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1、曲 靖 师 范 学 院 本科本科毕业论毕业论文文 论论文文题题目目:高速公路铅耐受菌株的筛选高速公路铅耐受菌株的筛选 作作 者：者： 徐徐刚刚 学号：学号： 2008133236 院院 系：系：生物生物资资源与源与环环境科学学院境科学学院 年年级级： ： 2008 级级 学学 科：科： 理学理学 专业专业： ： 生物科学生物科学 指指导导教教师师： ： 王俊杰王俊杰 职职称：称： 副教授副教授 完成完成时间时间： ： 2012 年年 5 月月 20 日日 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院曲靖师范学院生物资源与环境科学学院 曲靖师范学院 本论文（设计）经答辩小组全体成员审查，确认符合曲靖师 范

2、学院本科(学士学位)毕业论文（设计）质量要求。 答辩小组签名 姓 名工 作 单 位职 称主 席 成 员 答辩日期： 3 原创性声明 本人声明：所呈交的论文（设计）是本人在指导教师指导下进行的研 究工作成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文（设计）中不 包含其他人已发表或撰写过的研究成果。参与同一工作的其他同志对本研 究所作的任何贡献已在论文（设计）中作了明确的说明并表示了谢意。 签名： 日期： 。 论文（设计）使用授权说明 本论文（设计）作者完全了解曲靖师范学院有关保留、使用毕业(学位)论 文（设计）的规定，即学校有权保留论文（设计）及送交论文（设计）复 印件，允许论文（设计）被查阅和

3、借阅；学校可以公布论文（设计）的全 部或部分内容。 签名： 指导教师签名： 日期： 。 高速公路附近铅耐受菌株的筛选 摘要 本实验从昆曲高速周边采集土壤，稀释浓度后，通过设置 Pb2+浓度梯度采用涂布 法进行筛选，从菌落生长旺盛的筛选培养基中挑取单菌落采用划线分离法进一步分离 纯化，得到一株耐铅菌株。将该菌株接种于更高 Pb2+浓度梯度的筛选培养基中，确定 其最高耐铅浓度。对筛选菌株形成的菌落进行外部形态观察，并对其菌体进行简单染 色后镜检，从而得到其菌落/菌体形态。通过分析结果可得：该菌株最高耐受 Pb2+的浓 度为 700mg/L；菌落形态不规则，呈乳白色，表面湿润，简单染色后的菌体呈紫色

4、， 杆状。 关键词 耐铅菌株 筛选 铅耐受性 5 Highway near the lead tolerate isolation of strains Abstract In this study, soil collected from the Kunqu high-speed peripherals, dilution, filter by setting the gradient of the concentration of Pb2 + using the coating method, single colonies were picked from colonies growin

5、g in the filter medium crossed separation is furtherpurified to obtain aresistance to lead strain. Inoculated with the strain at higher Pb2 + concentration gradient in the filter medium, to determine the highest concentration of lead resistance. External morphology, colony formation on the screening

6、 strain and its bacterial simple staining, microscopy, colony / cell morphology. Available through the results of the analysis: the maximum tolerance of this strain of Pb2+ concentration was 700mg / L; irregular colony morphology, milky white, surface moist, bacteria stained purple, rod-shaped. Key

7、words Resistance to lead strains Filter Lead to lerance 目 录 1 引言.1 1.1 铅污染治理的传统方法.1 1.1.1 物理吸附法1 1.1.2 沉淀法10.2 1.2 新兴的治理方法生物吸附法112 1.3 以微生物作为吸附材料的国内外研究.2 1.3.1 微生物去除重金属离子的原理和过程3 1.3.2 影响微生物去除重金属离子的因素3 1.4 研究目的及意义.5 2 材料与方法.5 2.1 实验材料.5 2.1.1 对照菌株5 2.1.2 供试菌株5 2.1.2 培养基5 2.1.3 试剂6 2.1.4 仪器6 2.2 实验方法.

