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1、复方肠泰抑制大肠癌的作用及机理初探 【毕业论文标题】 复方肠泰抑制大肠癌的作用及机理初探【英文标题】 Primary Study of Fu-Fang-Chang-Tai on the Inhibition to Colon Cancer【中文摘要】 大肠癌(Colorectal Cancer,CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。本文通过整体动物和体外细胞生物学实验,从整体动物、组织器官、细胞和分子生物学的不同水平,观察复方肠泰(FFCT)对人结肠癌细胞SW480裸鼠种植瘤的抑制作用;对人结肠癌细胞SW480细胞增殖的抑制作用,对其细胞周期、凋亡以及凋亡作用途径进行初步探索;并探索了对H
2、22荷瘤小鼠免疫功能的影响。本文的实验方法如下:通过FFCT对人结肠癌细胞SW480体外生长的影响以及裸鼠接种SW480瘤株后的体内抑瘤作用,进行体内外的抗肿瘤药效作用研究,并对FFCT的临床处方进行筛选;采用噻唑蓝(MTT)比色法测定不同浓度FFCT在不同作用时间内对体外培养的SW480细胞增殖的影响,同时应用流式细胞术检测其对细胞增殖周期及凋亡的影响;检测经不同浓度的FFCT作用后SW480结肠癌细胞内caspase-3的活性,比较经FFCT作用以及同时经FFCT和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO作用后,体外培养的人结肠癌SW480细胞凋亡的影响;检测FFCT对H22荷瘤小鼠
3、瘤重、免疫器官湿重以及溶血素抗体生成的影响。实验结果表明:“五号处方”的FFCT能够显著抑制人结肠癌细胞SW480的增殖;抑制SW480裸鼠种植瘤的瘤重,且裸鼠的体重均未见明显减轻,未见化学药常见的毒性作用。FFCT“处方五”的体内外抑瘤作用优于其它4个处方。FFTC可在G0/G1期以及G2/M期阻滞人结肠癌细胞SW480的增殖,使S期的活细胞比率降低;在一定范围内,FFCT的浓度越高、作用时间越长,对肿瘤细胞生长的抑制作用越强,凋亡率也越高。经FFCT培养液分别作用不同时间后的caspase-3酶活性,与对照组相比均有显著性变化,呈现出先增高活性,随后逐渐降低的趋势;加入caspase-3抑
4、制剂Ac-DEVD-CHO的FFCT各浓度、时间组结肠癌细胞SW480的早期凋亡率均有所增加,细胞的坏死率与晚期凋亡率的总和也有所增加,与空白组比较且呈一定的量-效、时-效关系,但是与没有加入Ac-DEVD-CHO时相比,各浓度、时间组的SW480早期凋亡率均有所下降,细胞的坏死率与晚期凋亡率的总和没有显著性变化。FFCT与抗肿瘤药物环磷酰胺(Cy)有一定的协同作用,抑制瘤重增长;能明显改善Cy化疗后H22荷瘤小鼠的脾脏、胸腺等脏器的萎缩,提高胸腺和脾脏的脏器系数,使因化疗引起的机体免疫功能低下有一定的恢复,并且能够升高H22荷瘤小鼠血清溶血素水平,使Cy所致的血清溶血素含量下降有明显恢复,从
5、而可提高H22荷瘤小鼠的体液免疫能力。本文得出如下的结论:FFCT可抑制大肠癌荷瘤裸鼠的瘤重,并可恢复和增强荷瘤小鼠的免疫力;FFCT可抑制体外培养的人结肠癌细胞SW480的增殖,其作用机理可能与阻止G0/G1期以及G2/M周期的细胞生长、促进SW480细胞凋亡相关联。实验结果还提示caspase-3途径可能是FFCT促进人结肠癌细胞SW480凋亡的重要途径之一,但可能还存在其它作用途径,有待今后作进一步的深入研究。【英文摘要】 Colorectal cancer is one of the most common cancers in both men and women.To observ
6、e the effects of Fu-Fang-Chang-Tai(FFCT) on the growth of SW480 human colon cancer xenografted in athymic mice,and on cell growth,cell generation cycle and apoptosis of human colon carcinoma cell SW480,and on the immune function of mice with carcinoma through in vivo animal experiments and in vitro
7、cell experiments.The mechanisms were explored at levels from whole animal and histological to cytobiological and molecule-biological.The methods were used as follows:The best one was sieved from several prescriptions of FFCT through the experimental effects on the growth of human colon cancer cells
8、SW480 and SW480 xenografted in athymic mice.The effects of different saturation of FFCT in different action time on cell multiplication of SW480 in vitro culture were determined with methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) chromatometry.At the same time the changes of cell generation cycle and apoptosis r
