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1、青岛农业大学毕业论文 题 目：猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒 污染情况的检测与分析 姓 名： 南76767 学 院： 动物科技学院 专 业： 动物医学专业 班 级： 1003 学 号： 20103637 指导教师： 韩先杰 2014年5月21日目录中文摘要 IAbstractII引言21 材料与方法21.1 试验材料21.1.1 试验疫苗21.1.2 试验试剂21.1.3 试验主要仪器设21.2 试验方法31.2.1 RNA的提取31.2.2 RT-PCR检测BVDV31.2.3 巢式PCR扩增41.2.4 琼脂糖凝胶电泳41.2.5 胶回收提纯41.2.6 回收产物连接51.2.7 转化
2、反应51.2.8 阳性克隆筛选61.3 序列分析62 结果与分析72.1 PCR扩增结果72.1.1 巢式PCR扩增结果72.1.2菌液PCR结果82.2 测序结果92.3序列分析112.3.1进化树分析112.3.2同源性比较123 讨论133.1 检测方法133.2 BVDV的污染情况133.3 控制疫苗中的BVDV污染措施143.3.1 预防免疫143.3.2 注意制作工艺143.3.3 国家加强对疫苗的监控与净化144 小结14致谢15参考文献16 猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染情况的检测与分析动物医学专业 南福龙 指导教师 韩先杰摘要：为调查我国商品化猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒
3、性腹泻病毒污染情况，本文采集179份蓝耳病疫苗和105份猪瘟活疫苗，用RT-PCR方法检测疫苗中的牛病毒性腹泻病毒，评估疫苗污染牛病毒性腹泻病毒的情况。结果表明，蓝耳病疫苗中检出6份阳性样品，总污染率为3.6%；猪瘟疫苗中检出3份阳性样品，总污染率2.9%，造成污染的病毒均为牛病毒性腹泻病毒1型。关键词：牛病毒性腹泻病毒；PCR；猪瘟；猪蓝耳病；疫苗IDetection and Analysis of Bovine Viral Diarrhea Virus Pollution in Classical Swine Fever and Porcine Reproductive and Respi
4、ratory Syndrome VaccinesStudent majoring in Animal Medicine Nan Fulong Tutor Han XianjieAbstract: To investigate the contamination situation of BVDV, 105 CSF vaccine samples and 179 PRRS vaccine samples were collected. Then, RT-PCR was applied to detect BVDV and evaluate the condition of pollution i
5、n vaccines. The results showed 6 of the 179 PRRS vaccine samples were BVDV positive and the contamination rate was 3.6%. At the same time, 3 of the 105 CSF vaccine samples were BVDV positive and the contamination rate was 2.9%. All the detected BVDV were identified as BVDV type 1.Key words: Bovine V