8、6 2.2.1 采样6 2.2.2 筛选6 2.2.3 纯化.6 2.2.4 菌株对 Pb2+的耐受性试验 6 2.2.5 筛选菌株的镜检实验7 2.2.6 生长曲线的测定7 3 实验结果7 3.1 涂布分离结果.7 3.2 菌株对 PB2+的耐受性试验结果 8 3.3 纯化和镜检结果9 3.4 PB2+耐受性菌株生长曲线9 4 讨论与分析10 5 结论11 6 不足与展望11 6.1 不足.11 6.2 展望.11 参考文献12 致 谢14 徐刚：高速公路附近铅耐受菌株的筛选 1 1 引言 随着环境污染的加剧，据相关国外研究表明人均从空气、水和食物中吸收大约 20 至 50 微克的铅。铅是一

9、种严重的环境毒和神经毒。六十年代以后，人们发现即使是微 量的铅也能影响婴幼儿和儿童的智力发育和神经行为。铅的主要污染源是蓄电池、冶 炼、五金、机械、涂料和电镀工业等排放的废水，铅是我国实施排放总量控制的指标 之一。我国公路建设经过 20 多年的快速发展，到 2002 年底通车总里程已达到 160 万 km。同时，机动车的保有量已达 2000 万辆，其中汽油车占汽车总量的 90%以上1，每 年消耗的汽油近 4000 万吨2.为提高汽油的抗爆震性，作为添加剂的四乙基铅长期在汽 油中得到使用，所以机动车尾气排出的含铅颗粒物成为危害严重的污染源之一3。我国 从 2000 年起全面停止含铅汽油的使用，因

10、此大大降低了汽车尾气中的铅含量，但“无 铅汽油”的推广使用并不是汽油中没有铅，其对环境的影响程度还有待时间来证明。重 要的是铅在土壤中的积累已经比较明显，并且铅不可以经过自然降解而得到消除，相 反土壤中的铅会随着环境要素的流动和食物链的转化而影响人体健康，土壤的铅污染 问题必须得到有效解决。 1.1 铅污染治理的传统方法 含重金属废水的处理方法主要有离子交换法、不溶性络合物法、电解法、反渗透 法、气浮法、沉淀法、吸附法4酸性溶液洗涤法5等。 1.1.1 物理吸附法 竹炭是一种多孔性物质，具有较大的比表面积，因而具有强吸附性。竹炭作为一 种新型材料，在对重金属离子的吸附的环境保护等领域具有广泛的

11、应用前景6-7。以竹 炭作吸附剂成为一种有效的从废水中除去重金属的节俭的吸附剂。具体操作8-9是在醋 酸钠-醋酸体系（最佳吸附酸度 PH=3.26.2）中，在一定浓度、一定体积的铅溶液中， 吸附剂投放量越大，比吸附量越小，但总的去除率越大。在吸附剂量一定和一定体积 的溶液中，吸附质浓度越大，比吸附量越大。吸附剂的颗粒越小，比吸附量越大，吸 附平衡时间约为 180min。用水+微波加热方法洗脱再生，再生吸附能力可恢复到 96% 以上。在 T=98k 和 T=308k 时，竹炭对铅的等温吸附服从 Freundlich 吸附等温方程式， 在较低温度下吸附较容易进行。 曲靖师范学院生物资源与环境科学学

12、院 2012 届本科毕业论文 2 1.1.2 沉淀法10 废水引入储水调节池，初步对废水的水量进行调节，然后泵至 pH 调节反应罐，用 硫酸将 pH 调到偏酸性（pH=2.6-3） ，使可能存在的表面活性剂及整合物等有机物凝集。 同时加入 FeCl3，然后进入化学反应罐，加入 NaOH，调节 pH 在 8.6-8.8，进行搅拌使 之迅速生成金属氢氧化合物沉淀。 反应后，污水流经絮凝反应堆，在此加入高分子助凝剂 PAM，继续搅拌使絮体变 大，在斜板沉淀池沉淀，上清液经快速砂滤器进一步截流未沉淀的 SS，滤后水经选择 性阳离子交换柱进一步去除残余重金属离子。出水至 pH 调整池将 pH 微调至中性