9、ate were detected with flow cytometry.Caspase-3 enzyme activities in FFCT-treated SW480 cells were determined. The comparison was made between apoptosis rates in FFCT-treated cells and Ac-DEVD-CHO with FFCT-treated cells.The effects of FFCT acting on the tumors, immune organ weight and the formation
10、 of hemolysin antibody of the mice with hepatocarcinoma H22 were studied.The results came out as follows:The growth of human colon carcinoma cell SW480 and SW480 xenografted in athymic mice could be significantly inhibited by 5th FFCT, while the body weights of the mice treated by 5th FFCT were not
11、light which compared with the control group.The effectiveness of 5th FFCT was better than other prescriptions. The generation of colon carcinoma cell SW480 in the stage of G0/G1 and G2/M could be interrupted by FFCT.To some extent,the more saturation and time of FFCT acted,the more of inhibitory act
12、ion on tumor cell growth and apoptosis rate showed.Caspase-3 enzyme activity in FFCT-treated SW480 cells increased at first and then lysised with time went compared with the control group.Both apoptosis rates and death rates in Ac-DEVD-CHO with FFCT-treated cells increased significantly compared wit
13、h the control group.Apoptosis rates in Ac-DEVD-CHO-with FFCT-treated groups were lower than in corresponding FFCT-treated groups while death rates were similar with them. There were some synergistic actions in Cyclophosphamide united with FFCT to inhibit tumor growth.It could improve the situation o
14、f organ atrophy and low formation of hemolysin antibody of the tumor-beating mice caused by chemotherapy in that organism immunity.The humoral immunity could be improved.The conclusion indicated that:Colon carcinoma could be cured by FFCT through the growth of tumor weight inhibition and the immune
15、function improvement.The growth cycle of tumer cells could be interrupted and cell apoptosis could be induced to inhibit the growth of human colon carcinoma cell SW480 on the effect of FFCT.Caspase-3 way was an important but not the only way in the process of SW480 apoptosis.【中文关键词】 复方肠泰; 裸鼠种植瘤; 人结肠
16、癌细胞SW480; 细胞周期; 细胞凋亡; Caspase-3; 荷瘤小鼠; 免疫 【英文关键词】 Fu-Fang-Chang-Tai; xenografted human colon carcinoma cell; SW480; apoptosis ; caspase-3 ; tumor-bearing mice ; immune function 【论文目录】摘要 5-7 ABSTRACT 7-8 第一章 绪论 14-32 1.1 大肠癌的机理研究 14-19 1.1.1 大肠癌的现代医学发病机理 14-16 1.1.2 中医对大肠癌病因病机的认识 16-19 1.2 中西医药对大肠癌治疗
