香菇覆土后子实体长出后死亡；泳道2的菌株表现为子实体长出后出现大面积死亡；泳道4到泳道9的菌株均是由同一个菌种的不同栽培袋组织分离得