13、后达 到排放标准。沉淀池污泥定期送至污泥浓缩池，再经板框压滤机压滤脱水后外运无害 化处理。污泥浓缩池上清液出水和压滤水（脱水）返回到储水调节池。当离子交换树 脂柱饱后，用 10%盐酸对树脂进行再生，再生的酸性液送往储水调节池与原度水混合 处理（纯水制造树脂再生时产生的盐酸废水也一起处理） ，可节省 pH 调节反应堆的加 酸量。 虽然这些方法也能达到一定的净化效果，但因过程繁琐并易造成二次污染而不够 理想，尤其是当金属离子浓度较低时，往往操作费用和原料成本过高使应用受到限制。 1.2 新兴的治理方法生物吸附法11 近年来，一种新兴的技术生物吸附法去除工业废水中重金属离子技术，以其 价廉、节能和吸

14、附效率高等优点而为人们所关注。生物材料与离子的结合作用叫作生 物吸附。研究表明，一些生物材料能在含有较高浓度有毒金属的溶液中生长，并能进 行生物浓缩。生物体内的主要配体有蛋白质、多肽、核酸、多糖和脂类等生物大分子， 具有较大的表面积和粘性，带有一定的负电荷，能提供许多可与金属离子相结合的活 性集团，如羧基、氨基、羟基、酰胺基等配体12。 国内外有关生物吸附重金属离子的研究报道很多 ，所涉及的生物材料从原核生物 中的细菌、放线菌，真核微生物中的酵母菌、霉菌，到蛋壳膜、植物材料13-15。 1.3 以微生物作为吸附材料的国内外研究 应用微生物去除工业废水中的重金属离子或者回收、利用这些重金属离子具

15、有广 阔的应用景。近些年来有关利用微生物去除水溶液中的重金属离子在国外已有很多报 徐刚：高速公路附近铅耐受菌株的筛选 3 道16。与传统方法相比，该方法具有原材料来源丰富、操作成本低、去除速度快、去 除量大等优点，受到越来越多的重视，对许多微生物例如少根根霉（Rhizopus arrhizus）17，黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）22等去除重金属离子的 性质已有了广泛的研究。 1.3.1 微生物去除重金属离子的原理和过程 微生物可以去除水溶液中的重金属离子，其主要原因是微生物细胞能够将溶液中 的重金属离子吸附到细胞表面，然后通过细胞膜将重金属离子运输到

16、细胞体中”积累” 起来18，这样就可以达到对重金属离子的去除效果。AnoopK19通过实验证明:微生物 细胞壁化学功能团(氨基、羧基、磷酸基等)对重金属离子具有吸附作用，能将溶液中的 重金属离子吸附到细胞表面。重金属离子进入生物细胞内的过程是通过细胞运输来完 成的，重金属离子在生物体内的运输有多种方式:(l)通过细胞的多孔结构，重金属离子 从高浓度的溶液中扩散到低浓度细胞中，这种运输方式不依赖于生物细胞的代谢活动， 称之为“生物去除”或“被动运输”20，这是一种非定向性的运输方式，它可以运输重金 属离子、核酸、与细胞生理代谢有关的各种物质。(2)重金属离子也可以在细胞的生理 代谢过程中，通过细

17、胞膜运输到细胞体中。这种运输方式被称为是“主动运输”。 “被动 运输”和“主动运输”都可以被称为是“重金属离子在生物体内的积累”。Gadd 等21人通 过实验证明:当水溶液中重金属离子浓度较高时，微生物细胞对重金属离子的运输方式 主要是“被动运输”。Yetis22 等人通过实验证实了微生物对重金属离子的去除过程分两 个阶段进行:第一个阶段是溶液中的重金属离子与微生物细胞壁的功能基团 (COOH、NHZ、=NH、SH、OH)的结合过程，该过程反应迅速，所需时间较 短；第二个阶段则是与功能基团所结合的重金属离子在细胞膜内的扩散过程，该过程 反应较慢，所需时间较长。 1.3.2 影响微生物去除重金属