17、的研究进展 19-23 1.2.1 现代医学研究进展 19-21 1.2.2 中医药研究进展 21-23 1.3 存在的问题与展望 23-24 1.4 本实验的相关工作 24-28 参考文献 28-32 第二章 FFCT处方筛选实验(第一批) 32-41 2.1 主要实验材料 32-34 2.1.1 实验细胞与动物 32 2.1.2 药物与试剂 32-33 2.1.3 主要仪器 33-34 2.2 实验方法 34-36 2.2.1 不同处方FFCT对SW480细胞生长的影响(MTT法) 34-35 2.2.2 FFCT各处方对人结肠癌细胞SW480裸鼠种植瘤的影响 35 2.2.3 数据分析
18、35-36 2.3 实验结果 36-39 2.3.1 不同处方FFCT稀释液对SW480细胞生长的影响 36-38 2.3.2 FFCT各处方对人结肠癌细胞SW480裸鼠种植瘤的影响 38-39 2.4 小结与讨论 39-40 参考文献 40-41 第三章 FFCT处方(第二批)筛选实验 41-48 3.1 主要实验材料 41-42 3.1.1 实验细胞与动物 41 3.1.2 药物与试剂 41-42 3.1.3 主要仪器 42 3.2 实验方法 42-43 3.2.1 不同处方FFCT稀释液对SW480细胞生长的影响(MTT法) 42 3.2.2 FFCT各处方对人结肠癌细胞SW480裸鼠种
19、植瘤的影响 42-43 3.2.3 数据分析 43 3.3 实验结果 43-46 3.3.1 不同处方FFCT稀释液对SW480细胞生长的影响 43-45 3.3.2 FFCT各处方对人结肠癌细胞SW480裸鼠种植瘤的影响 45-46 3.4 小结与讨论 46-48 第四章 FFCT抑制人结肠癌SW480细胞增殖的实验研究 48-64 4.1 主要实验材料 48-49 4.1.1 实验细胞 48 4.1.2 药物与试剂 48-49 4.1.3 主要仪器 49 4.2 实验方法 49-53 4.2.1 FFCT及阳性药的加药前处理 49-50 4.2.2 FFCT对结肠癌细胞的细胞增殖抑制作用(
20、MTT法) 50-51 4.2.3 FFCT对结肠癌细胞周期的影响 51 4.2.4 FFCT诱导结肠癌细胞凋亡的研究 51-52 4.2.5 数据分析 52-53 4.3 实验结果 53-61 4.3.1 FFCT对结肠癌细胞的细胞增殖抑制作用:采用MTT比值法 53-56 4.3.2 FFCT对结肠癌细胞周期的影响 56-59 4.3.3 FFCT诱导结肠癌细胞凋亡的研究 59-61 4.4 小结与讨论 61-63 参考文献 63-64 第五章 FFCT通过caspase-3途径促进人结肠癌细胞SW480凋亡机制的探讨 64-76 5.1 主要实验材料 64-65 5.1.1 实验细胞 6
21、4 5.1.2 药物与试剂 64-65 5.1.3 主要仪器 65 5.2 实验方法 65-69 5.2.1 FFCT及阳性药的加药前处理 65 5.2.2 Annexin V/PI法检测经FFCT作用后SW480结肠癌细胞凋亡 65-66 5.2.3 检测经FFCT作用后SW480结肠癌细胞内caspase-3的活性 66-67 5.2.4 检测经FFCT和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO共同作用后SW480结肠癌细胞内caspase-3的活性 67-68 5.2.5 Annexin V/PI法检测经FFCT和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO共同作用后SW480结
22、肠癌细胞的凋亡 68-69 5.2.6 数据分析 69 5.3 实验结果 69-75 5.3.1 Annexin V/PI法检测经FFCT作用后SW480结肠癌细胞凋亡 69 5.3.2 检测经FFCT作用后SW480结肠癌细胞内caspase-3的活性 69-71 5.3.3 检测经FFCT和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO共同作用后SW480结肠癌细胞内caspase-3的活性 71-72 5.3.4 Annexin V/PI法检测经FFCT和caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO共同作用后SW480结肠癌细胞的凋亡 72-75 5.4 小结与讨论 75-76 第六章
23、 FFCT对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响 76-83 6.1 主要实验材料 76-77 6.1.1 实验动物 76 6.1.2 药物与试剂 76 6.1.3 主要仪器 76-77 6.2 实验方法 77-78 6.2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 77 6.2.2 小鼠的分组及给药 77 6.2.3 小鼠的处理及免疫指标的计算 77-78 6.2.4 数据分析 78 6.3 实验结果 78-80 6.3.1 FFCT对H22荷瘤小鼠瘤重和免疫器官湿重的影响 78-79 6.3.2 FFCT对H22荷瘤小鼠溶血素抗体生成的影响 79-80 6.4 小结与讨论 80-82 参考文献 82-83 第七章 总结与展望 83-85 7.1 主要结论 83-84 7.2 展望 84-85 附图 85-96 致谢 96-97 攻读硕士学位期间发表的论文 97 作者简介 97