6、iral Diarrhea Virus; PCR; Classical Swine Fever; Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; Vaccine18目前，我国猪群重大疫病的防控主要依赖疫苗免疫，如猪瘟、蓝耳病等。弱毒疫苗具有可诱导体液和细胞双重免疫、只接种一次即可起到良好的预防效果、持续时间长、不需佐剂等优点，猪群疫病商品化疫苗以弱毒疫苗为主。但是，弱毒疫苗的使用可能导致如下问题：易受外源病毒污染、发生交叉感染、有毒力残留等。我国猪用弱毒疫苗中，屡有外源病毒污染情况，常见污染源为支原体和牛病毒性腹泻病毒，上述污染物导致疫苗使用效价降
7、低，不仅起不到预防和控制传染病的功效，严重时甚至造成疾病的传播。牛病毒性腹泻病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）与猪瘟病毒(classical Swine fever virus，CSFV) 相似，都属于黄病毒科瘟病毒属。BVDV可分为1型和2型，1型又可分为1a和1b亚型，都会引起牛病毒性腹泻病，但不同毒株间致病性差异性较大1。牛病毒性腹泻病毒自首次被报道以来，在全世界很多畜牧业发达国家中流行2，如：澳大利亚、德国等国家猪群中BVDV抗体阳性率达3-40%，荷兰达15-20%3，我国范学政等人对2008年从10个生物制品厂23个批次的疫苗抽检样品进行检测，
8、检测结果为牛病毒性腹泻病毒的污染率为21.74%4。各种年龄的牛都可感染牛病毒性腹泻，以幼龄牛易感性最高，在垂直传播后，会产生病毒血症。以含BVDV的血清作为原料时，就会污染制备的生物制品5。猪瘟细胞苗生产过程中会使用到牛睾丸细胞以及牛血清6；蓝耳病疫苗（尤其是弱毒疫苗）生产工艺中在传代细胞培养中会使用到牛血清，如果血清材料含有BVDV病原或抗体，会使猪瘟细胞苗和蓝耳病疫苗污染。疫苗被BVDV污染后，会对其免疫效果产生干扰。BVDV抑制疫苗抗体的产生，同时刺激机体产生大量针对BVDV的抗体，导致疫苗免疫失败，表现为被接种动物体内存在较高水平抗体却依然会爆发传染病，其多数为BVDV抗体7。此外，
9、猪在接种了受污染的疫苗后也可能感染BVDV，产生类似于猪瘟的临床症状和病理变化，王新平等8从疑似猪瘟病料中检出了BVDV。近年，我国发现猪场出现不明原因的猪瘟和蓝耳病免疫失败现象，可能原因是疫苗受BVDV污染，导致免疫失效，母猪感染后还会出现交配困难、不孕、流产等现象9。若不能及时监测出疫苗中BVDV污染情况，会造成重大经济损失甚至传染病的流行。因此，对猪瘟和蓝耳病疫苗受BVDV污染情况的监测与分析十分有必要。目前，可用于检测疫苗中BVDV病原的方法主要有：牛肾细胞直接病变、免疫荧光技术（indirect immunofluorescence, IFA）、酶联免疫吸附试验（enzyme-lin
10、ked immunoadsorbent assay, ELISA）、病毒中和试验（Virus neutralization test, VNT）、琼脂扩散试验、RT-PCR等10。BVDV与CSFV基因组核苷酸同源性可达60%，氨基酸同源性可达85%11，血清学上可出现交叉反应12。污染BVDV的CSFV疫苗免疫后，采用血清学方法无法准确区分血清抗体是由BVDV感染产生的还是由CSFV弱毒疫苗产生的。近年，分子生物学技术广泛应用于BVDV的病原诊断，具有敏感、特异、快速、灵活、操作简便的特点，并可用于各种组织、全血等样品检测。因此，本文拟采用RT-PCR方法对CSFV和PRRS弱毒疫苗污染BV
11、DV情况进行检测与分析，对指导畜牧业生产中科学使用疫苗有重要的指导意义。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 试验疫苗由中国动物卫生与流行病学中心从全国各地猪场收集其使用的猪瘟细胞苗和蓝耳病弱毒疫苗，进行初检，选取怀疑为阳性的疫苗作为本试验用样品。1.1.2 试验试剂RNA提取试剂（如：Trizol、冷氯仿、异丙醇、75%酒精、DEPC处理水等）、引物、感受态细胞、AMP、IPTG、X-gal等由中国动物卫生与流行病学中心提供，One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（一步RT-PCR试剂盒）、Ex-Taq酶（MIX）、DNA Marker2000、pGEM