18、离子的因素 在微生物对重金属离子的去除过程中，有很多因素对去除过程起着制约作用，主 要表现在以下几个方面。 1.溶液的 pH 值 早期研究表明23:溶液 pH 值的变化会直接影响重金属离子在水溶液中的溶解程度 和微生物细胞壁功能基团(COOH、NHZ、=NH、SH、OH)的解离程度，从而影 响了微生物对金属的去除作用。Anoop K19等人通过实验证明:当溶液的 pH 值较低时， 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院 2012 届本科毕业论文 4 微生物对重金属离子的去除受到抑制，这可能是低 pH 条件下，溶液中含有的大量 H+，与金属离子竞争细胞壁功能基团，从而影响了微生物对重金属离子的去除效

19、果;当 溶液的 pH 值升高时，由于去质子化作用，细胞表面的负电荷密度增加，故对重金属 离子的去除能力增加。吴涓24利用 phanerochaete chrysosporium 对 Pb2+、Zn2+、Cu2+ 进行去除研究表明:在同一条件下，phanorochaete chrysosporium 对不同的重金属离子 的去除能力不同，这可能是不同的重金属离子具有不同的物理和化学性质;Roux25等人 经过实验表明:微生物在除重金属离子时都有一个最适 pH 值。 2.离子浓度 离子浓度是影响微生物对重金属离子去除作用的一个重要因素。一般说来，微生 物对重金属离子的去除速度随着重金属离子浓度的增加

20、而增加，浓度越大，去除的初 速度越大，但其去除率较低;浓度越低，去除的初速度较小，但去除率较高。Anoop19 等人利用曲霉菌 Aspergillus niger:去除 Cd2+、Pb2+、Cu2+ 时发现:Aspergillus niger 对 单一重金属离子的去除能力大于其同时对两种或三种重金属离子。 3.生物去除剂的预处理 生物去除剂的预处理是指在去除重金属离子之前对微生物进行物理或化学的处理 (如对细胞进行干燥处理，用强碱、强酸溶液浸泡微生物细胞26,27等)，预处理可提高微 生物对重金属离子的去除能力和生物去除剂的稳定性，这对于我们发展生物去除剂具 有重大的实用意义。AnoopK19

21、利用 0.lmol/L NaoH 浸泡 Aspergillus niger:15min，并 用此除去废水溶液中的 Pb2+:浸泡后的 Durvillaea potatorum 的去除能力可达 2.26mg/g(干菌丝)，比未处理高出 255%，且可以重复使用 5 次。碱处理可增加微生 物去除能力，其原因可能是碱处理可以除去细胞壁的无定型多糖，改变了葡萄糖和甲 壳素的结构，从而允许更多的 Pb2+ 去除到表面28。同时，NaOH 可溶解细胞壁上一些 不利于去除的杂质，暴露出更多的结合点，使去除量增大.而吴涓29等人在利用 0.1mol/LHCl 溶液处理过的 Phanerochaetechrys

22、osporium 去除 Pb2+过程中发现:平衡时的 去除率比未处理过的下降 41%，其原因还有待于研究。 4.其它因素对重金属离子去除的影响 吴涓24等人通过实验证明: Phaneroohaete chrrysosporium 对 Pb2+ 的去除过程中， 开始反应的一段时间(10min)内其去除率达到 76.83%，而后去除率增长缓慢直到反应 达到平衡。以上研究说明:在微生物去除重金属离子过程中，去除率的大小与时间关系 徐刚：高速公路附近铅耐受菌株的筛选 5 不大，只与去除反应是否达到平衡有关。另外，菌体的不同生长状态对重金属离子的 去除作用也有一定的影响:Yetis22等人曾经用 Pha

23、norochaete chrysosporium 不同状态 (休眠、生长、衰退)的细胞对 Pb2+ 的去除性质进行研究，结果发现:休眠状态的细胞的 去除率最高，而生长状态细胞的去除率最低，这可能是 Pb2+ 对细胞的生理代谢活动有 害，从而降低了 PhanorochaeteChrysosporium 对 Pb2+ 的去除;此外，温度对微生物去 除全属离子有一定的影响。吴涓24等人研究表明:在 Phaneroohaete chrysosporium 去除 Pb2+ 过程中，有一个最适的去除温度范围(25-35)，在这个温度范围内， Phanoroohaete Chrysosporium 对 Pb

24、2+ 的去除率较大。 1.4 研究目的及意义 公路路域土壤的铅污染主要来源于汽车尾气，汽油中添加的四乙基铅在发动机里 燃烧后成为铅化物粒子，以颗粒物的形式排入大气中，可以较长时间悬浮在空气中， 并随风飘落在道路两侧和蔬菜上而造成污染人，最终使人体受到铅的危害。 治理重金属污染的传统方法虽各有优点，但又不同程度地存在着投资大、能耗大、 操作困难、易产生二次污染等不足。以微生物作为吸附材料制备的生物吸附剂处理和 回收废水中的重金属与传统的处理方法相比，具有以下优点：（1）在低浓度下，金属 可以被选择性的去除；（2）节能，处理效率高；（3）操作时的 pH 值和温度条件范围 宽；（4）易于分离回收重金

25、属；（5）吸附剂易再生利用；（6）投资小，运行费用低， 无二次污染。 本文旨在从昆曲高速附近土壤中寻找到对铅具有较强抗性的微生物，并就其生物 学特性进行研究，为获得有效治理重金属污染的微生物菌株提供候选资源，以期为重 金属污染土壤的生态修复提供理论依据。 2 材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 对照菌株 曲靖师范学院资环学院微生物实验室提供。 2.1.2 供试菌株 采用稀释平板法从昆曲高速周边土壤中分离纯化得到重金属铅耐受性菌种。 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院 2012 届本科毕业论文 6 2.1.2 培养基 筛选培养基：蔗糖10 g，(NH4)2SO41 g，K2HPO4 2 g

26、，MgSO47H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，CaCO3 0.5 g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2，琼脂20 g，0.1 MPa下灭菌 20 min。Pb(NO3)2 配成1104mg/L的溶液单独灭菌。倒平板前加入配成不同Pb2+ 浓度 的培养基平板。液体培养基不加琼脂。 分离及保藏培养基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂1520 g，水 1000 mL，pH 7.27.4,0.1 MPa下灭菌20 min。 2.1.3 试剂 草酸铵结晶紫液 2.1.4 仪器 分光光度计 振荡培养箱 立式压力蒸汽灭菌器 恒温光照培养箱 电子分

27、 析天平 摄影生物显微镜等 2.2 实验方法 2.2.1 采样 本实验分离源为昆曲高速的曲靖收费站周围土壤，设置采样点3个。各个采样点 之间应尽量间隔相近的距离，但是也要兼顾到采样点要设在植被生长旺盛的土壤区域 的重要因素。每个采样点取表层的土壤。 采样工具：小铲，75% 乙醇。每采样一次，小铲都要灭菌。 2.2.2 筛选 取各个取样点的10g污染土壤样品，分别加入蒸馏水90mL，28振荡培养30min。 静置，将上清液稀释成分别为10-1，10-2，10-3的浓度梯度，分别涂布于Pb2+浓度分别为 50、100、200 mg/L 的筛选固体培养基平板，土壤悬液的每个稀释度作3 个平行。 28

28、培养2448 h。 2.2.3 纯化 待长出菌落后，在Pb2+浓度高的平板上选择菌株生长旺盛的单菌落，采用划线分 离法挑取接种于分离培养基上进行多次纯化，然后挑取纯化后的单菌落接种于试管斜 面，待长出菌落后，于4冰箱中保存。 徐刚：高速公路附近铅耐受菌株的筛选 7 2.2.4 菌株对 Pb2+的耐受性试验 将筛选菌株，分别接种于依次升高的Pb2+浓度（300800mg/L）的筛选固体培养 基上，每个稀释度作3个平行，确定菌株的最高抗铅浓度。 2.2.5 筛选菌株的镜检实验 在洁净无油腻的玻片中央放一小滴水，用无菌的接种环取少量菌体与水滴充分混 匀，涂成极薄的菌膜，手执玻片一端，有菌膜的一面朝上