12、-T easy Vector购自Promega公司，胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，Quick Ligation Kit、连接酶Buffer购自New EnglandBiolabs公司，DURED染料购自泛博生物化学有限公司。1.1.3 试验主要仪器设Sigma 3-18离心机购自Sigma公司、BSC 1300-II-B2生物安全柜购自新华医疗器械股份有限公司、LS-P96G PCR仪购自Labserv公司、DYY-i2电泳仪购自北京六一仪器厂、Bio-Rad凝胶成像仪购自Bio-Rad公司、BG-gds VIEW可见紫外分析仪购自北京百晶生物技术有限公司、细胞温箱购自上海福玛实验设备有限
13、公司、SDC-6恒温槽购自宁波新芝生物科技公司、HZQ-C空气浴振荡器购自东联电子技术开发有限公司。1.2 试验方法1.2.1 RNA的提取(1) 取疫苗250 uL加入无RNA酶的EP管中，加入750 uL Trizol混匀，后室温放置5 min，间或震荡。(2) 加入-20保存的冷氯仿250 uL剧烈震荡混匀后置于4冰箱10 min。(3) 置于离心机中以12000 r/min，4离心15 min。(4) 取500 uL上清（宁可少也不要取到沉淀物）于EP管中，加等量（500 uL）异丙醇，轻轻颠倒混匀，于-80冰柜沉淀30 min。(5) 将液体以12000 r/min，4离心10 mi
14、n。(6) 弃去异丙醇，加入75%酒精1000 uL，混匀，于4冰箱静置5 min。(7) 将液体以12000 r/min，4离心5 min。(8) 弃去酒精，晾干后用30 uL DEPC处理水溶解，于-20冰柜保存。1.2.2 RT-PCR检测BVDVNCBI网站GenBank给出6对供参考的BVDV扩增引物序列，经过试验研究，套式引物效果最好14因此本试验选用套式引物，对NS5B基因序列进行扩增，其中的引物为P1、P2、P3、P4。P1：10485-10583 5-ATCTTTCACACATAGCCCAAC-3 P2：11244-11264 5-GAAGCCATCATCCCCACGACG-
15、3提取出来的RNA用P1、P2引物于PCR仪中进行一步RT-PCR，反应体系如表1。表1 RT-PCR的反应体系试剂 用量(uL)Primescript RT Enzyme MIX1.02X One Step SYBR RT-PCR Buffer12.5F(P1)R(P2)ddH2ORNA0.50.57.53.0反应程序为50反应30 min，94反应2 min，94变性30 s，55退火30 s，72延伸1 min，此三步为30个循环，后72反应10 min，最后4保存。1.2.3 巢式PCR扩增P3：10477-10498 5-TGGAGATCTTTCACACAATAGC-3P4：1081
16、5-10836 5-GCTGTTTCACCCAGTTATACAT-3用RT-PCR的产物为模板，利用引物P3、P4进行巢式 PCR扩增，反应体系如表2。表2 巢式PCR扩增试剂用量（uL）Ex-Taq酶（MIX） 12.5F(P3)0.5R(P4)ddH2ODNA0.510.51.0反应程序为94反应3 min，94变性30 s，55退火30 s，72延伸1 min， 此3步为33个循环，后72反应10 min，最后4保存。1.2.4 琼脂糖凝胶电泳(1) 在管中加好琼脂糖至标度。(2) 将固体琼脂糖加至锥形瓶，加缓冲液（1:100）。(3) 在瓶口套上一次性手套在微波炉中加热3 min。(4