29、，通过微火3次进行固定。滴 加草酸铵结晶紫染液，染色1min，用水洗去染色液，自然干燥或用吸水纸盖在涂片部 位以吸去水分，镜检，观察菌体颜色和菌体形态。 2.2.6 生长曲线的测定 挑取单菌落接种到5ml含最高Pb2+浓度700mg/L的液体培养基中，每隔两小时测定 菌悬浮液OD600nm值，绘制细菌生长曲线。 3 实验结果 3.1 涂布分离结果 将采集来的土样制成10%悬液后，通过梯度稀释得到10-1、10-2、10-3三个浓度梯度 的菌悬液，将军悬液按照实验方法所述分别接种到含不同浓度Pb2+的筛选培养基上进行 培养。通过目测法观察筛选培养基中菌落生长情况，所得结果如表1所示：土壤稀释度

30、越大，因所含菌的种类和数量越少，越易形成单菌落；随Pb2+浓度的增高，能生长的菌 越来越少。 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院 2012 届本科毕业论文 8 表1.Pb2+耐受菌初步筛选结果 Table 1.Pb2 + tolerance of bacteria to a preliminary screening results 土壤悬液浓度 原液10-110-210-3 土样 Pb(IV)浓 度 （mg/L） 样 1 50 100 200 300 + + + + + + + + - + - - - - - - 样 2 50 100 200 300 + + + + + + + + + +

31、- - + - - - 样 3 50 100 200 300 + + + + + + + + - - - - - - - - 注：“+”表示11-20个菌落， “+”表示6-10个菌落， “+”表示1-5个菌落， “-”表示无菌落。 3.2 菌株对 Pb2+的耐受性试验结果 将Pb2+浓度为300mg/L的筛选培养基中长出的菌落群采用划线分离法得到单菌落。 将生长最快的一株菌分别接种于Pb2+浓度为300、400、500、600、700、800mg/L的固 体筛选培养基中，培养平板分为A、B、C、D 四区，37恒温培养24-48h，相同培养 时间下四区全部长出菌，且生长菌苔的区域较大界定为生长

32、旺盛，三区皆有菌长出， 为生长良好，两区或一区有菌长出为一般。生长情况如表2所示，菌株对Pb2+的最高耐 受浓度为700mg/L。 表2.Pb2+耐受菌株耐受性实验结果 Table 2.Pb2 + tolerance of the strains tolerated experimental results 徐刚：高速公路附近铅耐受菌株的筛选 9 Pb(IV)浓度/(mg/L)300400500600700800 生长良好 的平板(皿) 样 1+- 注：“+”表示生长旺盛， “+”表示生长良好， “+”表示一般， “-”表示没生 长。 3.3 纯化和镜检结果 将Pb2+耐受度为700mg/L的

33、高耐受菌株接种于分离培养基中37恒温培养24h，观 察其菌落形态，该菌株形成的菌落形态不规则，呈乳白色，表面湿润。通过简单染色 法观察菌体形态，此菌为杆状，大多成链，染色均匀无芽孢（图1） 。 表3.菌落，菌体特征 Table 3. Colony cell characteristics 菌落/菌体 特征 菌落 菌株形态不规则，表面起皱，乳白色，培养基表面潮湿时，菌落易 散。 菌体 杆状，大多成链，染色均匀无芽孢 图1.Pb2+高耐受菌菌体形态 Fig1.Pb2 + high tolerance to the bacteria cell morphology 3.4 Pb2+耐受性菌株生长曲线

34、 挑取Pb2+高耐受性菌单菌落，接种于Pb2+浓度700mg/L的牛肉膏蛋白胨液体培养基 中，培养基体积为每瓶5ml，共接种5瓶，以本实验室所有的枯草杆菌为阴性对照做平 行试验，每隔2h测一次OD600值，所得数据如表4所示。以时间为横坐标，以OD600值为 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院 2012 届本科毕业论文 10 纵坐标绘制菌的生长曲线，培养后4-8小时菌落生长进入平台期。而枯草杆菌在Pb2+浓 度700mg/L培养基中，生长几乎处于停滞状态（图2） ，说明所得菌为Pb2+耐受菌。 表4.Pb2+胁迫下菌株生长OD600值测定 Table 4.Pb2 + Stress under