17、) 取电泳板并在上面加上玻璃板，再插上梳子。(5) 取出锥形瓶加染色剂5 uL（染色剂不稳定，加热之后再加防止分解）。(6) 将琼脂倒入玻璃板上至半个梳子高度（不要倒出气泡），静置15-20 min。(7) 加DNAmarker 2000 5 uL加入第一个或中间的孔。(8) 将扩增产物取5 uL加入平板孔中。(9) 将玻璃平板取出放入电泳池，对齐放平，盖好盖，调至130 V，130 mA启动，电泳30 min。(10) 将胶取出孔朝上放入凝胶成像仪中，先开白光调整位置，后打开紫外光先自动曝光，等到一个合适的亮度后手动曝光，保存。1.2.5 胶回收提纯将凝胶成像仪中呈现较亮的360 bp左右的
18、片段的PCR未纯化产物送上海生工公司测序，有3个样品测序失败，需进行目的DNA的克隆转化。(1) 进行电泳后在凝胶成像仪中找到目的片段。(2) 在切割仪中垫上一个一次性手套，放上凝胶，打开紫外灯，尽可能小的切下目的条带并分装到EP管中，并在天平中进行称重。(3) 使用QIAGEN公司的胶回收试剂盒，按重量的3倍体积加入Buffer QG。(4) 将EP管装在漂浮板上在水浴温箱中50水浴加热10 min左右，直至凝胶完全溶解。(5) 将液体移入涡旋管中，12000 r/min，22离心1 min，弃掉滤液。(6) 加入750 uL Buffer PE洗液12000 r/min，22离心1 min
19、，弃掉滤液。(7) 开着盖12000 r/min，22离心1min，换一个EP管。(8) 加Buffer EB洗脱液40 uL，室温静置10 min，待充分反应后12000 r/min，22离心1 min，弃掉涡旋管，保留EP管中液体。1.2.6 回收产物连接 在冰水中融化Vector与Quick Ligation Kit，将回收的DNA片段与pGEM-T easy Vector连接，163 h后4过夜，连接体系如表3。表3连接体系试剂用量(uL)Vector0.5DNA2.5Quick Ligation KitBuffer0.53.51.2.7 转化反应 (1) 将-70中冷藏的DH5感受态
20、细胞取出放入冰水中融化。 (2) 将连接体系移进感受态细胞中，再将感受态细胞冰浴20 min（充分吸附）。 (3) 42热水浴90 s（热击，打开离子通道）。 (4) 冰浴2 min（关闭通道）。 (5) 加未加氨苄的LB培养基至总体积1 mL。 (6) 将EP管放入摇床中，37，180 r/min培养1 h。 (7) 将EP管于12000 r/min，22离心2 min后弃去上清，只保留300 uL沉淀液。 (8) 用移液枪反复吹打沉淀至混合均匀后每300 uL菌液加入Amp 300 uL、IPTG 60 uL、X-gal 60 uL，混合均匀。 (9) 每个LB固体培养基加入120 uL混
21、合液后，每个EP管可使用6个LB固体培养基，用涂布棒将菌液涂均匀后晾干。 (10) 待LB固体培养基干燥后放入培养箱中37培养12 h。1.2.8 阳性克隆筛选 (1) 将培养过后的LB固体培养平板取出，对光观察，选取单个白色大型菌落，蓝色不予考虑。 (2) 用接种针将菌落接至装有2 mL氨苄LB培养液的细菌培养管中。 (3) 将细菌培养管于摇床中摇振培养12 h。 (4) 用P3、P4引物进行菌液PCR扩增，反应体系与程序如表3于表4（变性温度改为95）。 (5) 将扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。 (6) 对电泳结果进行分析，选取出现360 bp左右明亮带的菌液加甘油（保存）并用封口条
22、封口送上海生工去测序。1.3 序列分析将测序后的序列对照ABI峰图进行修正，再使用NCBI网站上的Nucleotide Blast功能，将修改后的序列在其中比对，找到相近参考序列后到Genbank查看详细资料，相近参考序列如表4，NS5B标准株序列如表5，外参毒株如表6。表4 相近参考序列Genbank基因型来源AB078950AF078535AF268278AJ781045HQ174294 JN380088 JX297517JX419397KC695814KF835698M31182M96687U634791ncp111-NADL1b1b1b11b1b1-NADL1-Osloss1-CP7J
23、apanNew YorkUSABelgiumUSAUSACanadaJapanUSAUSAUSAUSAGermany表5 NS5B标准株Genbank基因型来源AB567658AF526381DQ088995JF714967JN704144NC_001461211-Singer_Arg21b1-NADLJapanChinaArgentinaChinaChinaUSA表6 外参考毒株Genbank基因型来源HCLV-AF091507C株China2 结果与分析2.1 PCR扩增结果2.1.1 巢式PCR扩增结果360 bp200 bp500 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
24、12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24以疫苗提取的RNA为模板，采用P1、P2引物进行RT-PCR的产物再以P3、P引物巢式PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳，发现31个初检后怀疑阳性的结果中出现9个阳性（16号、17号、18号、19号、20号、21号为蓝耳病疫苗，26号、27号、30号为猪瘟疫苗），送生工公司进行测序。图1 BVDV 巢式扩增结果（1-24号）200 bp360 bp500 bp M 25 26 27 28 29 30 31图2 BVDV 巢式扩增结果（25-31号）2.1.2菌液PCR结果500 bp360 bp200 bp M 17
25、 18 19送去测序的样品中由于17号、18号、19号（蓝耳病样品）测序失败，30号样品不合格，对这几个样本进行目的DNA的克隆转化，30号样品无法正常长出菌落，只能对17号、18号、19号进行摇菌培养，并用P3、P4引物对其进行菌液PCR检测，结果如图3。 图3菌液PCR检测结果（17号、18号、19号）2.2 测序结果测序结果中17号序列偏差过大不予采用，其他已修改结果如图：图4 BVDV-16号序列图5 BVDV-18号序列图6 BVDV-19号序列图7 BVDV-20号序列图8 BVDV-21号序列图9 BVDV-26号序列图10 BVDV-27号序列2.3序列分析2.3.1 进化树分
26、析使用MEGA6软件中的Construct/Test Neighbor-Joining Tree功能制作出进化树。结果可以看出，BVDV可以分为两个进化分支BVDV 1和2型，其中BVDV 1型又可以分为1a和1b两个亚型。本文检测到的BVDV中，BVDV-16，-20，-21等三株属于BVDV 1b亚型，而BVDV-18，19，26，27等毒株均属于BVDV 1a亚型，这说明检测到的BVDV既有1a亚型，也有1b亚型。（详见图11）。图11 BVDV各毒株的同源进化树2.3.2 同源性比较使用DNAStar软件中的MegAlign软件，制作同源性图。根据同源性比较可见，不同BVDV毒株之间的
27、同源性比较低，彼此之间相差较大，同源性的分布为68.6%-100%。在比较的这些BVDV毒株中，同源性最高的为M31182和NC_001461毒株，为100%，同源性最低的为BVDV 2型的毒株AB567658和1型毒株KF772785，只有68.6%。本文检测到的BVDV之间的同源性为80.5%-98.2%，其中，BVDV-18和BVDV-26毒株之间的同源性最高，为98.2%，BVDV-18和BVDV-16毒株之间的同源性最低，仅为80.5%（详见图12）。图12 BVDV各毒株的同源性比较结果3 讨论3.1 检测方法很多BVDV毒株在细胞上难以产生明显的细胞病变，因此，PCR等分子生物学