35、the strains of growth OD600 of determination 菌株4h6h8h10h12h 耐受菌株0.2050.4270.5720.5940.608 枯草杆菌0.0080.0070.0080.0080.007 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 4681012 时间 OD 600值 耐受菌株 枯草杆菌 图2.Pb2+胁迫下菌株生长曲线 Fig 2.Pb2 + stress under strain growth curve 4 讨论与分析 在实验中我们发现，土壤稀释度越高，筛选培养基中越不容易长出菌落;随着 Pb2+ 浓度的升高，筛选培养基

36、中菌落形成量呈现递减的趋势。将 Pb2+ 浓度为 300mg/L 的平 板上所长菌落进一步纯化，测定其最高耐铅浓度，结果发现：当培养基中的 Pb2+ 浓度 增加时，该菌的生物量逐渐减少，其对 Pb2+ 的最大耐受浓度为 700mg/L，当超过最大 耐受浓度时，就不再生长。说明 Pb2+ 对筛选菌具有毒性，对该菌的生长具有抑制作用， 该菌株也具有较好的铅耐受性。 为了进一步了解筛选出来的铅耐受菌株的生长周期，将其单菌落接种于 Pb2+浓度 700mg/L 的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，并以枯草杆菌为阴性对照做平行试验。从表 4 中的数据可以清楚的看到，作为对照组的枯草杆菌的 OD600值基本没有变

37、化，而作为 徐刚：高速公路附近铅耐受菌株的筛选 11 实验组的筛选菌株的 OD600值则出现先快速增大而后又趋于平缓的现象。这表明枯草 杆菌在这样高浓度的 Pb2+ 环境下根本不能生长，足以证明本实验筛选出来的菌株确实 具有铅耐受性，其对 Pb2+ 的最高耐受浓度为 700mg/L。从图 2 中可清楚地看到，8 小 时后，耐受菌株的 OD600值在 0.6 处趋于平稳，10 小时处和 12 小时处的 OD600值相差 无几，说明筛选菌株在 10 小时后即进入稳定期。 5 结论 文章从昆曲高速公路曲靖收费站周围采集土样筛选得到一株耐铅菌株,其对铅的最 高耐受浓度为 700mg/L。观察其菌落形态

38、，该菌株形成的菌落形态不规则，呈乳白色， 表面湿润。通过简单染色法观察菌体形态，此菌为杆状，大多成链，染色均匀无芽孢。 实验结果表明昆曲高速公路周围土壤受到了一定程度的铅污染。土壤资源是我国 最重要的资源之一，我们应加强保护，做好防护治理工作。本实验筛选得到的这株菌 株对铅具有较强的耐受性，或可用于重金属铅污染土壤的生物吸附工作。 6 不足与展望 6.1 不足 由于本实验在学校实验室进行，并非专业的研究实验室，实验条件的限制，导致 本文还有很多不足，还需进一步完善： （1） 本实验全过程由实验人员操作，实验过程可能受人为主观因素影响，实验结 果产生一定偏差。 （2） 采集土样样点较少，采集范围

39、较窄，应扩大采样范围，多设置几个采样点。 （3） 本实验选出的菌株单一，没有筛选出铅耐受性最优菌株。 （4） 针对所筛选出的菌株只做了简单的生理活性探究，应该更深入地进行其他生 理特性的实验，如：菌株生长最适温度，PH值的测定，菌株对于其他重金属 耐受性的测定等。 6.2 展望 生物吸附为Pb2+污染治理提供了新的思路，但它还是一项尚不十分成熟的技术，而 且具有推广价值的生物材料很少。因此应多致力于发现生物量大，所需时间短的新型 曲靖师范学院生物资源与环境科学学院 2012 届本科毕业论文 12 生物吸附材料。此外，生物吸附的材料在大规模的运用上存在着一定的缺陷，可以结 合化学和物理方法弥补生

40、物吸附上的不足，这样有利于短时间内在生产和生活中应用。 参考文献 1张志红,杨文敏.汽油车排出颗粒物的化学组分分析J.中国公共卫生工程,2001,17(7). 2杨国勋.强制性国家标准-车用无铅汽油S.标准宣贯指导.2000. 3Mirjam C,roorda-Kanpe NicoleAH.Traffic related air pollution in citydistricts near motorwayJ.The science of the Total Environment.1999,235.45 4Drake LRand Rayson Gray D PlantDerived Mat

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