28、检测就成为最常用的BVDV检测方法。考虑到BVDV与CSFV和BDV均属于黄病毒属，三者在基因组上的同源性较高，常规的PCR扩增容易因交叉反应而产生假阳性结果，为保证检测结果的准确性和特异性，本文在试验前首先对国、内外PCR检测方法进行了筛选比较，确定采用NS5B区的一段保守序列进行扩增的套式引物，该引物可以有效区分BVDV和CSFV，同时具有较高的灵敏度。即便如此，为精确分析BVDV巢式PCR扩增结果，本试验继续对BVDV巢式PCR的扩增产物进行测序，在试验中发现，有些样品会出现扩增后产物浓度不够或者非特异性条带等原因造成的无法测序，使检测无法顺利完成。此时，便需要对PCR产物进行克隆，使低
29、浓度的DNA高效大量并且准确地扩增，从而实现测序分析。试验过程中，本试验对相关技术进行了优化，使克隆更加有效，具体措施包括：(1) 采用pGEM-T easy载体和快速连接酶，使得在连接反应时能够缩短连接所需时间，提高连接的效率；(2) 在进行平板培养时每300uL菌液加入Amp 300 uL，IPTG 60 uL，X-gal 60 uL使培养后的平板能长出蓝白斑，选取白斑，筛去假阳性蓝斑，能够更有效的进行摇菌培养，并进行测序；(3) 在进行菌液PCR时，提高变性温度，方便细菌的裂解，提高DNA扩增的效率。3.2 BVDV的污染情况近年来，我国不断有BVDV感染猪群并被分离鉴定的报道，BVDV
30、在猪群中的流行不容忽视。戴益民15等对2004-2007年江西省部分地区已经检测为CSFV的52份病料进行BVDV回归性检测，结果BVDV的阳性率分别为100%（2004年）、14.3%（2005年）、12.5%（2006年）和15.8%（2007年）。本试验的结果为蓝耳病疫苗污染率为3.6%，猪瘟疫苗污染率为2.9%，污染我国CSF和PRRS疫苗的BVDV毒株主要是1型中的1a、1b亚型，各毒株间同源性在80.5%-98.2%。这一结果与目前我国流行的BVDV基因型一致，这很可能意味着疫苗是BVDV广泛存在的主要传播方式。本试验为我国疫苗病毒污染情况监测提供了依据，也为解决我国疫苗污染何种类
31、型病毒会导致免疫失败、是否会造成接种后猪感染牛病毒性腹泻等问题提供了参考，同时也为今后猪病疫苗的生产及净化提供了宝贵资料。3.3 控制疫苗中的BVDV污染措施3.3.1 加强牛场的BVDV疫苗预防免疫 加强对牛场的管理，按时接种BVDV疫苗，使牛场牛病毒性腹泻病能够得到控制，并加强对牛场BVDV的监测，避免牛感染BVDV，而对检测出感染了牛病毒性腹泻的牛及时进行治疗，保证作为制作疫苗原材料的牛细胞或血清中不含BVDV。3.3.2 强化疫苗制作工艺改进疫苗的制作工艺，工作人员严谨工作，防止产生失误，并使用传代细胞来替换原代细胞16，避免出现疫苗制作过程中人为污染BVDV的情况，同时加强使用原材料
32、的管理，注意原材料的检测，通过预检测保证疫苗使用的原材料不含BVDV才能使用，对生产出来的疫苗进行抽样检测，保证疫苗的可靠性。3.3.3 加强疫苗监管 国家应当进一步加强对疫苗的监测和监管，相关职能部门应该定期对市场销售的疫苗进行采集与检测，掌握疫苗市场与生产厂家的情况，通报疫苗污染的情况，加大对污染疫苗的惩治力度，杜绝污染疫苗的销售和使用。4 小结本试验通过RT-PCR方法，从22份蓝耳病疫苗中检测出6份BVDV阳性样品，179份样品总污染率为3.6%；9份猪瘟疫苗中检测出阳性样品3份BVDV阳性样品，105份样品总污染率2.9%。污染我国CSF和PRRS疫苗的BVDV为BVDV 1型，获得
33、的BVDV各毒株间同源性在80.5%-98.2%，此试验结果为我国猪病疫苗中外源病毒污染情况的监测提供了依据。致谢感谢青岛农业大学的韩先杰老师，为本人提供多方面的帮助与支持以及对本人的论文进行修改与指导。感谢动卫中心畜病监测室主任李晓成和张志老师为我提供试验机会与环境；和对本文所做试验进行的指导；感谢动卫中心诊断液中心的南文龙博士，对本文的帮助和修改。最后感谢所有为我提供过帮助的老师与学长学姐，感谢在论文上对我进行过修改的老师，更感谢你们对我的关心与耐心。参考文献1 毛晓娜,繆芬芳,季伟.牛病毒性腹泻病毒在猪瘟疫苗中的污染情况及检测方法的研究进展J.中国畜牧兽医,2013,2:175-178.
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